1.1 IL RECETTORE GPR17

INTRODUZIONE

1 INTRODUZIONE

1.1 IL RECETTORE GPR17

Il recettore GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G, clonato da Raport e collaboratori (Raport et al, 1996) nel tentativo di identificare nuovi recettori che rispondevano alle chemochine e successivamente “deorfanizzato” (Blasius et al, 1998).

Esso mostra omologia di sequenza con molti recettori già noti quali P2Y4 (37%), CysLT2 (35%), P2Y2 (34%), P2Y1 (33%), P2Y6, P2Y11 e CysLT1 (32%), P2Y12 P2Y14 (28%), P2Y13 (27%): il GPR17 si trova quindi in una posizione filogeticamente intermedia tra i recettori P2Y e CysLT. Il GPR17 è equidistante dal sottogruppo P2Y12,13,14 e dal gruppo CysLT1 e CysLT2 e con essi condivide la via di trasduzione del segnale legata alle proteine Gi/Gq (Pugliese et al., 2008) ovvero l’inibizione dell’adenilato ciclasi con una diminuzione della produzione di cAMP e la stimolzione del rilascio di calcio intracellulare attraverso la fosfolipasi C (Ciana et al., 2006). Questo ci fa pensare che il GPR17 e le classi di recettori ad esso correlate si siano evolute da un antenato comune dal quale poi si siano differenziati, e abbiano acquisito la capacità di rispondere a diverse famiglie strutturali di ligandi.

Figura 1: Relazione filogenetica tra GPR17 e i recettori P2Y e CysLTR

Il GPR17 è costituito da:

• 7 domini transmembrana, (TM1-TM7)

• 8 eliche anfipatiche, (H8)

• Una regione N-terminale extracellulare

• Una regione C-terminale nel citoplasma

• 6 loop a elica (3 intracellulari , 3 extracellulari)

L’allineamento delle sequenze amminoacidiche di ratto, topo e umano hanno mostrato la quasi completa sovrapposizione dei domini transmembrana TM3, TM6 e TM7 e la conservazione di un tipico motivo in TM6 ( H -XX- R), presente in vari recettori associati a proteine G (compresi i recettori P2Y CysLT) e che è ritenuto essenziale per legame con il ligando (Erb et al , 1995 ; Jiang et al , 1997; Jacobson et al , 2002).

Figura 2: struttura del recettore GPR17

Il GPR17 è presente in due isoforme, una corta (GPR17-S) di 339 amminoacidi e una

lunga (GPR17-L) di 367 amminoacidi, con una coda di amminoacidi che si aggiunge alla

parte N-terminale. La forma lunga è stata ritrovata esclusivamente a livello cerebrale,

suggerendo un ruolo specifico nel sistema nervoso (Pugliese et al., 2009).

1.1.1 LIGANDI PER IL RECETTORE GPR17

Il GPR17 è un recettore dualistico, che risponde a due classi di molecole: i ligandi uridinici (UDP, UDP-glucosio) e i cisteinil leucotrieni (LTC

, LTD

, LTE

). In tabella 1 sono riportate le strutture dei ligandi del GPR17 (umano, h, ratto, r, murino, m), la loro attività farmacologica e affinità per il recettore.

È stato inoltre dimostrato che l’attività del GPR17 viene antagonizzata sia da antagonisti per i recettori purinergici, come il cangrelor e l’ MRS2179, sia da antagonisti per i recettori CysLT1 come montelukast e pranlukast (Ciana et al., 2006; Lecca et al., 2008; Daniele et al.,2010). L’ analogo non idrolizzabile dell’ATP (ATPγs), che non possiede attività agonista verso il recettore GPR17 (Ciana et al., 2006) può agire da antagonista bloccando l’attivazione del recettore GPR17 mediata sia da UDP-glucosio che da LTD

(Pugliese et al., 2008).

E’ stato mostrato che il recettore GPR17 è accoppiato a proteine Gi e Gq (Milligan and Kostenis, 2006) e come tale inibisce l’attività dell’adenilato ciclasi e incrementa il Ca

intracellulare in cellule trasfettate con il recettore (Ciana et al., 2006). Attraverso saggi di immunoprecipitazione, svolti allo scopo di identificare i sottotipi di proteine G coinvolte, è stato confermato l’accoppiamento del recettore GPR17 con la proteina G

e in misura minore con la proteina Gq (Pugliese et al., 2008).

A tutt’oggi la farmacologia del recettore è oggetto di controversie: recentemente, un altro gruppo di ricerca (Benned-Jensen e Rosenkilde, 2010) ha confermato che UDP-glucosio, UDP-galattosio e UDP attivano l’isoforma corta del GPR17 umano con valori di EC50 nell’ordine del micromolare, molto vicini a quelli riportati in precedenza (Ciana et al., 2006). Gli stessi autori non hanno riscontrato che il GPR17 venga attivato, internalizzato o legato dai cysLT. In contrasto, Maekawa e collaboratori (Maekawa A, et al., 2009;

Maekawa A et al., 2010) ipotizzano che il GPR17 possa essere associato al recettore CysLT1 e che ne regoli negativamente la funzione.

Tabella 1: strutture dei ligandi del GPR17

1.1.2 DISTRIBUZIONE E RUOLO FISIOPATOLOGICO DEL RECETTORE GPR17

Il recettore GPR17 è principalmente espresso a livello di tessuti che vanno facilmente incontro a danno ischemico, quali cervello, cuore, rene e muscolo scheletrico; mentre lo stesso recettore risulta scarsamente espresso a livello di polmoni e fegato (Ciana et al., 2006). Il gene del GPR17 è uno dei tre geni chiave espressi nei precursori di cellule neuronali adulte (Maisel et al., 2007).

A livello del sistema nervoso, il GPR17 viene altamente espresso nell’ippocampo e nelle cellule ependimali che sono a diretto contatto con le cavità ventricolari, e in cellule precursori degli oligodendrociti disperse sia nella materia grigia che bianca (Lecca et al., 2008). Nessuna collocazione del recettore ritrovata con un marker delle cellule oligodendrogliali mature, sta ad indicare come l’espressione del GPR17 sia limitata esclusivamente agli stati precoci della differenziazione degli oligodendrociti, e si riduca quando queste cellule arrivano a maturazione. Un comportamento analogo del GPR17 è stato riscontrato anche a livello del midollo spinale, in cui questo recettore è espresso dai neuroni e dagli oligodendrociti a diversi stadi di maturazione, dalle cellule ependimali, ma mai dagli astrociti (Ceruti et al., 2009; Chen et al., 2009).

1.1.3 MODELLO DI ISCHEMIA: GPR17 È COINVOLTO SIA NEL DANNO CHE NELLA RIPARAZIONE CEREBRALE

In condizioni fisiologiche, a livello del sistema nervoso centrale, il GPR17 è espresso esclusivamente in neuroni e in un sottogruppo di precursori oligodendrocitari quiescenti.

Nel modello di MCAO (Occlusione dell'Arteria Cerebrale Media), sono stati osservati

profondi cambiamenti nel profilo di espressione spazio-temporale di questo recettore a

partire dal sito ischemico (Ciana et al., 2006; Lecca et al., 2008):

• A 24 ore dall'insulto, nel core della lesione, GPR17 è up-regolato nei neuroni danneggiati che esprimono il marker della stress heat shock protein 70.

L’inibizione in vivo del GPR17 (mediante agenti farmacologici o attraverso l’iniezione intracelebrale di un oligonucleotide antisenso), ha mostrato ridurre il danno ischemico, suggerendo che il GPR17 possa agire da mediatore di morte negli stadi precoci dell'ischemia. Dopo questa prima fase, i segnali generati dai neuroni danneggiati diffondono quindi nelle regioni adiacenti al core ischemico attivando processi riparativi.

• A 48 ore dall’insulto, il recettore GPR17 non è più presente nei neuroni dell’area lesionata, suggerendo che tali cellule siano realmente andate incontro a morte, ma lo si ritrova molto espresso ai confini del core ischemico, in cellule di microglia e macrofagi, che, in condizioni fisiologiche, non esprimono il recettore. Queste cellule si vanno a infiltrare nella zona ischemica, inducendo fagocitosi e rimodellamento del tessuto danneggiato.

• A 72 ore dall’insulto ischemico, si ha un aumento marcato del numero di cellule proliferanti. Due principali tipi di cellule sono state ritrovate nell’area ischemica:

le prime si osservano principalmente ai confini della lesione e sono macrofagi e cellule della microglia attivate; le seconde sono i progenitori oligodendrogliali GPR17

che proliferano nell'area che circonda il core della lesione, facendo supporre un inizio di re-mielinizzazione (Lecca et al., 2008). Quindi dopo le prime fasi di ischemia, i segnali generati dai neuroni danneggiati diffondono nelle regioni adiacenti al core ischemico, innescando i processi riparativi (Ciana et al., 2006).

1.1.4 LESIONI TRAUMATICHE AL MIDOLLO SPINALE (SCI)

Studi recenti (Ceruti et al., 2008) hanno mostrato che l’induzione di una lesione al midollo

spinale per compressione acuta porta ad un’attivazione abnorme di GPR17 attivando vie di

morte cellulare per neuroni e oligodendrociti; analogamente a quanto succede dopo danno

ischemico, a questo fa seguito la proliferazione, migrazione e infiltrazione di macrofagi che agiscono da “spazzini”, ripulendo la zona lesionata e favorendo in questo modo la riparazione. 72 ore dopo l’insulto, le cellule ependimali GPR17

iniziano a proliferare ed esprimere la proteina gliofibrillare acida (GFAP), evidenziando un tentativo di avvio di un processo ripartivo che però rimane solo parziale e, nella maggior parte dei casi, non risolutivo (Ceruti et al., 2009).

Il silenziamento in vivo del GPR17 con un oligonucleotide antisenso, inoltre, ha dimostrato ridurre notevolmente i danni indotti durante SCI, confermando così il ruolo cruciale svolto da questo recettore nelle prime fasi dello sviluppo di danni ai tessuti.

GPR17 risulta quindi un “sensore”, attivato durante l’insulto cellulare, che provoca morte all’interno della lesione e, in un secondo momento, rimodellamento locale, ricostruzione e ripresa della funzione tissutale.

I cambiamenti di espressione spazio-temporale mostrati dal recettore potrebbero avere un’influenza importante nello sviluppo di nuovi approcci farmacologici: antagonisti selettivi per GPR17 potrebbero rallentare, nella fase acuta del danno, l’evoluzione della lesione, mentre agonisti selettivi potrebbero agire come “rimodellatori tissutali” nelle fasi successive al danno.

1.1.5 RUOLO DEL GPR17 NELLO SVILUPPO DI PRECURSORI DEGLI OLIGODENDROCITI

A livello del sistema nervoso, il recettore GPR17 è espresso sia nei neuroni che in un

sottogruppo di cellule progenitrici degli oligodendrociti parenchimali quiescenti, dispersi

nella materia grigia e nella materia bianca. Gli oligodendrociti sono le cellule produttrici di

mielina del SNC e, come dimostrato da Lecca e collaboratori (Lecca et al., 2008), sono gli

unici sottotipi gliali ad esprimere costitutivamente il recettore GPR17 sia in vivo che in coltura primaria. È stata, inoltre, evidenziata la presenza di precursori immaturi di cellule GPR17

nel corpo striato, all’interno di tratti mielinici contenenti cellule immature positive al fattore di regolazione dello sviluppo di oligodendrociti, Oligo 2

. Queste cellule GPR17

risulterebbero quindi una risorsa di pre-oligodendrociti in grado di dare origine, quando necessario, a cellule mature.

Come schematizzato nella Figura 3 , i precursori degli oligodendrociti mostrano una tipica morfologia bipolare, e non risultano positivi alla proteina GPR17 (benché sia presente il suo mRNA). L’espressione del recettore aumenta progressivamente durante lo sviluppo dei precursori a oligodendrociti, fino a toccare un massimo quando viene raggiunta la fase di pre-oligodendrociti immaturi (circa 6 giorni di differenziamento in vitro). Gli oligodendrociti maturi sono caratterizzati da una morfologia più complessa e da alcuni processi di ramificazione emergenti dal corpo cellulare; a questo stadio di completa maturazione e differenziamento, l’espressione del GPR17 è praticamente nulla. (Fumagalli et al., 2011).

Figura 3: Schema dell’espressione del recettore GPR17 in funzione della differenziazione dalle cellule precursori degli oligodendrociti a oligodendrociti maturi

La presenza del recettore durante la maturazione degli OPC sembra dover rientrare in una

finestra temporale precisa: la sua forzata espressione a livello dei pre-oligodendrociti

comporta una diminuzione dei processi di maturazione e mielinizzazione, mentre il silenziamento del gene che esprime la proteina favorisce la maturazione degli OPC a cellule mielinizzanti. Una up-regulation del GPR17 è stata inoltre riscontrata a livello di lesioni demielinizzanti (Chen et al., 2009), avvalorando l’ipotesi di un coinvolgimento del recettore nella regolazione del processo di mielinizzazione, sia in condizioni fisiologiche che patologiche.

È stato quindi supposto che, attraverso il legame con GPR17, i ligandi endogeni potrebbero promuovere la desensitizzazione del recettore con successiva internalizzazione e degradazione, e che questo evento potrebbe contribuire alla perdita della attività fisiologica di GPR17 durante la maturazione degli OPC. Queste cellule GPR17

possono quindi rappresentare una risorsa di pre-oligodendrociti in grado di trasformarsi in cellule mielinizzanti, quando è necessario, oppure possono giocare un ruolo nel controllo trofico locale della mielinizzazione (Lecca et al., 2008). La mielinizzazione è un processo essenziale per il normale funzionamento del sistema nervoso centrale (cervello e midollo spinale); una sua alterazione porta a una degenerazione assonica e a una disabilità neurologica associata a malattie acquisite o ereditarie come la sclerosi multipla, definita anche sclerosi a placche (Pfeiffer et al., 1993).

La sclerosi multipla (SM) è una malattia cronica demielinizzante che colpisce il SNC in più aree (da cui “multipla”). La perdita della mielina, che riveste parte del corpo dei neuroni, determina un’alterazione nella trasmissione degli impulsi nervosi, bloccandoli o rallentandoli, portando così alla formazione di zone lesionate, che prendono il nome di placche.

Figura 4: demielinizzazione delle fibre nervose

In tali condizioni patologiche i precursori degli oligodendrociti sono presenti nelle lesioni, ma non riescono a differenziarsi a oligodendrociti maturi, poiché la fase di re- mielinizzazione è bloccata (Pfeiffer et al., 1993). In condizioni d’insulto ischemico si è anche osservato che i precursori oligodendrociti GPR17

quiescenti, attivati dai mediatori infiammatori rilasciati nella lesione, iniziano a proliferare nel parenchima dell’area danneggiata, evidenziando che tale recettore può contribuire alla riparazione intrinseca nella rigenerazione post-ischemica (Lecca et al., 2008), e che, la differenziazione dei precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti maturi potrebbe ripopolare la zona lesa e favorire il rimodellamento tissutale.

1.2 MECCANISMI MOLECOLARI CHE REGOLANO LE RISPOSTE DEI RECETTORI ACCOPPIATI A

PROTEINE G

In condizioni fisiologiche, la moltitudine di effetti conseguenti l’attivazione di un recettore di membrana ha generalmente un andamento rapido, poiché una stimolazione prolungata del recettore innesca fenomeni di reuptake e degradazione enzimatica dell’agonista.

Accanto a questi meccanismi, ne esistono altri, come la desensitizzazione recettoriale,

l’internalizzazione e la down-regulation, che controllano nel tempo la risposta dei recettori

accoppiati a proteine G.

1.2.1 DESENSITIZZAZIONE RECETTORIALE

I recettori accoppiati a proteine G vanno incontro a desensitizzazione, ovvero alla perdita progressiva della funzionalità recettoriale in seguito a stimolazione prolungata del recettore.

La desensitizzazione può essere:



Omologa: quando la perdita di attività dell'agonista è specifica per il recettore attivato.



Eterologa: se l'attivazione prolungata di un sistema recettoriale può indurre la desensitizzazione di un altro sistema recettoriale presente sulla stessa membrana, che utilizza lo stesso meccanismo di attivazione del segnale o gli stessi effettori del primo sistema recettoriale.

I meccanismi responsabili del processo di desensitizzazione prevedono, in genere, fenomeni di fosforilazione del recettore su residui amminoacidici di serina e treonina e l’internalizzazione del complesso recettore-ligando.

Il processo di fosforilazione può avvenire in due modi:

• Fosforilazione a livello della terza ansa citoplasmatica mediata da protein-chinasi A e C (PKA e PKC), in precedenza attivate dai secondi messaggeri quali cAMP e calcio, e il conseguente disaccoppiamento tra recettore e proteina G. Il recettore desensitizzato viene quindi internalizzato e può essere degradato da enzimi lisosomiali oppure può essere riciclato sulla membrana (risensitizzazione). Si tratta di un esempio di desensitizzazione eterologa, poiché un qualsiasi altro sistema recettoriale in grado di stimolare gli stessi secondi messaggeri ha la potenzialità di indurre desensitizzazione del recettore.

• Fosforilazione su specifici residui di serina e treonina a livello intracellulare da parte di chinasi specifiche dei recettori accoppiati a proteine G (le GRK).

L’interazione agonista-recettore determina la dissociazione della proteina G trimerica, mentre il dimero βγ funziona da ancoraggio per le GRK, le quali, una volta legatesi ad esso, fosforilano il recettore su residui specifici, determinando un aumento di affinità del recettore stesso verso la proteina citoplasmatica β-arrestina.

Quest’ultima, una volta traslocata sulla membrana, determina il distacco del

recettore dalla proteina G. A questo punto il recettore può essere internalizzato in endosomi, attraverso vescicole rivestite di clatrina, e può seguire due destini: essere degradato da enzimi lisosomiali (down-regulation), oppure può essere riciclato sulla membrana. In quest’ultimo caso le pompe ATP-dipendenti, che mantengono costante il pH degli endosomi, vanno a de-fosforilare il recettore e lo distaccano dalla β-arrestina, consentendone così il riciclo su membrana (Figura 5) (Shukla et al., 2011)

Figura 5: desensitizzazione, internalizzazione e degradazione di un

recettore accoppiato a proteine G

1.2.2 RUOLO DELLE β-ARRESTINE NELLA TERMINAZIONE E NELLA TRASDUZIONE DEL SEGNALE DEI RECETTORI

ACCOPPIATI A PROTEINE G

Le β–arrestine sono proteine adattatrici capaci di formare complessi con la maggior parte

dei GPCR a seguito del legame dell’agonista e della fosforilazione del recettore da parte

delle GRK. Le β–arrestine giocano un ruolo chiave nei processi di desensitizzazione

omologa e sequestro dei GPCR, che portano alla terminazione dell’attivazione delle

proteine G (Luttrell e Lefkowitz, 2002).

Il legame della β–arrestina, in genere all’estremità citoplasmatica del recettore, scaturisce due eventi principali:

• occlusione del sito di legame per la proteina G e disaccoppiamento della proteina G eterotrimerica dal recettore;

• legame tra recettore, clatrina e adattatore della clatrina AP-2 e successivo direzionamento del recettore verso vescicole endocitotiche.

Oakley e collaboratori (Oakley et al., 2000) hanno recentemente mostrato come i GPCR esibiscano differenti meccanismi di interazione con le β–arrestine, suddividendosi in due classi:

• classe A (come ad esempio recettori β

(Shenoy et al., 2005) e α

adrenergici, μ oppioide (Johnson et al., 2006), A dell’endotelina e D

dopaminergico) : il recettore interagisce con le arrestine in maniera transiente, per cui, dopo l’internalizzazione del recettore e il suo sequestro in vescicole di clatrina, la β–

arrestina si dissocia e il recettore ricicla sulla membrana plasmatica. Questi recettori si legano, generalmente, alla β–arrestina 2 con affinità più alta rispetto alla β–arrestina 1 e non si legano alle arrestine visive.

• classe B (come ad esempio recettori AT

dell’angiotensina (Wei et al., 2004), I della neurotensina, 2 della vasopressina (Ren et al., 2005), NK-1 della neurochinina e recettore dell’ormone tireotropina-rilasciante) : questi recettori formano complessi stabili con le β–arrestine, si legano con uguale affinità alle β–arrestine 1 e 2 ed interagiscono anche con le arrestine visive.

La stabilità dei complessi β–arrestina/recettore influenza quindi anche il destino del

recettore internalizzato: infatti, la formazione di complessi transienti favorisce la rapida

defosforilazione e il ritorno su membrana del recettore, mentre complessi stabili ritardano

la re-sensitizzazione e favoriscono il direzionamento del recettore verso la degradazione.

1.3 DESENSITIZZAZIONE DEL RECETTORE GPR17

Studi recenti (Daniele et al., 2011) hanno dimostrato che la desensitizzazione omologa del recettore GPR17 in cellule 1321N1 avviene in modo tempo e concentrazione dipendente con cinetiche paragonabili per le due classi di agonisti leucotrienici e purinergici. A seguito di induzione di desensitizzazione e wash-out delle cellule, la risposta recettoriale viene recuperata con cinetiche tipiche di un GPCR (re-sensitizzazione); infine, dopo stimolazione con entrambi gli agonisti, il recettore va incontro a internalizzazione in modo tempo-dipendente. Tuttavia, sembrerebbe che, nel caso di trattamento con UDP-glucosio, la re-sensitizzazione sia più lenta e la percentuale di recettori internalizzati maggiore rispetto al trattamento con LTD

. Il minor grado di internalizzazione indotto da LTD

determinerebbe un più rapido riciclo di GPR17 sulla membrana plasmatica e quindi un più veloce recupero della sua funzione.

Studi recenti hanno dimostrato che il sistema GRK/β-arrestina è coinvolto nella desensitizzazione di GPR17. In particolare, le due classi di ligandi si comportano come

“bias ” agonisti attivando il reclutamento di diverse GRK e innescando vie di segnale distinte.

La desensitizzazione del recettore innescata da LTD

coinvolge maggiormente la chinasi GRK2 e attraverso un meccanismo G-proteina mediato induce un legame transiente del recettore alla β-arrestina, un'attivazione transiente delle chinasi ERK e l'attivazione del fattore trascrizionale CREB.

UDP-glucosio, viceversa, innesca il reclutamento della GRK5 nel mediare la

desensitizzazione del sito purinergico e, attraverso un meccanismo G-proteina

indipendente, favorisce un legame stabile alla β-arrestina. Questo determina un'attivazione

più prolungata delle ERK e la modesta attivazione delle CREB.

1.4 SCOPO DELLA TESI

Fino ad ora la tecnica maggiormente usata per lo studio dell'interazione proteina-proteina è quella della co-immunoprecipitazione (co-IP) e il western blot. In tale metodica si precipita una proteina mediante un anticorpo specifico e si va a ricercare la presenza di una seconda proteina nell'immunoprecipitato tramite immunomarcatura. Tale metodica, oltre ad essere abbastanza lunga e costosa, dà un'indicazione solamente qualitativa o semiquantitativa dell'interazione tra due proteine. Da qui lo scopo di questa tesi, è stato quello di sviluppare un saggio immunoenzimatico per quantizzare in maniera sensibile e rapida l'interazione proteina-proteina. Sulla base di attuali ricerche, svolte presso i laboratori di biochimica di questo dipartimento, incentrate sullo studio dei meccanismi di regolazione del recettore GPR17, abbiamo messo a punto tale metodo studiando le interazioni tra questa proteina recettoriale taggata con HA-Tag (human influenza hemagglutinin) e trasfettate in cellule di astrocitoma umano (1321N1), e le proteine intracellulari di regolazione del segnale.

In particolar modo abbiamo valutato:

1. la fosforilazione del GPR17

2. associazione del GPR17 alla GRK2 e GRK5

3. associazione del GPR17 alla β-arrestina

MATERIALI E METODI

2 MATERIALI E METODI

2.1 CULTURE CELLULARI

La linea cellulare utilizzata in questa sperimentazione è una linea di cellule di astrocitoma umano (1321N1) trasfettata con il recettore GPR17 umano taggato con l'epitopo HA-Tag (HA-Tag GPR 17).

Le cellule vengono seminate in fiasche da 75 cm

(10

cellule) e mantenute in incubazione a 37°C in un’atmosfera umidificata al 95% contenente il 5% di CO

. Il terreno di coltura è il "Dulbecco's modified eagle" medium, DMEM-F12, contenente 10% FBS, penicillina (200 U/mL), streptomicina (200 μg/mL) e L-glutammina (2 mM).

2.2 LISATO CELLULARE

Le cellule 1321N1 HA-Tag vengono trattate o con il solo terreno di coltura o con i ligandi del recettore GPR17 UDP-glucosio (100 µM) o LTD

(100 nM) a tempi diversi. Al termine dei trattamenti, si aspira il mezzo e si lavano le cellule con 5 mL di PBS (NaH

PO

9.1 mM, Na

HPO

1.7 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4). Le cellule vengono quindi staccate dalla piastra meccanicamente con uno scraper, raccolte in falcoon e centrifugate a 1200 giri per 5 minuti. I pellets ottenuti vengono sospesi in RIPA contenente inibitori delle proteasi (RIPA: Na-deossicolato 0.5%, IGEPAL 1%, SDS 0.1%, pH 7.4 – inibitori delle proteasi:

PMSF 0.6 mM, Aprotinina 0.6 μM, Ortovanadato 1 mM). I lisati ottenuti vengono raccolti in eppendorf, messi in agitazione per 1 ora a una temperatura di 4°C e infine centrifugati a 13500 giri per 45 minuti a 4°C. Viene quindi raccolto il sovranatante, che costituisce il lisato, e si esegue il dosaggio proteico.

2.3 DOSAGGIO PROTEICO BIO-RAD

La quantificazione delle proteine totali nel lisato cellulare è stata effettuata con il metodo Bio-rad. Il colorante acido, comassie brillant blue, si lega alla proteina, in particolare ai residui basici e aromatici (soprattutto Arginina e Lisina) e sviluppa una colorazione blu che ha un picco di assorbanza a 595 nm.

Il saggio viene allestito nel seguente modo:

Bianco: 795 μL di H

O + 5 μL di tampone ( utilizzato per sospendere il campione) + 200 μL di biorad concentrato

Campione: 795 μL di H

O + 5 μL di campione + 200 μL di biorad concentrato

In seguito si leggono i campioni a 595 nm e dal valore di assorbanza ottenuti dalla lettura si risale alla concentrazione delle proteine in 5 μL di campione

Ciò è possibile utilizzando il coefficiente della retta di taratura, ottenuta facendo reagire una soluzione di BSA e concentrazioni note crescenti (corrispondenti a 2,5-5-10-15-20 μg di proteina in prova) con bio-rad.

La retta di taratura ottenuta è mostrata in figura 1:

Y=0.05954X

Figura 1: Retta di taratura del dosaggio proteico

2.4 KIT ELISA

Il saggio ELISA, acronimo inglese per Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (Saggio Immuno-Assorbente legato ad un Enzima), è un metodo di analisi immunologica, alternativo al western blot, utile per rilevare la presenza di una sostanza attraverso l’impiego di un anticorpo primario ed un anticorpo secondario coniugato ad un enzima che catalizza una reazione il cui prodotto è visibile.

Il saggio ELISA, utilizzato in questo lavoro di tesi, è un saggio di tipo diretto “a sandwich”

Anticorpo secondario

A Anticorpo anti-X

Proteina X

Proteina GPR17

Anticorpo anti-HATag

Piastra

Figura 2: metodo ELISA diretto “a sandwich”

Le fasi in cui si articola il saggio sono le seguenti:

• in un multiwell da 96 viene aggiunto l'anticorpo anti-HATag diluito 1:500 in poliornitina 1x (0,5 g/mL) solubilizzata in PBS (NaH

PO

9.1 mM, Na

HPO

1.7 mM e NaCl 150 mM pH 7.4) e lasciato overnight a temperatura ambiente

• i pozzetti vengono poi lavati 3 volte per 5 minuti con 100 µL di PBS Tween 0,01%

(PBS + Tween 20 0,01%)

• 100 µL di lisato (8 µg-10 µg di proteine, portando a volume con Lysis Buffer → 20 mM Tris Hcl pH 8, 137 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% NONIDEP-P40, 2 mM EDTA) vengono incubati per 2 ore mantenendo un movimento costante che permetta il legame della proteina recettoriale GPR17 HA-Tag all'anticorpo primario adeso sulla piastra

• le piastre vengono quindi lavate per tre volte con 100 μL di PBS contenente Tween e successivamente vengono aggiunti 100µL di BSA 1% per 15 minuti allo scopo di bloccare i siti aspecifici

• i campioni vengono poi incubati 2 ore con un anticorpo I diretto contro la proteina di interesse (diluito 1:400 in milk [TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8);

Milk 5%; Tween-20 0.05%] ) supposta legare la proteina GPR17

• trascorso il tempo, vengono effettuati due lavaggi con PBS Tween 0,01% e vengono messi 100 μL di anticorpo II diretto contro questo anticorpo I. L'anticorpo II è collegato ad un enzima capace di catalizzare una reazione, il cui prodotto sia rilevabile. In genere viene utilizzato come enzima la perossidasi di rafano, che catalizza la reazione:

H

O

+ substrato ridotto → 2 H

O + substrato ossidato

• dopo un'ora di incubazione si effettuano 2 lavaggi da 5 minuti con 100 μL di PBS + Tween 0,01% , seguiti da 2 lavaggi rapidi in PBS

• si aggiunge quindi il substrato TMB (3,3',5, 5' Tetrametilbenzidina) che, a contatto con l'enzima, cambia visibilmente colore. Avvenuto il viraggio di colore si blocca la reazione con una Stop Solution ( acido solforico diluito 1:9,21 in acqua) e si legge l'assorbanza alla lunghezza d'onda di 450 nm.

 I bianchi sono stati ottenuti escludendo l'anticorpo I (coating + lisato + BSA 1% + milk + AbII + TMB + stop solution)

 Allo scopo di valutare questo metodo sperimentale, sono stati fatti dei controlli negativi utilizzando la linea cellulare U87MG che non esprime HA-Tag GPR17

 La relazione proteina dipendenza del saggio è stata rilevata aggiungendo quantità crescenti di lisati cellulari, contenenti una quantità totale di proteine da 5 μg a 250 μg. In questo caso, i pozzetti sono stati rivestiti con l'anticorpo anti-HATag, e il recettore è stato marcato utilizzando un secondo anticorpo policlonale anti-GPR17.

Come mostrato in figura 3, i valori di assorbanza a 450 nm aumentano proporzionalmente con l'aumentare della concentrazione proteica dei lisati cellulari di GPR17, con una tendenza di saturazione a partire da 100 μg di lisato cellulare.

L'assorbanza a 450 nm dei pozzetti vuoti, ottenuti in assenza di anticorpo anti- HATag, è rimasta sempre sotto il 20% del valore totale.

Figura 3: Diverse quantità di lisati cellulari (0-250 μg), sono stati incubati nei pozzetti pre- absorbiti con l'anticorpo anti-HA Tag. Dopo ripetuti lavaggi, i livelli del GPR17 sono stati quantificati usando un anticorpo specifico per il GPR17, e successivamente un anticorpo secondario HRP-coniugato. Il controllo è stato effettuato in assenza di anticorpi GPR17. I dati sono espressi come assorbanza a 450 nm e rappresentano la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

0 50 100 150 200 250 300

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

µg cell lysate

Abs 450 nm

In questa tesi, il saggio ELISA è stato utilizzato per indagare:

1. la fosforilazione del GPR17 2. la sua associazione con le GRK

3. la sua associazione con la β-arrestina 1

Il saggio viene effettuato trattando le cellule HA Tag-GPR17 con il mezzo da solo (basale) o con 100 μM UDP-glucosio o 100 nM LTD

per diversi tempi (5 min e 30 min);

successivamente i lisati (8 µg-10 µg di proteine totali) sono stati incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato precedentemente absorbito l'anticorpo anti-HATag. Dopo 2 ore (tempo necessario affinchè il GPR17 si leghi all'anticorpo anti-HATag), i lisati vengono incubati con un anticorpo I specifico diretto contro la proteina di interesse supposta interagire con il recettore: in particolare per valutare la fosforilazione del recettore sono stati utilizzati anticorpi anti-fosfoserina e anti-fosfotreonina; per l'associazione alle chinasi GRK, anticorpi anti-GRK2 e anti-GRK5; mentre per l'associazione alla β-arrestina, anticorpi anti-βarrestina1.

Tutti i risultati ottenuti con il saggio ELISA, sono stati poi validati attraverso il Western Blot.

2.5 DOSAGGIO PROTEICO A+B ( DI FOLIN)

La quantificazione delle proteine totali presenti nei lisati di cellule 1321N1 hGPR17,

destinate al western blot, è stata effettuata tramite il saggio colorimetrico di Folin, che

sfrutta la reazione delle proteine con tartrato di rame e reagente di Folin in soluzione

alcalina. In questa reazione, la proteina (in particolare gli aminoacidi tirosina e triptofano)

riduce il rame da Cu

a Cu

e il rame Cu

riduce a sua volta il reagente di Folin. La

riduzione del reagente determina la perdita di 1, 2 o 3 atomi di ossigeno, sviluppando una

caratteristica colorazione celeste-blu con un picco di assorbanza a 750 nm. In questi

esperimenti viene usato il Kit Bio-Rad, costituito da REAGENTE A (soluzione alcalina di

tartrato di rame) e REAGENTE B (reagente di Folin diluito).

La preparazione del dosaggio proteico avviene attraverso la seguente tabella:

RIPA CAMPIONE REAGENTE A REAGENTE B

Bianco 20 μL ▬ 100 μL 800 μL

Bianco' 20 μL ▬ 100 μL 800 μL

Campione 16 μL 4 μL 100 μL 800 μL

Campione' 16 μL 4 μL 100 μL 800 μL

Tabella 1: allestimento del dosaggio proteico A+B (di Folin)

I campioni vengono lasciati in incubazione per 30 minuti ed in seguito si legge l’assorbanza a 750 nm allo spettrofotometro. Dai valori di assorbanza ottenuti, utilizzando il coefficiente della retta di taratura del saggio, possiamo risalire alla concentrazione di proteine presenti nei 4 μL di campione utilizzati.

La retta di taratura si costruisce allestendo il saggio con quantità crescenti di BSA (albumina bovina) a concentrazioni note.

La retta di taratura ottenuta è mostrata in figura 4:

Figura 4: Retta di taratura

del dosaggio proteico A+B

2.6 IMMUNOPRECIPITATO

Al lisato contenente 1 mg/mL di proteine, viene aggiunto un anticorpo diretto contro l'epitopo HA-Tag capace di legare in maniera selettiva il GPR17 taggato (nel nostro caso un anticorpo anti-GPR17). I lisati vengono lasciati in ruota tutta la notte a 4°C e in seguito vengono aggiunti 80 μL di proteina A Sepharose in ogni eppendorf per precipitare il complesso antigene-anticorpo; i campioni ottenuti vengono lasciati in agitazione per 2 ore a 4°C; in seguito si centrifuga a 13000 giri per 1 minuto a 4°C, si aspira il sovranatante e si lavano i pellet con RIPA + inibitori delle proteasi. A questo punto si aggiungono 20 μL di soluzione Laemmli (Tris HCl 1 M pH 6.7-7.4, SDS 20%, β-mercapto etanolo, glicerolo, H2O, blu di bromofenolo) con DTT 200 mM in ogni campione; questi vengono bolliti a 100°C per 5 minuti, promuovendo così la denaturazione delle proteine e il distacco della proteina A Sepharose dal complesso anticorpo-recettore. Infine i campioni vengono separati mediante elettroforesi.

2.7 WESTERN BLOT

Il metodo “western blot” è utilizzato per identificare una specifica proteina separata

mediante elettroforesi in SDS (sodio dodecil solfato) tramite l'uso di un anticorpo

specifico. L'SDS agisce legandosi alle proteine, provocandone la denaturazione, infatti si

perde la struttura secondaria e terziaria della proteina a causa della rottura dei legami a

idrogeno e dei ponti disolfuro presenti nel campione. Questa denaturazione è

indispensabile per separare tra loro i complessi proteina-SDS in funzione della sola massa,

annullando le cariche degli aminoacidi, che influirebbero sulla migrazione; la corsa

elettroforetica, infatti, è caratterizzata dall'applicazione di un campo elettrico che fa si che i

complessi proteina-SDS ottenuti, essendo caricati negativamente, migrino verso il polo

positivo in base al loro peso molecolare ( la velocità di migrazione è infatti inversamente

proporzionale al Log

del loro peso molecolare).

Figura 5:

Apparecchiatura per il western blot

I gel utilizzati sono due:

Stacking gel: utilizzato per il caricamento dei campioni nei pozzetti Running gel: grazie al quale avviene la corsa elettroforetica.

Preparazione dei Gel:

STACKING GEL RUNNING GEL

Acrilammide 5 mL 2.5 mL

H

O 9.9 mL 6.10 mL

BUFFER pH 8.8

(Tris 1.5 M, SDS 0.4%, pH 8.8) 5 mL ▬

BUFFER pH 6.8

(Tris 0.5 M, SDS 0.4%, pH 8.6) ▬ 2.5 mL

TEMED 10 μL 10 μL

APS 100 μL 100 μL

Tabella 2: Preparazione dei gel utilizzati nel western blot

Le due miscele vengono agitate e degassate per circa 15 minuti per evitare che l’ossigeno atmosferico formi radicali e impedisca l’innesco del processo di polimerizzazione del gel.

Solo al momento dell’uso vengono aggiunti APS (Ammoniopersolfato 10%) e TEMED (Tetrametil-etilen-diammina): l'APS è un agente ossidante, impiegato come fonte di radicali liberi, per iniziare la polimerizzazione dell’acrilamide e il TEMED, una volta attivato da APS, funziona da catalizzatore e rende reattiva l’acrilamide, inducendo una polimerizzazione radicalica.

A questo punto con l’aiuto di una pipetta viene caricato il Running gel, facendo attenzione a non formare bolle d’aria e una volta polimerizzato il gel, cioè a solidificazione avvenuta, si carica lo Stacking gel nel quale viene inserito un pettine che permette di formare i pozzetti su cui poi verranno caricati i campioni costituiti da immunoprecipitati o lisati di GPR17, sospesi in Laemmli (Tris HCl 1 M pH 6.7-7.4, SDS 20%, β-mercapto etanolo, glicerolo, H2O, blu di bromofenolo) contenente DTT 200 mM. A questo punto si può dare inizio alla corsa elettroforetica a 17 mA per circa 90 minuti.

A fine corsa, si procede con il trasferimento delle proteine dal gel alla membrana di polivinilidenfluoruro (PVDF) precedentemente attivata in metanolo: dopo aver smontato i vetrini dalla corsa elettroforetica, si stacca il gel prestando attenzione a eliminare la parte del Upper gel e si costruisce il “Sandwich” (Figura 6).

I due sandwich sono formati ciascuno da:

• Polo positivo (lastra bucata bianca) +

• Spugna

• Carta

• PVDF

• Gel

• Carta

• Spugna

• Polo negativo (lastra bucata nera) –

Figura 6:

composizione del “sandwich”

I due “sandwich” vengono poi inseriti nella camera di trasferimento, riempita con il tampone di Transfert freddo (glicina 0.19 M, Tris 25 mM, SDS 3.5 mM, MeOH 200 mL, H

O mQ q.b. a 1L) a voltaggio costante di 120 V per 45 minuti, provocando così la migrazione delle proteine dal gel al foglio di PVDF; il tutto viene messo in ghiaccio per mantenere bassa la temperatura.

Terminato il trasferimento, si apre il sandwich e la membrana di PVDF viene immersa completamente in Milk [TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 8); Milk 5%; Tween- 20 0.05%], mantenendola in agitazione sul basculante per almeno 1 ora a temperatura ambiente ( il milk ha l'importante funzione di bloccare tutti i siti di legame aspecifici presenti sul foglio di PVDF).

Il blot viene poi incubato con un anticorpo primario diretto contro la proteina di interesse e

tenuto in agitazione a 4°C per tutta la notte; la mattina seguente il PVDF viene lavato per

tre volte con TBS-Tween-20 (Tris-HCl 10 mM; NaCl 150 mM, pH 8; Tween-20 0.05%) e

poi incubato a temperatura ambiente con l’anticorpo secondario diluito in milk. Al termine

di due ore di incubazione vengono fatti altri tre lavaggi da 5-10 minuti con TBS-Tween e

un lavaggio da 5-10 minuti con TBS.

A questo punto si recupera il foglio di PVDF con una pinzetta, lasciandolo sgocciolare su carta assorbente e si ripone in una vaschetta dove viene aggiunto un luminescente E.C.L per 1 minuto; si asciuga il foglio e si posiziona tra due pellicole trasparenti, per poi trasferirlo nella cassetta di sviluppo a contatto con la lastra fotografica. L’anticorpo secondario, che riconosce l’anticorpo primario precedentemente legato, è marcato con la perossidasi di rafano, che in presenza di perossido di idrogeno ossida il luminolo, dando luogo al fenomeno della chemioluminescenza, in grado di impressionare una lastra fotografica esposta al PVDF.

Per finire si sviluppa la lastra per passaggio nel developer, acqua e fixer.

2.8 ANALISI DEI DATI

Per l’analisi dei dati e le presentazioni grafiche è stato utilizzato il programma Graph-Pad Prism (Graph-Pad). La densità ottica delle bande immunoreattive ottenute da analisi SDS- PAGE/western blot è stata misurata utilizzando il programma Image J.

Tutti i dati sono presentati come valore medio di almeno tre esperimenti ± deviazione standard.

La significatività statistica dei dati messi a confronto è stata ottenuta mediante Student t-

testi. Un valore di P <0.05 è stato considerato significativo.

RISULTATI E DISCUSSIONE

3 RISULTATI E DISCUSSIONE

Il recettore GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G e attivato da ligandi uridinici (UDP-glucosio) e cisteinil leucotrienici (LTD

) con affinità, rispettivamente, nell’ordine del micromolare e nanomolare. Studi svolti in precedenza hanno evidenziato una sua ampia distribuzione nell’organismo, in particolar modo a livello centrale, in un sottoinsieme di cellule precursori degli oligodendtrociti (OPC), presenti sia nella materia grigia che bianca del parenchima cerebrale (Lecca et al., 2008). In particolare, l'espressione del GPR17 aumenta durante il differenziamento degli OPC a pre-oligodendrociti, e si riduce successivamente durante la transizione a cellule mature, producenti mielina (Fumagalli et al. 2011). A stadi avanzati di differenziamento sembra essere necessaria una drastica diminuzione dell’espressione del recettore GPR17 affinchè le cellule possano completare la maturazione. Sulla base di questi dati è stato presupposto che, affinchè si completi la maturazione dei pre-oligodendrociti, questo GPCR debba andare incontro a fenomeni di desensitizzazione, internalizzazione e down-regulation. A tal proposito, in cellule di astrocitoma (1321N1) trasfettate con il GPR17 umano, è stato dimostrato che, dopo stimolazione con agonisti purinergici e leucotrienici, il recettore va incontro a desensitizzazione e internalizzazione in maniera tempo e concentrazione dipendente.

Il processo di desensitizzazione di un GPCR, avviene in genere mediante fosforilazione del recettore su residui di serina e treonina ad opera di specifiche chinasi, le GRK. Ciò aumenta l'affinità del recettore verso la proteina citoplasmatica β-arrestina, la quale ne promuove il distacco dalla proteina G e la sua internalizzazione in endosomi. In studi precedenti è stato dimostrato che la chinasi GRK2 è implicata nei processi di fosforilazione e desensitizzazione del recettore GPR17 indotti dagli agonisti leucotrienici (LTD

) e uridinici (UDP-glucosio) mentre la GRK5 sembra coinvolta nella regolazione della risposta funzionale del sito purinergico del recettore.

Oltre alla GRK2, anche l’isoforma GRK5, secondo quanto riportato in letteratura, sembra svolgere un ruolo critico nelle funzioni del SNC, soprattutto in patologie di tipo infiammatorio. L'obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di mettere appunto un kit ELISA immunoenzimatico rapido, sensibile, efficiente e a ridotto costo per studiare:

• la fosforilazione del GPR17

• l'associazione del GPR17 alle chinasi GRK2 e GRK5

• l'associazione del GPR17 alla β-arrestina

3.1 FOSFORILAZIONE DEL GPR17

Per valutare la fosforilazione del GPR17, abbiamo transfettato cellule di astrocitoma 1321N1 con un plasmide contenente la sequenza codificante per il GPR17 sotto forma di HA-Tag in modo da poter marcare il recettore con un anticorpo anti-HATag. La transfezione ha permesso di ottenere un'alta espressione di GPR17 HA-Tag sia nei livelli di mRNA che di proteina (Figura 1).

È importante sottolineare che abbiamo dimostrato anche, tramite saggi funzionali, che le cellule trasfettate con il costrutto Ha-Tag GPR17 mostrano un profilo di risposta farmacologica del tutto paragonabile a quella osservata sulle stesse cellule esprimenti il recettore non taggato (Ciana et al., 2000).

A B

Figura 1: Espressione di HA-Tag GPR17 in cellule 1321N1 valutata attraverso analisi real time PCR con primers specifici che rivelano la presenza di prodotti amplificati corrispondenti a HA- Tag GPR17 (Pannello A) e attraverso analisi western bolt eseguta utilizzando anticorpo specifico anti-HATag o anti-βactina come controllo (Pannello B).

W ild ty pe

HA T ag -G PR 17

-actina 268 bp

hGPR17 843 bp

-actina

HA Tag-GPR17

Fosforilazione del GPR17: in studi precedenti è stato dimostrato che il GPR17 subisce desensitizzazione e resensitizzazione a seguito dell'esposizione ad agonisti purinergici e CysLT e successivo wash-out cellulare (Daniele S. et al. 2011). La desensitizzazione dei GPCR è innescata prevalentemente dalla fosforilazione da parte delle chinasi GRK; sulla base di tali presupposti, abbiamo analizzato i livelli di fosforilazione del GPR17 sui residui di serina e treonina dopo diversi tempi di stimolazione delle cellule con una elevata concentrazione dei due tipi di agonisti (quasi 10 volte sopra i loro valori EC50), LTD

e UDP-glucosio.

Le cellule HA Tag-GPR17 sono state trattate con il solo mezzo (basale) o con 100 μM UDP-glucosio o 100 nM LTD

per diversi tempi (5 min e 30 min). I lisati (8 µg-10 µg) sono stati successivamente incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato precedentemente absorbito l'anticorpo anti-HATag. Dopo 2 ore (tempo necessario affinchè il GPR17 si leghi all'anticorpo anti-HATag), i lisati vengono incubati con un anticorpo I specifico diretto contro i residui di serina e treonina fosforilati.

I dati relativi alla fosforilazione del recettore GPR17 sono mostrati in figura 2:

Figura 2: Fosforilazione del recettore GPR17 su residui di Treonina e Serina effettuati attraverso il saggio ELISA. Le cellule 1321N1 sono state trattate per diversi tempi (5 e 30 minuti) con mezzo di coltura (controllo), o UDP-glucosio o LTD

. Al termine dei trattamenti, i lisati sono stati incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato precedentemente preparato un coating con l'anticorpo anti-HATag. Dopo 2 ore i lisati vengono incubati con un anticorpo I specifico anti- fosfoserina o anti-fosfotreonina.I dati sono espressi come percentuale rispetto al valore basale (100%) e sono la media ± SEM di tre esperimenti distinti. *P < 0.05 verso controllo, **P< 0.01 verso controllo, ***P< 0.001 verso controllo.

5 min 30 min

5 min 30 min

Basal 5 min

30 min 5 min

30 min 50

70 90 110 130 150 170

190 UDP-glucosio

LTD₄

p-Ser p-Thr

**

***

*** ***

***

*** ***

**

Fosforilazione GPR17 (% rispetto al basale)

I risultati ottenuti sono stati validati attraverso Western Blot: per valutare la fosforilazione del recettore, le cellule 1321N1 hGPR17, sono state trattate con UDP-glucosio (100 μM) o LTD

(100 nM) per 5 e 30 minuti. Al termine di ogni tempo di incubazione, sono stati preparati i lisati cellulari; al fine di valutare i livelli di fosforilazione del recettore, il lisato cellulare è stato immunoprecipitato utilizzando un anticorpo anti-HATag. Dopo corsa elettroforetica e trasferimento su membrane di PVDF, le proteine separate sono state marcate mediante anticorpi contro residui di Serina e Treonina fosforilati.

In Figura 3 sono mostrate le immagini relative ad un’analisi SDS-PAGE/western blot rappresentative di tre esperimenti. Sulle bande immunoreattive ottenute utilizzando anticorpi anti-serina o anti-treonina fosforilati, è stata poi eseguita un’analisi densitometrica utilizzando il programma Image J (Figura 3 Pannello B)

Figura 3: Time-course della fosforilazione del recettore GPR17 su residui di Treonina e Serina ottenuta attraverso Western Blot. Le cellule 1321N1 sono state trattate con mezzo di coltura (controllo) o UDP-glucosio o LTD

. Al termine dei trattamenti, sono stati preparati lisati cellulari e il GPR17 è stato immunoprecipitato con un anticorpo anti-HA Tag. L'analisi SDS-PAGE/western blot è stata effettuata impiegando anticorpi anti-fosfoserina e anti-fosfotreonina

A) immunoblot rappesentativo; B) analisi densiometrica dei dati.

I dati sono espressi come percentuale rispetto al valore basale (100%) e sono la media ± SEM di tre esperimenti distinti. *P < 0.05 verso controllo, **P< 0.01 verso controllo, ***P< 0.001 verso controllo.

Basal 50 100 150 200 250 300 350

UDP-glucosio LTD₄

5 min

p-Thr

**

p-Ser

30 5 30

**

* **

*

**

**

***

B

Fosforilazione GPR17 (% rispetto al basale)

I risultati mostrano che entrambi gli agonisti inducono fosforilazione sui residui di treonina e in misura minore anche sui residui di serina (Figura 3 A e B).

3.2 ASSOCIAZIONE DEL GPR17 ALLE GRK

Dopo aver mostrato la fosforilazione indotta da agonisti del GPR17, abbiamo indagato il coinvolgimento di GRK2 e GRK5 in questo processo.

Le cellule HA Tag-GPR17 sono state trattate con il solo mezzo (basale) o con 100 μM UDP-glucosio o 100 nM LTD

per 5 min. I lisati (8 µg-10 µg) sono stati successivamente incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato precedentemente absorbito l'anticorpo anti-HATag. Dopo 2 ore, i lisati vengono incubati con un anticorpo I specifico diretto contro le GRK 2 o le GRK 5.

I dati relativi all'associazione delle GRK al recettore GPR17 sono mostrati in figura 4:

Figura 4: Associazione della GRK2 (Pannello A) e GRK5 (Pannello B) al GPR17 ottenuta attraverso saggio ELISA. Le cellule 1321N1 sono state trattate per 5 minuti con mezzo di coltura (controllo), o UDP-glucosio o LTD

. Al termine dei trattamenti, i lisati sono stati incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato precedentemente preparato un coating con l'anticorpo anti-HATag. Dopo 2 ore i lisati vengono incubati con un anticorpo I specifico anti- GRK. I dati sono espressi come percentuale rispetto al valore basale (100%) e sono la media ± SEM di tre esperimenti distinti. *P < 0.05 verso controllo, **P< 0.01 verso controllo, ***P<

0.001 verso controllo.

Basale

5 min

5 min 150

300 450 600 750

LTD₄ UDP-glucosio

***

***

A ###

Associazione GPR17/GRK2 (% rispetto al basale)

Basale

5 min

5 min 150

300 450 600

UDP-glucosio

***

**

LTD₄

##

B

Associazione GPR17/GRK5 (% rispetto al basale)

I risultati ottenuti sono stati validati attraverso Western Blot: le cellule 1321N1 sono state trattate con UDP-glucosio 100 μM o LTD

100 nM per 5 minuti e al termine del periodo di incubazione abbiamo preparato i lisati cellulari. Dato che il nostro scopo era quello di valutare i livelli di associazione della GRK2 e GRK5 al solo recettore GPR17, abbiamo utilizzato un anticorpo anti-HA Tag GPR17 per immunoprecipitare il recettore. Dopo corsa elettroforetica e trasferimento delle proteine su membrane di PVDF viene valutata la presenza delle GRK negli immunoprecipitati GPR17, utilizzando anticorpi contro la GRK d'interesse. In Figura 5 sono mostrate le immagini relative ad un’analisi SDS- PAGE/western blot rappresentative di tre esperimenti. Sulle bande immunoreattive ottenute utilizzando anticorpi anti-GRK2 o anti-GRK5, è stata poi eseguita un’analisi densitometrica utilizzando il programma Image J (Figura 5 Pannello B).

A B

Figura 5: Associazione della GRK2 e GRK5 al GPR17. Le cellule 1321N1 sono state trattate con mezzo di coltura (controllo), o UDP-glucosio o LTD

. Al termine dei trattamenti, sono stati preparati lisati cellulari e immunoprecipitati con un anticorpo anti-GPR17. L’analisi SDS- PAGE/western blot è stata effettuata impiegando anticorpi anti-GRK. A) immunoblot rappesentativo; B) analisi densiometrica dei dati.

I dati sono espressi come percentuale rispetto al valore basale (100%) e sono la media ± SEM di tre esperimenti distinti. *P < 0.05 verso controllo, **P< 0.01 verso controllo, ***P< 0.001 verso controllo.

Basale

UDP-glucosio ⁴ LTD

Basale

UDP-glucosio ⁴ LTD 100

200 300 400 500 600 700 800

*

**

**

***

GRK2

GRK5

###

Associazione GRK-GPR17 (% rispetto al basale)

Dai risultati ottenuti è evidente che, dopo 5 minuti di trattamento, gli agonisti sono in grado di indurre una significativa associazione di GRK2 e GRK5 al recettore. I due agonisti mostrano però un comportamento diverso: LTD

induce una maggiore associazione di GRK2, mentre l'associazione con GRK5 appare significativamente maggiore dopo stimolazione con agonisti purinergici ( Figura 4 e 5).

3.3 ASSOCIAZIONE DEL GPR17 ALLA β-ARRESTINA

La stabilità dei complessi β–arrestina-recettore influenza il destino del recettore internalizzato: infatti, la formazione di complessi transienti favorisce la rapida defosforilazione e il ritorno su membrana del recettore, mentre complessi stabili ritardano la re-sensitizzazione e favoriscono il direzionamento del recettore verso la degradazione.

Sulla base di ciò, abbiamo indagato l'effetto delle due classi di ligandi del GPR17, LTD

e

UDP-glucosio, sul legame del recttore alla β-arrestina. A questo scopo le cellule HA Tag-

GPR17 sono state trattate con il solo mezzo (basale) o con 100 μM UDP-glucosio o 100

nM LTD

per diversi tempi (5 min e 30 min). I lisati (8 µg-10 µg) sono stati

successivamente incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato

precedentemente preparato un coating con l'anticorpo anti-HATag. Dopo 2 ore i lisati

vengono incubati con un anticorpo I specifico anti-βarrestina. In condizioni basali, GPR17

è debolmente associato con β-arrestina 1. Dopo 5 min di stimolazione del recettore, sia

UDP-glucosio che LTD

inducono una significativa associazione del recettore alla β-

arrestina 1. Gli immunocomplessi erano ancora rilevabili dopo 30 min di incubazione con

UDP-glucosio, suggerendo una formazione di complessi stabili GPR17/β-arrestina; al

contrario, dopo stimolazione con LTD

, il GPR17 forma un complesso transitorio con β-

arrestina che si dissocia entro 30 min (Figura 6 A e B).

I risultati relativi all'associazione della β-arrestina 1 al recettore GPR17 sono mostrati in figura 6:

Figura 6: Associazione della β-arrestina al GPR17 ottenuta attraverso saggio ELISA. Le cellule 1321N1 sono state trattate per diversi tempi (5 e 30 minuti) con mezzo di coltura (controllo), o UDP-glucosio o LTD

. Al termine dei trattamenti, i lisati sono stati incubati nei pozzetti di un multiwell da 96, dove vi è stato precedentemente preparato un coating con l'anticorpo anti-HATag.

Dopo 2 ore di incubazione, i lisati vengono trattati con un anticorpo I specifico anti-βarrestina 1. I dati sono espressi come percentuale rispetto al valore basale (100%) e sono la media ± SEM di tre esperimenti distinti. *P < 0.05 verso controllo, **P< 0.01 verso controllo, ***P< 0.001 verso controllo.

I risultati ottenuti sono stati validati attraverso il Western Blot: le cellule 1321N1 sono state trattate con UDP-glucosio 100 μM o LTD

100 nM per 5 minuti e al termine del periodo di incubazione abbiamo preparato i lisati cellulari e immunoprecipitato la β-arrestina mediante l'anticorpo diretto contro la β-arrestina 1. Dopo corsa elettroforetica e trasferimento delle proteine su membrane di PVDF viene valutata la presenza del GPR17 negli immunoprecipitati β-arrestina1, utilizzando anticorpi contro l'epitopo HA-Tag GPR17. In Figura 7 sono mostrate le immagini relative ad un’analisi SDS-PAGE/western blot rappresentative di tre esperimenti. Sulle bande immunoreattive ottenute utilizzando anticorpi anti-HATag GPR17, è stata poi eseguita un’analisi densitometrica utilizzando il programma Image J (Figura 7 Pannello B).

Basale

5 min

30 min

5 min

30 min 100

150 200 250 300 350

LTD₄

UDP-glucosio

*** ***

**

*

Associazione GPR17/ arrestin-1 (% rispetto al basale)

A B

Figura 7: Associazione tra β–arrestina 1 e GPR17 dopo stimolazione con agonisti. Le cellule 1321N1 sono state trattate con mezzo di coltura (controllo), o UDP-glucosio o LTD

. Al termine dei trattamenti, sono stati preparati lisati cellulari e il recettore GPR17 è stato immunoprecipitato con un anticorpo anti-β-arrestina1. L’analisi SDS-PAGE/western blot è stata effettuata impiegando anticorpi anti-HA Tag GPR17.

A) immunoblot rappesentativo; B) analisi densiometrica dei dati. I dati sono espressi come percentuale rispetto al valore basale (100%) e sono la media ± SEM di tre esperimenti distinti.*P

< 0.05 verso controllo, **P< 0.01 verso controllo, ***P< 0.001 verso controllo.

Basale 50 100 150 200 250 300 350

UDP-glucosio LTD₄

** **

*

5 30 5 30 min Associazione GPR17/-arrestina (% rispetto al basale)

3.4 CONCLUSIONI

In conclusione i risultati ottenuti dimostrano che il saggio immunoenzimatico da noi messo a punto costituisce una metodica alternativa e valida per studiare l'interazione del recettore GPR17 con proteine di regolazione del segnale.

I dati ottenuti mediante tale metodica e validati dal confronto con metodiche di immunoprecipitazione e western blot, dimostrano nel particolare che:

1. il recettore fosforila su residui di serina e treonina in risposta alle due classi di agonisti UDP-glucosio e LTD

: il fenomeno della fosforilazione avviene in maniera tempo-dipendente.

2. il recettore si associa alle chinasi GRK2 e GRK5 in risposta alle due classi di agonisti UDP-glucosio e LTD

. In particolare LTD

induce l’associazione preferenziale del recettore con la GRK2 mentre il ligando purinergico, favorisce l'associazione con la GRK5.

3. il recettore si associa alla β-arrestina1 in risposta alle due classi di agonisti UDP-

glucosio e LTD

In condizioni basali, GPR17 si associa debolmente con la β-

arrestina 1, mentre dopo 5 minuti di stimolazione con UDP-glucosio o LTD

si

verifica un significativo aumento dell'associazione tra il recettore e la β-arrestina,

ma in modo diverso per le due classi di ligandi: LTD

induce l'associazione

transiente tra GPR17 e β-arrestina 1, mentre l'UDP-glucosio induce un'associazione

più stabile nel tempo.

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