Digestione delle proteine
Le proteasi pancreatiche sono
attivate nell’intestino
L’assorbimento intestinale avviene
attraverso un trasporto attivo
Gli aminoacidi (come il glucosio) vengono assorbiti dall’intestino per
trasporto attivo
Catabolismo degli aminoacidi
Distacco del gruppo aminico dallo
scheletro carbonioso
Destino dello scheletro carbonioso
Aminoacidi glucogenici = rosa
Aminoacidi chetogenici = giallo
Il destino del gruppo aminico degli
aminoacidi è di passare sul glutammato
Flusso generale
NH4+
UREA NH2 C=O NH2 DEAMINAZIONE OSSIDATIVA
glutammato deidrogenasi NAD+
glutammato -chetoglutarato
-amminoacidi
O II
C – O– I
H – C – NH3+ I
R
TRANSAMINAZIONE
transaminasi piridossalfosfato
-chetoacidi O
II
C – O– I
H – C = O I
R
glutammato
+ +
-chetoglutarato
v. 1.4.1 © gsartor 2001- 2008
Metabolismo dell'azoto - 9 -
Transaminazione
• Le reazione di transaminazione usano come coenzima il piridossal fosfato.
• Il piridossal fosfato forma una base di Shiff con un residuo di Lys della transaminasi
N+ H
OH OH
CH3 O
H P
O O O O
N+ H
O
OH
CH3 H
P O
O O O
N+ H
NH3+ OH
CH3
Piridossina
(Vit B6) Piridossal fosfato (PLP)
Piridossamina fosfato (PMP)
v. 1.4.1 © gsartor 2001- 2008
Metabolismo dell'azoto - 10 -
Meccanismo della transaminazione
P O
O O O
N+ H
OH
CH3 (CH2)4 H N
H R NH3+
O O
P O
O O O
N+ H
OH
CH3 H N
RH O O (CH2)4 NH3+
(CH2)4 NH3+
P O
O O O
N H
OH
CH3 N H
R O
O H+
(CH2)4 NH3+
P O
O O O
N+ H
OH
CH3 H N
R O
O
H
H+
(CH2)4 NH3+
P O
O O O
N+ H
OH
CH3 NH3+ HH
H2O
O
R O
O Base di Shiff con
l'enzima Base di Shiff con
l'aminoacido Aminoacido
-chetoacido
Glutammato alanina aminotransferasi o
glutammato piruvato transaminasi o GPT
Le transaminasi
Le transaminasi sono enzimi ubiquitari, ma particolarmente abbondanti in fegato e muscolo striato, che catalizzano reazioni di trasferimento di un gruppo amminico da un aa. donatore (di solito glutammato) su un - chetoacido accettore, secondo lo schema generale:
AA1 (Glu) + KA2 KA1 ( KGA) + AA2
Le transaminasi contengono un coenzima vitaminico, il piridossal fosfato (PLP), che durante la catalisi riceve il gruppo –NH2 dal Glu e diventa piridossamina fosfato (PMP)
Il meccanismo catalitico richiede la formazione di una base di Schiff tra il gruppo aldeidico del PLP e il gruppo amminico dell’aa.
La reazione transaminasica può essere divisa in due semireazioni:
1. GLU (AA1) + E-PLP -KGA (KA1) + E-PMP
2. KA2 (es. Piruvato) + E-PMP AA2 (es. Alanina) + E-PLP
Alanina aminotransferasi ALT (Sinonimo SGPT) (10\25 u\l):
L’enzima è localizzato principalmente nelle cellule epatiche (fegato) dalle quali esce in seguito a danni a carico della loro parete.
E’ un indicatore abbastanza specifico di un danno epatico senza però chiarirne la causa.
Alcuni farmaci (ad esempio i barbiturici, il fenobarbital, i glucocorticoidi, l ’ acetaminofene, il tiacetarsamide ed altri) possono determinare un innalzamento dell’ALT.
catalizza la reazione reversibile:
L-alanina + alfa-chetoglutarato ---> L-glutammato + piruvato
Transaminasi
Aspartato aminotransferasi AST (Sinonimo SGOT) (8\20 u\l) :
E’ contenuto in diverse cellule ma risulta particolarmente concentrato in
particolari distretti delle cellule epatiche (mitocondri) e del tessuto muscolare.
Il fatto che siano localizzati all’interno di subunità cellulari fa sì che si abbia , un rilascio più lento dell’enzima nel sangue a seguito di danni che coinvolgono il fegato, ma ciò indica anche un danno più grave alle cellule del fegato o dei muscoli.
Evenienze che provocano un falso innalzamento della AST sono per esempio la rottura esagerata di globuli rossi ( emolisi) e la lipemia alta (elevato tasso di lipidi nel sangue).
catalizza la reazione reversibile:
L-aspartato + alfa-chetoglutarato ---> L-glutammato + ossalacetato
Dosaggio
Per dosare l'AST si usa l'enzima malato deidrogenasi che utilizza come
substrato l'ossalacetato prodotto dall'AST. Quanto più acido malico si forma
dall'ossalacetato ad opera della malato deidrogenasi tanto più è presente l'AST.
Quindi la diminuzione di assorbanza a 340nm (picco di assorbimento del NADH) allo spettrofotometro misura l'attività enzimatica dell'AST.
Per dosare l'ALT si utilizza l'enzima lattico deidrogenasi che agisce sul substrato piruvato prodotto dall'ALT. Quanto più acido lattico si forma dal piruvato ad opera della lattico deidrogenasi tanto più è presente l'ALT.
Quindi la diminuzione di assorbanza a 340nm allo spettrofotometro misura l'attività enzimatica dell'ALT.
Molti composti assorbono radiazione elettromagnetica di una determinata lunghezza d’onda, nelle regioni del visibile (vis) o dell’ultravioletto (UV).
La legge di Lambert-Beer esprime la relazione tra assorbanza, concentrazione della sostanza, spessore del campione.
A = c d
dove
= il coefficiente di estinzione molare della sostanza che assorbe la luce ad una data lunghezza d'onda λ.
Il coefficiente di estinzione molare corrisponde all'assorbanza di una soluzione 1M di un composto puro in condizioni standard di solvente, temperatura e lunghezza d'onda;
c = concentrazione della sostanza;
d = cammino ottico della radiazione nella soluzione NOTA: è l'equazione di una retta
Quindi dall’ assorbanza di una sostanza è possibile risalire alla sua concentrazione.
Lo spettrofotometro è costituito dai seguenti componenti:
1- una sorgente luminosa che dà origine ad una radiazione policromatica in un certo intervallo di lunghezze d’onda (lampada a filamento di tungsteno per la luce visibile) 2- un selezionatore di lunghezza d’onda o monocromatore che risolve il fascio
policromatico in radiazioni a lunghezza d’onda determinata 3- un pozzetto per l’introduzione delle cuvette
4- una cellula fotoelettrica sulla quale incide il raggio emergente dalla soluzione in esame
5- un sistema di amplificazione della corrente emessa dalla fotocella 6- un galvanometro per la misura di tale corrente elettrica.
Enzimi in chimica clinica
La comparsa di attività enzimatiche intracellulari nel siero indica un danno tessutale e talvolta il tipo di enzima consente di identificare il tessuto danneggiato. Alcuni enzimi sono infatti presenti in forme diverse (isoenzimi) in tessuti diversi.
Isoenzimi = catalizzano la stessa reazione, ma hanno sequenza aa.
diversa e si trovano in tessuti diversi. La separazione degli isoenzimi si ottiene con l’elettroforesi.
Lattico deidrogenasi (LDH), alanina transaminasi (ALT o GPT) e aspartato transaminasi (AST o GOT) e creatina cinasi (CK) sono tra gli enzimi più utili per fare diagnosi di danno tessutale specifico (epatico o muscolare).
LDH è un enzima diffuso in tutte le cellule, per cui il suo aumento nel siero è una indicazione aspecifica di danno tessutale: maggiori indicazioni però si ottengono dall ’ analisi del tipo di isoenzima aumentato.
LDH-1 (HHHH) cuore; LDH-2 (HHHM) cuore, eritrociti, rene; LDH-3 (HHMM) polmone, linfociti; LDH-4 e 5 (HMMM / MMMM) fegato e muscolo sch. (valori normali 100-200 U/l)
Piruvato + glutammato alanina + -chetoglutarato ALT o GPT Ossalacetato + glutammato aspartato + - chetoglutarato ASP o GOT
AST e ALT (valori normali 5-35 U/l) aumentano in corso di danno epatico, muscolare schel. o cardiaco. ALT (citosolica) è presente soprattutto nel fegato, AST (mitocondriale) è presente anche in miocardio e muscolo sch.
CK (valori totali normali 30-150 U/l) aumenta in corso di danno muscolare (scheletrico e miocardico).
Creatina-P + ADP creatina + ATP CK
Ci sono 3 forme isoenzimatiche della creatina cinasi: CK1 (cervello e polmone), CK2 (miocardio), CK3 (muscolo sch. e miocardio)
ALT più specifica per danno epatico, aumenta in epatite e cirrosi
AST aumenta nell’infarto del miocardio, nelle epatiti, nella cirrosi alcolica ( AST/ALT)
Esempio di utilizzo degli isoenzimi CK2 ed LDH1 nella diagnosi di laboratorio dell’ infarto del miocardio
Enzima Inizio Picco Basale
CK2 4h 18h 48h
AST 8h 24-48h 4 giorni
LDH1 24h 3 giorni 12 giorni
