NEW LAWS TO BE EXPECTED IN THE ORGANISM
What I wish to make clear in this last chapter is, in short, that from
all we have learnt about the structure of living matter, we must be
prepared to find it working in a manner that cannot be reduced to
the ordinary laws of physics. And that not on the ground that there
is any ’new force’ or what not, directing the behaviour of the
single atoms within a living organism, but because the
construction is different from a anything we have yet tested in the
physical laboratory. To put it crudely, an engineer, familiar with
heat engines only, will, after inspecting the construction of an
electric motor, be prepared to find it working along principles
which he does not yet understand.
(Erwin Schrodinger - WHAT IS LIFE? - 1944)
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Riassunto
Obiettivo. L’obiettivo di questo studio è di studiare invecchiamento placentare e stress ossidativo analizzando l’espressione proteica di p21, p53 ed APE1 inoltre abbiamo ana-lizzato anche un marcatore indicativo di danno da stress ossidativo alla doppia elica del DNA.
Materaili e metodi. Studio retrospettivo con realizzazione di un tissue micro array di placenta contenete 92 controlli da diverse epoche gestazionali e 158 casi patologici tra cui pre-eclampsia, HELLP e IUGR occorsi in diverse epoche gestazionali.
Risultati. In questo studio abbiamo evidenziato una influenza significativa dell’epoca gestazionale sull’espressione nel trofoblasto di p21, APE1 ed 8-OHdg. Nelle placente dei casi affetti da pre-eclampsia, HELLP o IUGR vi è un aumentata espressione di p53, 8-OHdg ed APE1 rispetto ai contrilli. Sia nei gruppi di patologia tra la 22a e la 34a settimana gestazionale che dopo la 34a settimana gestazionale APE1 è più espressa nel trofoblasto di pazienti con disordini ipertensivi della gravidanza piuttosto che di pazienti con IUGR. L’espressione di 8-OHdg citoplasmatica è aumentata nel trofoblasto delle placente degli IUGR rispetto a pre-eclampsia o HELLP. Nei casi dopo la 34a settimana p21 è aumentata negli SGA e negli IUGR rispetto a controlli e pre-eclampsia. Anche p53 dopo la 34a settimana gestazionale è aumetata negli IUGR.
Conclusioni. Le placente da gravidanze patologiche presentano una alterata espressione di p21, p53, APE1 e 8-OHdg. Le alterazioni delle vie intracellulari che coinvolgono questi elementi possono essere la causa o la conseguenza della disfunzione placentare ma in ogni caso riflettono un cattivo funzionamento placentare.
Indice
Riassunto I
Elenco delle figure V
Elenco delle tabelle VII
Lista delle pubblicazioni IX
1 Introduzione allo studio 1
1.1 Premesse . . . 1
1.2 Funzionalità cellulare e senescenza cellulare . . . 3
2 Lo studio 9 2.1 Materiali e metodi . . . 9
2.1.1 Preparazione del microarray di tessuto . . . 9
2.2 Risultati . . . 12
2.2.1 Descrizione della popolazione . . . 12
2.2.2 Analisi immunoistochimica di p21, p53, APE1/REF1 e 8-OHdg nelle placente normali . . . 16
2.2.3 Analisi immunoistochimica di p21, p53, APE1 e 8-OHdg nella patologia ostetrica di origine placentare iniziata prima della 34a settimana gestazionale e nei controlli . . . 23
2.2.4 Analisi immunoistochimica di p21, p53, APE1 e 8-OHdg nella patologia ostetrica di origine placentare iniziata dopo della 34a settimana gestazionale e nei controlli . . . 25 2.3 Discussione . . . 28 2.4 Conclusioni . . . 32
Ringraziamenti 33
Elenco delle figure
1.1 La piramide di Nicolaides. . . 2
2.1 Preparazione TMA. . . 15
2.2 Espressione proteica ed epoca gestazionale. . . 17
2.3 Espressione p21 e p53. . . 18
2.4 Correlazioni con espressione di 8-OHdg. . . 19
2.5 Correlazioni con l’indice placentare nei controlli. . . 20
2.6 Correlazioni con l’indice placentare nei casi. . . 21
2.7 Correlazioni con l’indice placentare nei casi. . . 31
Elenco delle tabelle
2.1 Caratteristiche della pololazione studiata 22-34 settimane gestazionali. . 13 2.2 Caratteristiche della pololazione studiata >34 settimane gestazionali. . . 14 2.3 Analisi monovariata dell’espressione immunoistochimica delle proteine
considerate in questo studio. . . 22 2.4 Analisi mediante regressione logistica mono e multivariata delle
diffe-renze rispetto al gruppo di controllo dell’espressione immunoistochimi-ca delle proteine studiate nei gruppi di pazienti con esito prima della 34a settimana gestazionale. . . 24 2.5 Analisi mediante regressione logistica mono e multivariata delle
diffe-renze rispetto al gruppo di controllo dell’espressione immunoistochimi-ca delle proteine studiate nei gruppi di pazienti con esito dopo della 34a settimana gestazionale. . . 26 2.6 Analisi monovariata dell’espressione di p21, p53, APE1 ed 8-OHdg nei
casi di IPG e controlli. . . 27 2.7 Analisi mediante regressione logistica mono e multivariata
dell’espres-sione di p21, p53, APE1 ed 8-OHdg nei casi di IPG con o renza SGA versus i controlli. . . 27
Lista delle pubblicazioni su riviste
peer-review pubblicate durante il
dottorato
Queste pubblicazioni sono state pubblicate durente il mio primo anno (2011) di dottorato:
• Calcagno, A.; Grassi, T.; Mariuzzi, L.; Marzinotto, S.; Londero, A. P.; Orsaria, M.; Beltrami, C. A. & Marchesoni, D. (2011), ’Expression patterns of Aurora A and B kinases, Ki-67 and the estrogen and progesterone receptors determined using an endometriosis tissue microarray model.’, Hum Reprod 26(10), 2731–2741.
• Del Fabro, A.; Driul, L.; Anis, O.; Londero, A. P.; Bertozzi, S.; Bortotto, L. & Marchesoni, D. (2011), ’Fetal gender ratio in recurrent miscarriages.’, Int J Womens Health 3, 213–217.
• Driul, L.; Londero, A. P.; Papadakis, C.; Driul, D.; Della Martina, M.; Peressi-ni, L.; Bertozzi, S.; Tenore, A. & MarchesoPeressi-ni, D. (2011), ’Significance of pel-vic ultrasonographic examinations in girls with pubertal precocity and premature thelarche before and after GnRH-analogues treatment’, Journal of Medicine and Medical Sciences 2(7), 955-960.
• Bertozzi, S.; Londero, A.; Fruscalzo, A.; Driul, L.; Delneri, C.; Calcagno, A.; Di Benedetto, P. & Marchesoni, D. (2011), ’Impact of episiotomy on pelvic floor di-sorders and their influence on women’s wellness after the sixth month postpartum: a retrospective study’, BMC Women’s Health 11(1), 12.
• Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Salvador, S.; Grassi, T.; Fruscalzo, A.; Driul, L. & Marchesoni, D. (2011), ’Influence of the couple on hypertensive disorders
during pregnancy: A retrospective cohort study’, Pregnancy Hypertension: An International Journal of Women’s Cardiovascular Health 1(2), 156 - 163.
• Driul, L.; Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Fruscalzo, A.; Rusalen, A.; Marchesoni, D. & Benedetto, P. D. (2011), ’Risk factors for chronic pelvic pain in a cohort of primipara and secondipara at one year after delivery: association of chronic pelvic pain with autoimmune pathologies.’, Minerva Ginecol 63(2), 181–187.
• Rossi, A.; Braghin, C.; Soldano, F.; Isola, M.; Capodicasa, V.; Londero, A. P.; For-zano, L. & Marchesoni, D. (2011), ’A proposal for a new scoring system to eva-luate pelvic masses: Pelvic Masses Score (PMS).’, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.
Queste pubblicazioni sono state pubblicate durente il mio secondo anno (2012) di dottorato:
• Bernardi, S.; Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Gentile, G.; Giacomuzzi, F. & Carbone, A. (2012), ’Incidence and Risk Factors of the Intraoperative Localization Failure of Nonpalpable Breast Lesions by Radio-guided Occult Lesion Localization: A Retrospective Analysis of 579 Cases.’, World J Surg 36(8), 1915–1921.
• Bernardi, S.; Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Giacomuzzi, F.; Angione, V.; Dri, C.; Carbone, A. & Petri, R. (2012), ’Nine years of Experience with the Sentinel Lymph Node Biopsy in a Single Italian Center: A Retrospective Analysis of 1,050 Cases.’, World J Surg 36(4), 714–722.
• Bernardi, S.; Londero, A. P.; Bertozzi, S.; Driul, L.; Marchesoni, D. & Petri, R. (2012), ’Breast-feeding and benign breast disease.’, J Obstet Gynaecol 32(1), 58–61.
• Driul, L.; Forzano, L.; Londero, A. P.; Fachechi, G.; Liva, S. & Marchesoni, D. (2012), ’[Maternal Body Mass Index and breastfeeding.]’, Minerva Ginecol 64(2), 117–120.
• Driul, L.; Londero, A.; Papadakis, C.; Candoni, A.; Bertozzi, S.; Fanin, R. & Mar-chesoni, D. (2012), ’Fertility in women survivors of hematological malignancies: what is the real role of GnRH analogue treatment?’, Clin Exp Obstet Gynecol XXXIX(4), 504-508.
• Fruscalzo, A.; Salmeri, M. G.; Cendron, A.; Londero, A. P. & Zanni, G. (2012), ’Introducing routine trial of labour after caesarean section in a second level hospital setting.’, J Matern Fetal Neonatal Med 25(8), 1442–1446.
• Fruscalzo, A.; Schmitz, R.; Klockenbusch, W.; Köhler, G.; Londero, A. P.; Siwetz, M. & Huppertz, B. (2012), ’Human placental transthyretin in fetal growth restric-tion in combinarestric-tion with preeclampsia and the HELLP syndrome.’, Histochem Cell Biol 138(6), 925–932.
• Londero, A. P.; Calcagno, A.; Grassi, T.; Marzinotto, S.; Orsaria, M.; Beltrami, C. A.; Marchesoni, D. & Mariuzzi, L. (2012), ’Survivin, MMP-2, MT1-MMP, and TIMP-2: their impact on survival, implantation, and proliferation of endometriotic tissues.’, Virchows Arch 461(5), 589–599.
• Pasqual, E.; Bertozzi, S.; Bacchetti, S. & Londero, A. (2012), ’Effektive The-rapie bei peritonealen Neoplasmen mit niedrigem Peritoneal Cancer Index: Die Schwierigkeit der Diagnosesicherung’, Interdisziplinäre Onkologie 4(2), 26–29
Queste pubblicazioni sono state pubblicate durente il mio terzo anno (2013) di dottorato:
• Fruscalzo, A.; Steinhard, J.; Londero, A. P.; Fröhlich, C.; Bijnens, B.; Klocken-busch, W. & Schmitz, R. (2013), ’Reliability of quantitative elastography of the uterine cervix in at-term pregnancies.’, J Perinat Med 41(4), 421–427.
• Londero, A. P.; Bertozzi, S.; Visentin, S.; Fruscalzo, A.; Driul, L. & Marchesoni, D. (2013), ’High placental index and poor pregnancy outcomes: a retrospective study of 18 386 pregnancies.’, Gynecol Endocrinol 29(7), 666–669.
• Bernardi, S.; Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Angione, V.; Petri, R. & Giacomuzzi, F. (2013), ’Prevalence and risk factors of intraoperative identification failure of sentinel lymph nodes in patients affected by breast cancer.’, Nucl Med Commun 34(7), 664–673.
• Driul, L.; Bernardi, S.; Bertozzi, S.; Schiavon, M.; Londero, A. P. & Petri, R. (2013), ’New surgical trends in breast cancer treatment: conservative interventions and oncoplastic breast surgery.’, Minerva Ginecol 65(3), 289–296.
• Londero, A. P. & Bertozzi, S. (2013), ’Knowledge as primary prevention: before being a doctor, doctors must also be teachers’, Global Journal of Medicine & Public Health 2(2), 1-2.
• Londero, A. P.; Bertozzi, S.; Salvador, S.; Fruscalzo, A.; D’Aietti, V.; Grassi, T.; Driul, L.; Mariuzzi, L.; Marchesoni, D. & Lellé, R. J. (2013), ’A review of extramammary paget’s disease: Clinical presentation, diagnosis, management and prognosis’, Journal of Medicine and Medical Sciences 4(4), 134–148.
• Angelini, M.; Barillari, G.; Londero, A. P.; Bertozzi, S.; Bernardi, S.; Petri, R.; Driul, L. & Marchesoni, D. (2013), ’Puerperal ovarian vein thrombosis: two case reports.’, J Thromb Thrombolysis 35(2), 286–289.
• Bacchetti, S.; Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Uzzau, A. & Pasqual, E. M. (2013), ’Surgical treatment and survival in patients with liver metastases from neuroen-docrine tumors: a meta-analysis of observational studies.’, Int J Hepatol 2013, 235040.
• Bernardi, S.; Bertozzi, S. & Londero, A. P. (2013), ’Incidence and risk factors of the intraoperative localization failure of nonpalpable breast lesions by radio-guided occult lesion localization: a retrospective analysis of 579 cases: reply.’, World J Surg 37(2), 478.
• Calcagno, A.; Londero, A. P.; Haag, T.; Driul, L.; Bertozzi, S.; Grassi, T.; Mar-chesoni, D. & Manhes, H. (2013), ’Surgical treatment of ectopic pregnancy as-sociated with predisposing factors of tuboperitoneal infertility.’, Minim Invasive Ther Allied Technol 22(2), 97–103.
• Fruscalzo, A.; Biasioli, A.; Londero, A. P.; Ceraudo, M.; Stel, G.; Bertozzi, S.; Marchesoni, D.; Driul, L. & Curcio, F. (2013), ’Retinol binding protein as ear-ly marker of fetal growth restriction in first trimester maternal serum.’, Gynecol Endocrinol 29(4), 323–326.
• Londero, A. P.; Orsaria, M.; Grassi, T.; Calcagno, A.; Marzinotto, S.; Ceraudo, M.; Fruscalzo, A.; Driul, L. & Mariuzzi, L. (2013), ’Placental hCG immunohi-stochemistry and serum free-Beta-hCG at 11-13 weeks’ gestation in intrauterine fetal demise.’, Histochem Cell Biol 139(4), 595–603.
• Londero, A. P.; Salvador, S.; Fruscalzo, A.; Bertozzi, S.; Biasioli, A.; Ceraudo, M.; Visentin, S.; Driul, L. & Marchesoni, D. (2013), ’First trimester PAPP-A MoM values predictive for breech presentation at term of pregnancy.’, Gynecol Endocrinol 29(5), 503–507.
Queste pubblicazioni sono state accettate per la pubblicazione nel corso del mio terzo anno (2013) di dottorato ma non ancora pubblicate:
• Bertozzi, S.; Londero, A. P.; Giacomuzzi, F.; Angione, V.; Carbone, A.; Petri, R. & Bernardi, S. (2013), ’Applicability of two different validated models to predict axillary non-sentinel lymph node status by sentinel node biopsy in a single Italian center.’, Breast Cancer (Tokyo).
• Rossi, A.; Bortolotti, N.; Vescovo, S.; Romanello, I.; Forzano, L.; Londero, A. P.; Ambrosini, G.; Marchesoni, D. & Curcio, F. (2013), ’Ischemia-modified albumin in pregnancy.’, Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol.
• Fruscalzo A, Londero A, Fröhlich C, Meyer-Wittkopf M, Schmitz R. Quantitative elastography of cervix for predicting labor induction success. Ultraschall Med. (Accepted for publication in Ultraschall Med)
• Cedolini C.; Bertozzi S.; Seriau L.; Londero A. P.; Concina S.; Cattin F.; Geatti O.; Di Loreto C. & Risaliti A. (2013) Eight-year experience with the intraoperative frozen section examination of sentinel lymph node biopsy for breast cancer in a North-Italian university center. Int J Clin Exp Pathol (accepted for pubblication).
• Londero, A. P.; Orsaria M.; Tell G.; Marzinotto S.; Capodicasa V.; Poletto M.; Va-scotto C.; Sacco C. & Mariuzzi L. (2013) Expression and prognostic significance of APE1/Ref1 and NPM1 proteins in high-grade ovarian serous cancer. American Journal of Clinical Pathology (accepted for publication).
Parte 1
Introduzione allo studio
1.1
Premesse
L’analisi dei fattori biochimici e molecolari responsabili dell’evoluzione delle patologie ostetriche derivate da una alterata funzione placentare sono in corso da molti anni con scopi diversi, tra cui la comprensione eziopatogenetica dell’origine della disfunzione placentare. Questo tipo di conoscenze potrebbe infatti avere importanti applicazioni terapeutiche, come ad esempio l’individuazione di fattori prognostici che permettano una migliore gestione della gravidanza ed un miglioramento degli esiti materno-fetali, e lo sviluppo di metodiche di screening primario per individuare una popolazione ad alto rischio da trattate con farmaci profilattici. Il professore Marchesoni ed il suo gruppo già all’inizio dell’ultimo ventennio dello scorso secolo erano impegnati nell’analisi di questi fattori sopratutto per quanto riguarda lo studio di marcatori biochimici utili nel monitorare l’andamento delle gravidanze nel terzo trimestre di gravidanza [1].
Tuttavia, da quegli anni sono stati fatti molti passi in avanti ed abbiamo assistto allo sviluppo di un concetto molto interessante che accompagna l’introduzione di un diverso modello di monitoraggio ed assistenza della gravidanza. Nel nostro attuale modello in Italia, così come in molti altri paesi europei, il monitoraggio della gravidanza prevede una valutazione iniziale nel corso del primo trimestre e poi un incremento nella frequen-za dei controlli all’aumentare dell’epoca gestazionale. Questo lo si può evincere dalla lista dei controlli inclusi nel programma di rimborso del sistema sanitario nazionale sta-biliti nel decreto ministeriale del 10 settembre 1998 a firma del ministro Bindi (Allegato X). Questo modello di monitoraggio prevede dei controlli che diventano estremamente ravvicinati in prossimità del parto in quanto è l’epoca a maggior rischio di manifestazioni patologiche.
1.1 Premesse
Grazie all’introduzione e alla diffusione di nuove tecnologie negli ultimi anni sono stati fatti molti progressi per quanto riguarda la comprensione, la diagnosi ed la gestione della gravidanza, anche e soprattutto grazie alle importanti ricerche dei gruppi del professor professor Nicolaides (Londra) e del professor Romero (Detroit). In particolare, l’opi-nione del professor Nicolaides è quella di capovolgere l’attuale modello piramidale di monitoraggio e gestione della gravidanza sulla base della capacità di predire l’insorgen-za in gravidanl’insorgen-za di patologie ipertensive, IUGR, parto pretermine ed altre ancora già a partire dalle indagini fatte nel primo trimestre di gravidanza (figura 1.1) [2].
Questo nuovo modello di monitoraggio consente ovviamente la diagnosi di patologie della gravidanza in un momento adeguato per iniziare una terapia curativa o preventiva, individuando gruppi ad alto rischio di patologia ostetrica da sottoporre a monitoraggio intensivo e a misure profilattiche. Ad esempio, nel caso della patologia pre-eclamptica, la profilassi con acido acetil salicidico sembra essere sembra essere un trattamento far-macologico efficace da usare nella prevenzione se iniziato prima della sedicesima setti-mana gestazionale [3–5]. Ciononostante, sono ancora molte le domande che aspettano una risposta sullo screening della pre-eclampsia associato ad un trattamento preventivo con basse dosi di acido acetil salicidico (75 mg, 150 mg o 400 mg) nel ridurre il rischio di preeclampsia [6]. Per queste ragioni, attualmente è in corso uno studio randomizzato controllato (ISRCTN13633058 – DOI 10.1186/ISRCTN13633058) in cui viene indivi-duata una popolazione ad alto rischio utilizzando informazioni anamnestiche unitamente allo studio di marcatori precoci (preclinici) di malattia nel siero materno e misurazioni ecografiche oltre che della pressione arteriosa materna.
Figura 1.1: Nuovo modello di gestione della gravidanza proposto da Nicolaides [2].
Parte 1. Introduzione allo studio
1.2
Funzionalità cellulare e senescenza cellulare
La senescenza cellulare fa parte del ciclo vitale di qualsiasi forma di vita. Anche la placenta si forma cresce, espleta le sue molteplici funzioni (regolazione endocrina, nu-trimento del feto, eccetera) ed invecchia. È palese come il ciclo vitale della placenta duri il corso di una gravidanza e come per tutti gli organismi esso possa variare; così come esistono, infatti, esseri viventi che per varie vicissitudini invecchiano più in fretta di altri, allo stesso modo probabilmente ci sono placente che danno segni di senescenza più velocemente di altre.
L’invecchiamento della cellula ne determina delle disfunzioni che la portano ad autoter-minarsi mediante apoptosi, con conseguente invecchiamento delle strutture e dei tessuti e quindi degli organi. Quindi per mantenere la funzione dell’organo è richiesta la forma-zione di nuove cellule tramite la mitosi. La lunghezza dei telomeri e la funzionalità delle telomerasi limitano le potenzialità riproduttive della cellula. La placenta in particolare è un organo che può essere correlato a diverse patologie: diabete gestazionale, ipertensio-ne gestazionale, pre-eclampsia, ritardo di crescita intrauterino, morte fetale endouterina, parto pretermine. Ed in ognuna di queste patologie vi sono dei processi patogenetici non ancora del tutto noti.
La funzionalità placentare ed il suo invecchiamento, un tempo valutati da un punto di vista morfologico ed ecografico, sono stati solo parzialmente studiati da un punto di vista proteico e molecolare. Recenti studi supportano il ruolo dei telomeri e delle telomerasi nella pre-eclampsia e nel ritardo di crescita intrauterino. Scoperti agli inizi degli anni ’80 da Blackburn, Greider e Szostak, i telomeri sono delle sequenze di DNA con una struttura che protegge i cromosomi dall’erosione del loro patrimonio genetico, mentre la telomerasi è un enzima coinvolto nella riparazione dei telomeri [7, 8].
Secondo Biron-Shental e collaboratori i telomeri sono più corti nelle pazienti con pre-eclampsia e IUGR, inoltre nella sola pre-pre-eclampsia vi è una maggiore aggregazione telo-merica, per questa ragione ipotizzano diffrenti tipi di stress che agiscono sulla placenta delle gravidanze complicate da pre-eclampsia e da IUGR [9]. Ancora, Izutsu e col-laboratori trovano una ridotta espressione di telomerasi nelle placente di feti IUGR, e osservano come l’attività delle telomerasi tenda a diminuire nel corso della gravidanza tra il primo ed il terzo trimestre [10, 11]. Lo stesso dato sull’attività delle telomerasi è stato proposto da un’altro gruppo di studio, che ne ha osservato una ridotta attività negli
1.2 Funzionalità cellulare e senescenza cellulare
IUGR [12].
Un’altra importante rivelazione degli ultimi decenni sono state le cellule staminali, cel-lule multipotenti capaci di autorinnvarsi e di differenziarsi in tutte le celcel-lule originate da una stessa linea cellulare, ed anche a livello placentare è stata dimostrata la presenza di cellule staminali. Se già dagli anni ’70 alcuni gruppi di ricercatori avevano avuto l’idea che potessero esistere cellule staminali placentari, esse sono state rinvenute e coltivate in vitro dal gruppo di Tanaka e collaboratori nel 1998 [13].
La senescenza delle cellule staminali riveste un ruolo centrale nel processo dell’invec-chiamento, in quanto il compito principale delle cellule staminali adulte è quello di rin-novare le cellule dei tessuti che muoiono fisiologicamente e di riparare i tessuti danneg-giati conservandone, se così si può dire, la giovinezza [14]. Il ruolo della senescenza delle cellule staminali nell’invecchiamento risulta perciò direttamente proporzionale al contributo di queste all’omeostasi dei tessuti adulti [15].
Inoltre, con l’avanzare dell’età, l’attività funzionale delle cellule staminali residenti in un tessuto sembra ridursi in maniera progressiva e non completamente riconducibile alla sola senescenza intrinseca delle stesse, bensì anche alle modificazioni del contesto in cui esse si collocano. Infatti, le cellule staminali adulte interagiscono in modo dinamico con l’ambiente in cui si trovano a livelli crescenti di complessità, che possono essere riassunti in maniera gerarchica dall’elemento più semplice a più complesso some segue: cellula, microambiente (nicchia), organismo e ambiente esterno [15].
Partendo dal presupposto che la senescnza cellulare sia il risultato dell’accumulo pro-gressivo di danni alle macromolecole intracellulari, il danno genomico, ovvero il danno molecolare a carico del DNA, rappresenta una delle principali cause della senescenza cellulare [16]. Ed in effetti, mentre RNA e proteine hanno un alto ricambio, il DNA non è generalmente soggetto a turnover. Dall’altro canto però, mutazioni spontanee interes-sano il DNA ogni istante e, nonostante i potenti meccanismi di riparo, a volte alcune mutazioni persistono e si accumulano.
Se da un lato questo meccanismo è risultato estremamente vantaggioso nel corso dell’e-voluzione per selezionare tra le cellule quelle le cui qualità acquisite potevano migliorare l’esistenza di un determinato organismo, dall’altro lato le mutazioni sono nella maggior parte dei casi dannose per la sopravvivenza di una cellula, comportandone a lungo andare danni tali per cui essa decide di autosidtruggersi mediante apoptosi. Il meccanismo
Parte 1. Introduzione allo studio
l’apoptosi è di fatto fondamentale per mantenere un organismo in salute, e quando viene a mancare per un danno genomico a carico delle molecole coinvolte nell’apoptosi stessa, le cellule danneggiae possono andare incontro ad una proliferazione incontrollata, nota con il nome di cancro, che con il passare del tempo va a sostituire un tessuto o un or-gano, spesso compromettendo la sua funzione, nonché la sopravvivenza dell’organismo stesso.
A livello cellulare, il danno genomico, responsabile dello sviluppo del fenotipo sene-scente, è determinato da varie cause, distinguibili in intrinseche (o endogene) ed estrin-seche (o esogene). Tra le prime, i metaboliti reattivi dell’ossigeno (ROS) rappresentano la causa di danno più frequente. In questo gruppo sono ascrivibili anche le mutazioni spontanee, che si verificano durante la replicazione del DNA e l’accorciamento dei telo-meri. I raggi ultravioletti (UV) e gli agenti chimici alchilanti (come ad esempio alcuni farmaci antiblastici) sono invece cause estrinseche di senescenza cellulare. I danni al DNA si traducono nell’attivazione di geni oncosoppressori (p53, p16INK4a o Rb) che, a loro volta, conducono all’apoptosi e alla senescenza cellulare, con la conseguente perdita della capacità proliferativa del comparto staminale presente nei tessuti [17].
Se la diminuzione della riserva funzionale delle cellule staminali supera la capacità di autorinnovarsi e di produzione delle cellule mature, si verifica uno sbilanciamento del-l’omeostasi tissutale ed una riduzione del potenziale rigenerativo che sono caratteristiche dell’invecchiamento di un tessuto. In questo modo si spiega l’invecchiamento della cute con l’età, che perde la maggior parte delle sue caratteristiche, quali elasticità, omogeneità della pigmentazione, etc.
I telomeri sono strutture specializzate della cromatina presenti alle estremità dei cromo-somi delle cellule degli oranismi eucarioti la cui funzione principale è di proteggere le estremità cromosomiche dalla degradazione, impedendo che la porzione finale del cro-mosoma stesso sia riconosciuto come un danno al DNA. Le telomerasi, invece, sono enzimi deputati alla conservazione dei telomeri nel DNA, presenti ad alti livelli durante la vita embrionale, ma la cui espressione, invece, diminuisce fino a quasi scompari-re durante la vita post-fetale. Alcune sindromi umane escompari-reditarie, quali la discheratosi congenita, l’anemia aplastica e la fibrosi polmonare idiopatica, sono caratterizzate da mutazioni nei geni della telomerasi e si associano ad un accorciamento telomerico molto accelerato.
Anche patologie umane non associate a mutazioni a carico dell’apparato deputato al
1.2 Funzionalità cellulare e senescenza cellulare
mantenimento della lunghezza e della struttura dei telomeri sono caratterizzati da un accelerato accorciamento dei telomeri; ne sono un esempio le malattie cardiovascolari, le infezioni e la cirrosi epatica [18]. L’accorciamento dei telomeri è influenzato inoltre da altri fattori, quali fumo di sigaretta, obesità e stress, tutti accomunati dalla produzione di radicali reattivi dell’ossigeno [19].
In assenza della telomerasi, ogni replicazione del DNA determina accorciamento dei telomeri, dovuto all’incapacità della DNA polimerasi di sintetizzare completamente l’e-stremità del filamento di DNA lagging (end replication problem) [20]. L’accorciamento dei telomeri destabilizza il loop telomerico favorendo l’alterazione del telosoma (uncap-ping). La disfunzione telomerica che così viene a determinarsi è riconosciuta dall’ap-parato proteico deputato al riparo dei danni genomici, come foci di rottura della doppia elica (double strand DNA break), a cui si associano determinate proteine, come ad esem-pio la forma fosforilata dell’istone H2A.X [21] e la 53 Binding Protein 1 (53BP1) [22]. Questi foci di danno sono stati definiti Telomere dysfunction Induced Foci (TIF) [23]. Questa ipotesi è stata verificata dal gruppo di d’Adda di Fagagna che ha valutato la frazione di cellule contenenti almeno un focus di danno del DNA in colture di fibroblasti umani portati a senescenza (MRC5 e BJ), utilizzando il saggio di immuno-FISH con anticorpi anti-y-H2A.X e 53BP1: le frazioni con foci di danno al DNA aumentavano gradualmente dal 10% al 20% in colture cellulari proliferanti, mentre arrivavano a 80% in colture cellulari senescenti, per tornare poi a livelli di 10-20% in fibroblasti hTERT-immortalizzati [21].
I TIF rappresentano la risposta alla disfunzione telomerica che si trova più a monte. Questi foci attivano le chinasi ATM e/o ATR che, a loro volta, stimolano una cascata a valle, arrivando alla fine a stabilizzare p53 e up-regolare p21. I TIF, quindi, causano un arresto del ciclo cellulare e/o apoptosi, determinando la diminuzione della funzione e del numero delle cellule staminali adulte, e sbilanciando inesorabilmente l’equilibrio omeostatico dei tessuti.
La proteina p53 è un fattore di trascrizione centrale nella cascata di risposta al danno del DNA, ampiamente studiato per la sua funzione di oncosoppressore, la cui perdita della funzione è stat riscontrata in diversi tipi di tumori [24] e nella sindrome di Li Fraumeni [25]. p53 svolge numerose funzioni tra cui attivazione/repressione della trascrizione, inibizione della traduzione di alcuni RNA messaggeri [26], azione esonucleasica sul DNA [27] ed individuazione e riparazione dei danni genomici [28]. Una volta attivata,
Parte 1. Introduzione allo studio
p53 esercita la sua funzione di con diverse modalità: stimolazione della trascrizione di geni coinvolti nell’apoptosi, quali BAX [29], il cui prodotto è una proteina proapoptotica della famiglia di Bcl2 che favorisce il rilascio del citocromo c da parte del mitocondrio, attivando così la cascata apoptotica [30] oppure l’attivazione della trascrizione di p21 per arrestare la cellula in fase G1 e riparare il danno al DNA [25].
La proteina p21 è un inibitore delle chinasi ciclino-dipendente (CDKI) della famiglia Cip1/Kip1, a cui appartengono anche p27Kip1 e p57Kip2. In particolare la proteina p21 blocca l’attività di CDK-2, CDK-4 e CDK-6. Queste chinasi, insieme con le rispettive ci-cline, fosforilano la proteina Rb (retinoblastoma). Rb è un repressore trascrizionale che, nello stato ipofosforilato, si lega al fattore trascrizionale E2F, bloccando l’espressione dei geni di fase S. La fosforilazione di Rb mediata dal complesso ciclina D1/CDK-4/6 e ciclina E/CDK-2, durante la progressione in fase G1, determina il rilascio di pRb da E2F consentendo la trascrizione dei geni di fase S e la transizione G1/S (Figura 1.30). La proteina p21 interagisce con il complesso ciclina E/CDK-2 portando ad un accumulo di Rb ipofosforilato, incapace di legarsi ai fattori E2F con conseguente blocco cellulare in fase S. Una proprietà chiave di p21 che distingue questa proteina dagli altri CDKI è la sua capacità di legarsi a PCNA. PCNA è un fattore ausiliario della DNA polimerasi delta ed è quindi essenziale per il riparo del mismatch replicativo. Per cui la proteina p21, interagendo con PCNA, determina inattivazione della replicazione del DNA media-ta da PCNA bloccando quindi la progressione cellulare in fase G1/S, S e G2/M. L’im-portante ruolo svolto da p21 nel controllo del ciclo cellulare richiede una sua accurata regolazione.
Oltre a p53, fattori di crescita, citochine tra cui TGF-beta, glucocorticoidi e retinoidi, regolano positivamente i livelli di questa proteina. Come già descritto, p21 è uno dei target di p53. Senza p21, p53 non può arrestare il ciclo in G1 in fibroblasti embrionali di topo con danno al DNA in seguito a radiazioni ionizzanti. In base ai risultati ottenuti finora da diversi studi, nel processo di senescenza delle cellule staminali, p21 svolge un duplice ruolo. Da un lato questa proteina protegge le cellule staminali da stress acuti genotossici, impedendo alle cellule staminali danneggiate di entrare in ciclo e quindi garantendo la conservazione del pool. Dall’altro, l’attivazione di p21, p53 mediata, in risposta alla disfunzione telomerica porta ad un depauperimento della riserva staminale inducendo l’arresto del ciclo cellulare o un prematuro differenziamento [31].
I danni da stress ossidativo, incluse le modificazioni a carico del DNA e delle proteine,
1.2 Funzionalità cellulare e senescenza cellulare
oltre che ai meccanismi di riparo del DNA, sembrano giocare un ruolo fondamentale nel-le patologie ostetriche di origine placentare tra cui la pre-eclampsia e lo IUGR [32–35]. In questo lavoro concentriamo la nostra attenzione anche sull’espressione immunoisto-chimica di una proteina coinvolta nei meccanismi di riparazione del DNA: APE1/Ref-1 (APE1). Ed inoltre valutiamo anche l’espressione tissutale di un marcatore che mette in evidenza la presenza di DNA ossidato: 8-idrossi-2’-deossi-guanosina (8-OHdG). Infatti, anche le alterazioni a carico dei meccanismi di riparazione dei danni al DNA sembrano essere implicate nelle patologie della gravidanza [36]. Inoltre, APE1 ha anche un ruolo nel mantenimento dei telomeri che abbiamo visto essere probabilmente coinvolti nelle patologie di origine placentare della gravidanza [37].
La riparazione per escissione di basi del DNA (BER - DNA Base Excision repair) è una via che ripara i danni al DNA causati da vari agenti tra cui le radiazioni ionizzanti o i processi legati allo stress ossidativo. Questo sistema prevede la generazione di siti abasi-ci (AP) [38–42]. APE1 è la prinabasi-cipale endonucleasi apurinica/apirimidinica nelle cellule di mammifero e catalizza la rimozione del sito abasico, inoltre è un fattore limitante nel-la BER [43]. APE1 esplica nel-la sua funzione principalmente idrolizzando al 5’ il legame fosfodiestere del sito AP generando in questo modo un DNA intermedio che contiene un solo punto di discontinuità con un termine 3’- idrossile ed un deossi-ribosio-5’-fosfato ( 5’-dRp). Tuttavia, APE1 può generare un termine 3’- idrossile in altri modi: attraverso la sua attività 3’- 5’-esonucleasica APE1 può rimuovere un 3’-fosfo-a,b-aldeide insatura, formata da glicosilasi complesse e dalle radiazioni [38]. APE1 può anche rimuovere il 3’-fosfato terminale (attraverso la sua attività di 3’-fosfatasi), prodotto dalle glicosilasi NEIL1 e NEIL2 [43]. In questo modo APE1 ha una responsabilità centrale per l’incisio-ne dei siti AP e la gel’incisio-neraziol’incisio-ne di un termil’incisio-ne 3’-OH, che rappresenta un primer per Pol-b [38].
Mentre APE1 presenta un ruolo essenziale in BER [44], ha anche delle funzini secon-darie ed indipendenti dalla prima ad esempio come fattore ossidoriducente o come co-attivatore di numerosi fattori di trascrizione quali NF-kB . Essa svolge, quindi, un ruolo causale in una serie di processi infiammatori [44, 45].
Parte 2
Lo studio
L’obiettivo principale di questo studio è quello di valutare l’espressione di alcune pro-teine legate all’invecchiamento cellulare ed allo stress ossidativo nelle placente di gra-vidanze sane e di gragra-vidanze affette da patologie di verosimile origine placentare. A questo proposito abbiamo analizzato l’espressione proteica di p21, p53 ed APE1. Inol-tre, abbiamo analizzato anche un marcatore indicativo di danno da stress ossidativo alla doppia elica del DNA.
2.1
Materiali e metodi
2.1.1 Preparazione del microarray di tessuto
Questo è uno studio retrospettivo che indaga l’espressione immunoistochimica di p21, p53, APE1 e 8-OHdg a livello placentare. Le placente da noi studiate provenivano dal-l’istituto di Patologia dell’Università di Udine e dell’Università di Muenster. Le placente studiate comprendevano:
• 28 placente provenienti da interruzione volontaria della gravidanza prima della 12a o della 22a settimana di gestazione;
• 13 placente da gravidanze normo-decorse eccetto per malformazioni gravi iso-late ed interrotte volontariamente secondo norma di legge presso l’Università di Muenster tra la 22a e al 34a settimana gestazionale;
• 51 placente provenienti da gravidanze con parto a termine ed un normale corso di gravidanza;
2.1 Materiali e metodi
• 36 placente da gravidanze affette da pre-eclampsia prima della 34a settimana di gestazione;
• 8 placente da gravidanze affette da pre-eclampsia associata a IUGR prima della 34a settimana di gestazione;
• 17 placente da gravidanze affette da IUGR prima della 34a settimana di gestazione;
• 6 placente da gravidanze affette da sindrome HELLP prima della 34a settimana di gestazione;
• 14 placente da gravidanze affette da pre-eclampsia dopo la 34a settimana gestazionale;
• 7 placente da gravidanze affette da pre-eclampsia e IUGR dopo la 34a settimana gestazionale;
• 18 placente da gravidanze affette da SGA dopo la 34a settimana gestazionale;
• 35 placente da gravidanze affette da IUGR dopo la 34a settimana gestazionale;
• 11 placente da gravidanze affette da IPG (ipertensione gestazionale) dopo la 34a settimana gestazionale;
• 6 placente da gravidanze affette da IPG e SGA dopo la 34a settimana gestazionale;
Ad eccezione delle placente dei controlli tra la 22a e al 34a settimana gestazionale, che sono state raccolte nell’istituto di Anatomia Patologica dell’Università di Muenster, tra i casi occorsi nel periodo dal gennaio 2001 al dicembre 2010 tutte le altre placente sono state identificate dal registro del Dipartimento di Anatomia Patologica dell’Università degli Studi di Udine sempre nel medesimo periodo dal gennaio 2001 al dicembre 2010. Per quanto riguarda le categorie di cui sopra sono state incluse tutte le placente di-sponibili nel periodo indicato dei casi in cui vi fosse completezza nella diagnosi clinica.
Tutte le gravidanze incluse nel nostro campione erano singole e le informazioni cliniche sono state raccolte dagli archivi clinici della Clinica di Ostetricia e Ginecologia di Udine e di Muenster. Abbiamo inoltre escluso tutte le gravidanze con le seguenti caratteri-stiche: gravidanze complicate da infezioni o distacco di placenta; gravidanze gemellari;
Parte 2. Lo studio
gravidanze con travaglio e parto pretermine in cui vi fosse il sospetto di un’infezione sot-tostante e tutte le gravidanze con anomalie cromosomiche note. Nei gruppi di controllo abbiamo inoltre escluso tutte le gravidanze con altre patologie ostetriche note.
Le sezioni dei blocchetti contenenti tessuto placentare fissato in formalina ed incluso in paraffina sono state colorate con ematossilina ed eosina (EE) e sono state attentamente esaminate prima di effettuare il campionamento per il microarray tissutale, che è stato fatto selezionando le aree placentari non coinvolte da infarto. Quindi abbiamo ottenuto due biopsie per ognuno dei blocchetti di paraffina identificati: le aree di interesse so-pra evidenziate sono state raccolte mediante un sistema di carotaggio costituito da un ago sottile e cavo a parete cilindrica (diametro interno di 1.5 mm) che ha consentito di trasferire i campioni nella matrice del blocco ricevente. In seguito dai blocchetti di mi-croarray tissutale che abbiamo ottenuto sono state ricavate delle sezioni trasversali di 4µ di spessore. Queste sezioni sono state in seguito collocate su un vetrino e colorate con EE. Per questo studio abbiamo utilizzato quattro sezioni e tutti i campioni inclusi erano valutabili.
Le sezioni sono state deparaffinate, reidratate e incubate con H2O2 per 10 minuti per
bloccare l’attività della perossidasi endogena. Lo smascheramento dell’antigene è stato eseguito in tampone citrato a pH 6 ed a una temperatura di 98°C. Le sezioni sono state lavate in PBS e poi incubate in una camera umida a temperatura ambiente per 60 minuti con i seguenti anticorpi: p21 (Calbiochem, diluito 1:25), p53 (Dako, diluito 1:100), 8-OHdg (JaICA, diluito 1:10) e APE1 (Novus, diluito 1:300) [46]. Successivamente i campioni vengono incubati con il reagente Dako REAL EnVision/HRP, Rabbit/Mouse per 30 minuti a temperatura ambiente. L’Attività della perossidasi (HRP) è stata rilevata utilizzando il substrato Dako REALE™ DAB + cromogeno (Dako , Glostrup , DK) per 3 minuti in conformità con le istruzioni del produttore. Quindi le sezioni sono state contrastate con Ematossilina di Gil prima del montaggio. Due patologi hanno eseguito indipendentemente l’analisi semi-quantitativa della colorazione immunoistochimica. I dati sono stati analizzati utilizzando R v3.0.1 considerando una p<0.05 come significa-tiva. Sono stati eseguiti dove opportuno: T-test, test di Wilcoxon, test di Kruskal-Wallis, test di Spearman, test del chi-quadro o test esatto di Fisher. Inoltre sono state esegui-te regressioni logistiche multivariaesegui-te. Per l’analisi medianesegui-te regressione logistica una espressione del marcatore prescelto superiore alla mediana della distribuzione è stata utilizzata come variabile dipendente.
2.2 Risultati
2.2
Risultati
2.2.1 Descrizione della popolazione
Nelle tabelle 2.1 e 2.2 riportiamo le caratteristiche generali della popolazione che abbia-mo studiato. In tabella 2.1 sono illustrate le caratteristiche delle gravidanze patologiche con parto <34 settimane gestazionali e dei controlli con un’epoca gestazionale <34 setti-mane. Si può notare come gli IUGR abbiano un peso significativamente ridotto. Inoltre, l’epoca gestazionale al termine della gravidanza risulta ridotta nei controlli tra la 22a e la 34a settimana gestazionale (tabella 2.1).
In tabella 2.2 sono riportate, suddivise tra i gruppi di studio, le caratteristiche delle gra-vidanze con parto dopo la 34a settimana gestazionale ed i relativi controlli. Come at-teso sono state evidenziate delle differenze significative a livello di: età materna, BMI pregravidico, epoca gestazionale al parto, peso neonatale, nulliparità e razza africana.
Parte 2. Lo studio T abella 2.1: Caratteristiche della popolazi o ne inclusa nello studio con insor genza della patologia tra la 22a e la 34a settimana gestazionale e nei controlli stratificati per pari epoca gestazionale. PE <34sg PE con IUGR <34 sg HELLP <34 sg IUGR <34 sg Controlli 22-34 sg p Numero di gra vidanze 36 8 6 17 13 Età materna (anni) 32.06 (± 6.99) 33.50 (± 5.26) 36.00 (± 5.55) 32.71 (± 5.7) 30.69 (± 6.36) 0.527 BMI pre gra vidico (kg/m 2) 24.52 (± 4.67) 23.17 (± 3.49) 24.40 (± 5.59) 21.92 (± 3.43) 24.15 (± 4.56) 0.486 Epoca gestazionale al parto (settimane) 30.03 (± 2.08) 31.00 (± 2.56) 30.50 (± 1.52) 28.94 (± 3.73) 27.51 (± 2.61) <0.05 Peso neonatale (grammi) 1380.36 (± 465.21) 1111.12 (± 335.71) 1333.33 (± 332.25) 975.71 (± 336) 1086.54 (± 629.85) <0.05 Peso placentare (grammi) 356.00 (± 127.81) 277.00 (± 90.17) 370.83 (± 114.91) 261.47 (± 106.12) 276.25 (± 99.91) <0.05 Indice placentare 0.27 (± 0.08) 0.25 (± 0.03) 0.28 (± 0.04) 0.27 (± 0.05) 0.33 (± 0.14) 0.194 Nulliparità 75% (27/36) 88% (7/8) 83% (5/6) 65% (11/17) 44% (4/9) 0.268 Etnia di appartenenza Caucasica 94% (33/35) 100% (8/8) 83% (5/6) 88% (15/17) 100% (13/13) 0.498 Africana 6% (2/35) 0% (0/8) 17% (1/6) 12% (2/17) 0% (0/13) 0.498 Sesso del neonato Femmina 36% (13/36) 25% (2/8) 50% (3/6) 41% (7/17) 80% (8/10) 0.112 Maschio 64% (23/36) 75% (6/8) 50% (3/6) 59% (10/17) 20% (2/10) 0.112 13
2.2 Risultati T abella 2.2: Caratteristiche della popolazione inclusa nello studio con insor genza della patologia dopo della 34a settimana gestazionale e nei controlli stratificati per pari epoca gestazionale. PE >34sg PE associata a IUGR >34sg SGA >34sg IUGR Controlli >34sg p Numero di gra vidanze 14 7 18 35 51 Età materna (anni) 32.79 (± 6.12) 36.71 (± 6.07) 33.89 (± 4.91) 31.41 (± 5.42) 31.06 (± 6.06) 0.081 BMI pre-gra vidico (kg/m 2 ) 25.62 (± 7.15) 24.17 (± 5.08) 20.93 (± 2.15) 22.03 (± 3.88) 22.63 (± 4.52) 0.07 Epoca gestazionale al parto (setti-mane) 37.13 (± 1.93) 35.57 (± 1.72) 37.50 (± 1.89) 37.79 (± 1.79) 38.00 (± 2.01) <0.05 Peso neonatale (grammi) 2645.71 (± 637.38) 1736.14 (± 563.4) 2340.72 (± 436.71) 2210.21 (± 448.28) 2954.48 (± 568.33) <0.05 Peso placentare (grammi) 524.62 (± 150.46) 366.43 (± 43.27) 450.67 (± 93.92) 410.76 (± 63.17) 514.29 (± 124.37) <0.05 Indice placentare 0.20 (± 0.04) 0.23 (± 0.06) 0.20 (± 0.06) 0.20 (± 0.07) 0.19 (± 0.04) 0.644 Nulliparità 62% (8/13) 43% (3/7) 89% (16/18) 74% (25/34) 75% (18/24) 0.169 Etnia di appartenenza Caucasica 86% (12/14) 86% (6/7) 100% (18/18) 91% (31/34) 98% (45/46) 0.242 Africana 14% (2/14) 14% (1/7) 0% (0/18) 9% (3/34) 2% (1/46) 0.242 Sesso del neonato Femmina 57% (8/14) 43% (3/7) 67% (12/18) 35% (12/34) 48% (20/42) 0.262 Maschio 43% (6/14) 57% (4/7) 33% (6/18) 65% (22/34) 52% (22/42) 0.262 14
Parte 2. Lo studio
Preparazione TMA
Figura 2.1: Processo di preparazione del TMA.
2.2 Risultati
2.2.2 Analisi immunoistochimica di p21, p53, APE1/REF1 e 8-OHdg nelle placente normali
In figura 2.2, considerando solo le gravidanze dei gruppi di controllo (normodecorse), è rappresentato l’andamento dell’espressione immunoistochimica delle proteine studiate in base all’epoca gestazionale. Da questa figura notiamo come p21 diminuisca in modo significativo con il crescere dell’epoca gestazionale mentre p53 non sia modificata in modo significativo. APE1 e 8-OHdg aumentano entrambe con l’aumentare dell’epoca gestazionale in modo significativo a livello nucleare. Inoltre, considerando l’espressione citoplasmatica di APE1 e 8-OHdg notiamo come APE1 aumenti in modo direttamente proporzionale con l’aumentare dell’epoca gestazionale mentre 8-OHdg diminuisca in modo inversamente proporzionale all’aumentare dell’epoca gestazionale. Anche queste due ultime correlazioni sono entrambe statisticamente significative (figura 2.2).
L’espressione di p21 e p53 sono significativamente correlate tra di loro in modo diretta-mente proporzionale, questo nonostante p21 sia più rappresentato rispetto a p53 (figura 2.3). In tabella 2.3 vediamo come nelle placente dei controlli sia in quelli tra la 22a e la 34a settimana gestazionale sia in quelli dopo la 34a settimana gestazionale, p21 sia espresso dalle tre alle dieci volte di più rispetto a p53. Inoltre, nelle placente dei control-li abbiamo trovato delle correlazioni direttamente proporzionacontrol-li e significative tra p53, APE1 e 8-OHdg ed una correlazione significativa ed indirettamente proporzionale tra p21 e 8-OHdg (figura 2.4).
Abbiamo, infine, valutato le correlazioni tra l’espressione degli elementi studiati in im-munoistochimica e l’indice placentare. Queste analisi sono riportate in figura 2.5 ed in figura 2.6. Da queste analisi dunque si evince che nei controlli c’è una correlazione indi-rettamente proporzionale e significativa tra p53 o 8-OHdg ed indice placentare (p<0.05) (figura 2.5). Studiando le stesse correlazioni tra i casi si evidenzia come rimanga signi-ficativa la correlazione con p53 ma venga persa la correlazione con 8-OHdg (figura 2.6). Inoltre, nei casi emerge una correlazione direttamente proporzionale significativa tra p21 ed indice placentare (figura 2.6).
Parte 2. Lo studio ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●● ● ● ● ● 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 40 50 60
Epoca gestazionale (settimane)
P ositività n uc leare a p21 (%) a) ● ● ● ● ●● ●● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ●●● ●● ● ●●● ● ●●●●●●●●● ●●●●● ●●● ●● ●●● ●●●●● ● ●●●●●●●● ● ●● ● ●●● ● ● ● ●●● ●●●●● ●● ●● ●● ●●● ●●● ● ●● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ●● ●●●● ● ● ● ● ● ● ●●●●● ● ●●● ●●● ●●●●●●● 10 15 20 25 30 35 40 0 10 20 30 40 50 60
Epoca gestazionale (settimane)
P ositività n uc leare a p53 (%) b) ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●●●●●● ●● ●● ●● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
Epoca gestazionale (settimane)
H−score n uc leare di APE1 10 15 20 25 30 35 40 0 100 200 300 c) ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●●●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
Epoca gestazionale (settimane)
H−score n uc leare di 8−OHdg 10 15 20 25 30 35 40 0 100 200 300 d) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●●●●●●●●●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
Epoca gestazionale (settimane)
Intensità citoplasmatica di APE1 10 15 20 25 30 35 40
0 1 2 3 e) ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ●●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●●● ● ● ● ● ●
Epoca gestazionale (settimane)
Intensità citoplasmatica di 8−OHdg 10 15 20 25 30 35 40
0
1
2
3
f)
Figura 2.2: Correlazione tra l’età gestazionale e l’espressione delle proteine studiate. A: posi-tività nucleare di p21 rho di Spearman = -0.350 (p <0.05). B: posiposi-tività nucleare a p53 rho di Spearman = 0.056 (p = 0.477). C: H-index nucleare di APE1 rho di Spearman = 0,418 (p <0.05). D: H-index nucleare di 8-OHdG rho di Spearman = 0,655 (p <0.05). E: intensità citoplasma di APE1 rho di Spearman = 0.230 (p <0.05). F: intensità citoplasma di 8-OHdG rho di Spearman = -0.322 (p <0.05).
2.2 Risultati ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● 0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 60 Positività nucleare a p53 (%) P ositività n uc leare a p21 (%) A B C 1
Figura 2.3: Espressione p21 e p53. A: correlazione tra espressione di p21 e p53 tra i controlli, rho di Spearman = 0.146 (p <0.05). B: Espressione immunoistochikica di p21. C: Epressione immunoistochimica di p53.
Parte 2. Lo studio ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ●● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● 0 50 100 200 300 0 10 20 30 40 50 60
H−score nucleare di 8−OHdg
P ositività n uc leare a p21 (%) a) ● ● ● ●●● ●●● ●● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●● ●●●●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●●●● ●●● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ●●● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ●● ●● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●●● 0 50 100 200 300 0 10 20 30 40 50 60
H−score nucleare di 8−OHdg
P ositività n uc leare a p53 (%) b) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●
H−score nucleare di 8−OHdg
H−score n uc leare di APE1 0 50 100 200 300 0 100 200 300 c) ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ●● ●● ● ● ●● ●●● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●
H−score nucleare di 8−OHdg
Intensità citoplasmatica di APE1
0 50 100 200 300 0 1 2 3 e)
Figura 2.4: Correlazione tra espressione immunoistochimica di 8-OHdg e le proteine studiate. A: correlazione con p21, rho di Spearman =-0.305 (p <0.05). B: correlazione con p53, rho di Spearman =0.288 (p <0.05). C: correlazione con APE1 nucleare, rho di Spearman =0.179 (p=0.058). D: correlazione con APE1 citoplasmatica, rho di Spearman =0.092 (p =0.332).
2.2 Risultati ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60 Indice placentare P ositività n uc leare a p21 (%) a) ● ● ●● ● ● ● ●●● ●●●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●●●●●●● ●●● ●●●●●●● ●●●● 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60 Indice placentare P ositività n uc leare a p53 (%) b) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Indice placentare H−score n uc leare di APE1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 c) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Indice placentare H−score n uc leare di 8−OHdg 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 d) ● ● ●● ● ● ● ● ●● ●●●●●● ●●●●●● ● ●●●● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ●● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Indice placentare
Intensità citoplasmatica di APE1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0 1 2 3 e) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●●●●● ● ● ●●●●●●●● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● Indice placentare
Intensità citoplasmatica di 8−OHdg 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0
1
2
3
f)
Figura 2.5: Correlazione tra espressione immunoistochimica degli elementi studiati e l’indice placentare. A: correlazione con p21, rho di Spearman =0.088 (p=0.463). B: correlazione con p53, rho di Spearman =-0.254 (p <0.05). C: correlazione con APE1 nucleare, rho di Spearman =0.065 (p=0.593). D: correlazione con 8-OHdg nucleare, rho di Spearman =-0.454 (p <0.05). E: correlazione con APE1 citoplasmatica, rho di Spearman =-0.136 (p =0.264). F: correlazione con 8-OHdg citoplasmatica, rho di Spearman =0.045 (p =0.714).
Parte 2. Lo studio ● ● ● ●●●●● ●●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●●● ●● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60 Indice placentare P ositività n uc leare a p21 (%) a) ● ● ● ●●●●●●●●● ●●●●●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●●●●●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●●● ●●● ●●●●●● ●●●● ●●●●●●● ●●●● ● ● ● ● ●●●●●●●● ●●●●●● ● ●●●● ●● ●●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●●●●●●●●●●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●●● ●●●● ● ● ● ● ● ● ●●●●●● ● ● ●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ●● ●●●●● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●●● ●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●● ● ● ● ● ●● ●●●● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●● ● ●●● ●●●●●●●●●●●●● ● ● ● ● ● ●●●● 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 10 20 30 40 50 60 Indice placentare P ositività n uc leare a p53 (%) b) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ●● Indice placentare H−score n uc leare di APE1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 c) ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●●●●●● ● ●●●● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● Indice placentare H−score n uc leare di 8−OHdg 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 d) ● ● ● ● ● ●●● ●● ●●●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●●● ●●●●● ●●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●●●● ● ● ● ● ●●●●●●●●● ● ● ●● ● ● ● ●●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ●●● ●●●●● ●●●●● ● ● ●●● ●●●●●● ● ●●●● ●● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●● ●●● ● ● ● ●●●●●●●●●● ●●●●●●●●●●●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ●● ●●●●● ●●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ● ●● ●● ●● ● ● ● ●●● ●●●● ● ● ●● ● ●● ● ● ●●●●● ●● ●● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ●●●●●●● ● ●● Indice placentare
Intensità citoplasmatica di APE1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0 1 2 3 e) ● ● ● ●●● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ●● ● ● ● ●● ● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ●●● ● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ●●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ●●● ●● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ● ●●●●● ●●● ●●●● ●●● ● ● ● ●●●● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ●● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ● ● ●● ●●●● ●● ●● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ●●● ● ● ● ● ● ● ● ● ●● ● ● ●● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ●●●●●●● ● ● ●●●● Indice placentare
Intensità citoplasmatica di 8−OHdg 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0
1
2
3
f)
Figura 2.6: Correlazione tra espressione immunoistochimica degli elementi studiati e l’indice placentare. A: correlazione con p21, rho di Spearman =0.179 (p<0.05). B: correlazione con p53, rho di Spearman =-0.096 (p=0.05). C: correlazione con APE1 nucleare, rho di Spearman =-0.018 (p=0.733). D: correlazione con 8-OHdg nucleare, rho di Spearman =-0.023 (p =0.649). E: correlazione con APE1 citoplasmatica, rho di Spearman =0.013 (p =0.799). F: correlazione con 8-OHdg citoplasmatica, rho di Spearman =-0.096 (p =0.051).
2.2 Risultati T abella 2.3: Analisi mono v ariata dell’espressione immunoistochimica delle proteine considerate in questo studio. (A) PE <34 sg PE e IUGR <34 sg HELLP <34 sg IUGR <34 sg Controlli >22 sg e <34 sg p Positi vità nucleare a p21 (%) 7 (4-15) 5 (2-15) 7 (2-11) 7 (5-11) 10 (5-10) 0.759 Positi vità nucleare a p53 (%) 1 (1-3) 1 (1-2) 2 (0-4) 1 (1-2) 1 (0-1) <0.05 H-score nucleare di APE1 40 (20-100) 25 (12-68) 70 (30-100) 30 (10-40) 30 (20-32) 0.053 Intensità citoplasmatica di APE1 1 (1-1) 1 (1-1) 1 (1-1) 1 (1-1) 0 (0-1) <0.05 H-score nucleare di 8-OHdg 140 (10-160) 90 (40-188) 130 (10-172) 90 (25-155) 10 (0-40) <0.05 Intensità citoplasmatica di 8-OHdg 1 (1-2) 2 (1-2) 1 (1-1) 2 (1-2) 1 (1-2) 0.141 (B) PE >34 sg PE e IUGR >34 sg SGA >34 sg IUGR >34 sg Controlli >34 sg p Positi vità nucleare a p21 (%) 2 (2-5) 9 (3-13) 6 (3-9) 5 (3-12) 3 (2-6) <0.05 Positi vità nucleare a p53 (%) 2 (1-2) 3 (2-3) 2 (1-3) 2 (1-3) 1 (1-3) <0.05 H-score nucleare di APE1 50 (28-85) 75 (45-130) 20 (10-30) 20 (10-30) 20 (20-70) <0.05 Intensità citoplasmatica di APE1 1 (1-1) 1 (1-1) 1 (1-1) 1 (1-1) 1 (1-1) <0.05 H-score nucleare di 8-OHdg 120 (60-150) 135 (90-198) 160 (60-225) 80 (40-160) 140 (60-210) 0.107 Intensità citoplasmatica di 8-OHdg 1 (1-2) 2 (1-2) 1 (1-1) 1 (1-2) 1 (1-2) 0.108 22
Parte 2. Lo studio
2.2.3 Analisi immunoistochimica di p21, p53, APE1 e 8-OHdg nella patologia ostetrica di origine placentare iniziata prima della 34a settimana gestazionale e nei controlli
In tabella 2.3A abbiamo riportato l’espressione immunoistochimica delle proteine stu-diate tra i vari gruppi di patologie e controlli che hanno partorito prima delle trentaquattro settimane gestazionali. Principalmente le differenze che abbiamo riscontrato risiedono nell’espressione di p53, APE1 e 8-OHdg (tabelle 2.3 e 2.4). In particolare, la positività a p53, l’H-score nucleare di 8-OHdg e l’intensità citoplasmatica di APE1 sono più alte in tutti i gruppi di patologia considerati rispetto ai controlli. Mentre l’H-score nucleare di APE1 è significativamente aumentato solo nelle pre-eclampsie e nelle HELLP rispetto ai controlli.
Abbiamo in seguito analizzato le differenze tra i vari gruppi di patologia trovando che nella pre-eclampsia e nella HELLP APE1 nucleare fosse significativamente più espresso rispetto allo IUGR. Dall’altro lato, non abbiamo trovato differenze significative a livello di espressione nucleare di 8-OHdg, la cui espressione risulta genericamente maggiore nella patologia che nei controlli; mentre a livello citoplasmatico 8-OHdg negli IUGR ri-sulta più espresso rispetto a HELLP e pre-eclampsia (p=0.071 e p<0.05 se consideriamo solo la HELLP).
In tabella 2.3 possiamo notare come l’analisi delle varianze evidenzi delle differenze significative a livello di espressione citoplasmatica di APE1 senza che le mediane si discostino eccessivamente. Per questa ragione abbiamo fatto un’analisi di quanti fossero i casi in cui fosse presente espressione citoplasmatica di APE1 rispetto a quelli dove non ci fosse. L’espressione citoplasmatica di APE1 è risultata del 29% tra i controlli per cui significativamente più bassa rispetto ai casi: 99% nella pre-eclampsia; 100% nella HELLP; 85% nella PE con IUGR e 87% nello IUGR. Infine, la presenza di APE1 citoplasmatica è maggiore nella eclampsia rispetto allo IUGR (p<0.05) o alla pre-eclampsia associata a IUGR (p=0.067). Per quanto riguarda le HELLP le differenze non risultano statisticamente significative rispetto agli IUGR.
