Materiali e metodi
La struttura di tutti i composti è stata verificata per mezzo della spettrometria di massa e 1H-NMR.
Gli spettri di massa sono stati registrati con uno spettrometro GC/MS Trace GCQ Plus per introduzione diretta di un’energia nominale di 70 eV con programmata del Dep da 50 a 350 °C.
Gli spettri di risonanza magnetica nucleare protonica sono stati eseguiti con uno spettrometro Varian Gemini 200 operante a 200 MHz e riferiti al segnale residuo del solvente. I chemical shift δ sono espressi in ppm e le costanti di accoppiamento J sono espresse in Hz.
Lo spettro NOE è stato effettuato usando un NMR Varian Inova 600, operante a 600 MHz.
Le evaporazioni sono state eseguite sotto vuoto in evaporatore rotante.
Le TLC analitiche sono state eseguite usando lastrine di gel di silice 60 F254 (MERCK)
contenenti un indicatore fluorescente; le varie macchie sono state evidenziate per mezzo di una lampada UV (254 nm).
Per le cromatografie su colonna è stato usato gel di silice 60 (0.040-0.063 mm) (MERCK).
Le procedure assistite dal microonde sono state effettutate con CEM Discove® LabMate™ Microwave.
Sintesi del composto 17
Cl BrCH2
MeO
2-bromometil-3-cloroanisolo
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli, in cui sono stati introdotti il 2 metil-3-cloroanisolo commerciale (3.0 g, 19.15 mmoli), NBS (5.08 g, 28.54 mmoli) e il perossido di benzoile (695.8 mg, 2.87 mmoli). Come solvente è stato usato il CCl4 (303.7
ml). La reazione è stata lasciata a riflusso per 3 h a 90-95 °C, sotto agitazione magnetica. Dopo raffreddamento fino a t. a., la miscela è stata lavata, in imbuto separatore, con una soluzione acquosa di tiosolfato sodico (per neutralizzare l’eventuale Br2 formatosi). La
fase organica è stata quindi lavata con una soluzione satura di bicarbonato di sodio (per neutralizzare l’eventuale HBr liberato), poi essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed infine
evaporata. Il grezzo così ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 9:1.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 3.41 g (14.46 mmoli) del composto 17 puro come olio giallastro (resa 76 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.90 (s, 3H); 4.72 (s, 2H); 6.80 (d, 1H, J = 8.2Hz); 7.0 (d,
Sintesi del composto 18
Cl AcOCH2
MeO
2-cloro-6-metossibenzilacetato
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli munito di refrigerante e tappo a cloruro di calcio, in cui è stata introdotta una soluzione del composto 17 (3.41 g, 14.46 mmoli) in AcOH (289.2 ml). Dopo aver riscaldato a 100 °C, è stato aggiunto AcONa (11.8 g, 144.5 mmoli) e la miscela risultante è stata lasciata a riflusso per circa 3 h sotto agitazione magnetica.
Dopo raffreddamento fino a t. a., la miscela di reazione è stata diluita con acqua, trasferita in imbuto separatore ed estratta con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo (2.54 g) che, dall’analisi 1
H-NMR, è risultato essere costituito esclusivamente dal prodotto 18 puro solido. Di conseguenza, si è proceduto al passaggio successivo senza ulteriore purificazione.
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 2.08 (s, 3H); 3.85 (s, 3H); 5.30 (s, 2H); 6.82 (d, 1H, J = 8.2
Sintesi del composto 19
Cl HOCH2
MeO
(2-cloro-6-metossifenil)-metanolo
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli munito di refrigerante e tappo a cloruro di calcio, in cui è stato introdotto il composto 18 (2.54 g, 11.84 mmoli) e THF (109.1 ml), sotto agitazione magnetica. Dopo completa dissoluzione, è stata aggiunta una soluzione acquosa di NaOH al 20% (18 ml) ed infine MeOH (72.5 ml). La reazione è stata quindi rifluita per 3 h.
Dopo raffreddamento fino a t. a., è stato aggiunto HCl 1N (per neutralizzare l’NaOH in eccesso) e acqua. Il tutto è stato trasferito in imbuto separatore ed estratto con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è
stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/AcOEt 8:2.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 1.62 g (9.40 mmoli) del composto 19 puro come solido giallo (resa 80 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.87 (s, 3H); 4.87 (s, 2H); 6.81 (d, 1H, J = 8.2 Hz); 7.0 (d,
Sintesi del composto 20
Cl
MeO O
2-cloro-6-metossibenzaldeide
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli munito di refrigerante e tappo a cloruro di calcio, in cui è stato introdotto il composto 19 (1.62 g, 9.40 mmoli) e toluene (209.3 ml). Dopo riscaldamento a 50 °C, è stato aggiunto MnO2 (18.34 g, 211mmoli) e la
miscela è stata lasciata a riflusso per 1 h sotto agitazione magnetica.
La soluzione (ancora calda) viene filtrata sotto vuoto, usando AcOEt caldo per effettuare lavaggi sia del pallone sia del precipitato. Il filtrato è stato evaporato fornendo un grezzo che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, CH2Cl2.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 395.3 mg (2.32 mmoli) del composto 20 puro come solido giallo (resa 24 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.92 (s, 3H); 6.91(d, 1H, J = 8.4 Hz); 7.04 (d, 1H, J = 8.1
Sintesi del composto 21
Cl Br MeO O 3-bromo-2-cloro-6-metossibenzaldeideIl composto 20 (395.3 mg, 2.32 mmoli) è stato dissolto nella minima quantità di AcOH glaciale, all’interno di un palloncino. È stato quindi aggiunto Br2 (0.13 ml) e la miscela è
stata lasciata reagire a t. a., per due giorni, sotto agitazione magnetica.
Alla miscela di reazione è stata quindi aggiunta una soluzione acquosa di tiosolfato di sodio (per neutralizzare sia il Br2). Il tutto è stato trasferito in imbuto separatore ed estratto
con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito
un grezzo che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, toluene.
Dalla purificazione, sono state ricavate tre frazioni che all’analisi 1H-NMR hanno dato i seguenti risultati:
- frazione A, 49.8 mg (2-cloro-3-bromo-6-metossbienzil bromuro, come solido giallo);
- frazione B, 166.8 mg (composto 21 puro sottoforma di solido bianco cristallino, 0.66 mmoli, resa 28 %);
- frazione C, 149.0 mg (composto 20).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.92 (s, 3H); 6.84 (d, 1H, J = 9.0 Hz); 7.73 (d, 1H, J = 9.0
Sintesi composto 22 (condizioni di Suzuki)
Cl MeO OMe O 2-cloro-4,4’-dimetossibifenil-3-carbaldeideLa reazione è stata condotta in fiala chiusa, sotto atmosfera di N2.
Nella fiala sono stati aggiunti toluene ed etanolo assoluto (0.96 ml ciascuno), Pd(AcO)2
(2.9 mg, 0.013 mmoli) e PPh3 (16.91 mg, 0.064 mmoli), sotto agitazione magnetica. Dopo
10 minuti è stata aggiunto il composto 21 (107 mg, 0.43 mmol), una soluzione di Na2CO3
2 M (0.96 ml) e infine l’acido 4-metossifenilboronico (78.33 mg, 0.52 mmol). La miscela di reazione è stata fatta reagire a 100 °C, per 24 h, sotto agitazione magnetica.
Dopo raffreddamento fino a t. a., il contenuto della fiala è stato diluito con acqua e trasferito in imbuto separatore, dove la fase acquosa è stata estratta con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è stato
purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 8:2.
Le opportune frazioni riunite ed evaporate, hanno fornito 38.3 mg (0.14 mmoli) del composto 22 puro come solido giallo (resa 32 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.86 (s,1H); 3.95 (s, 1H); 6.97 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 6.97
(AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX’ = 2.1 Hz); 7.31 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX’ = 2.1 Hz); 7.45 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 10.6 (s, 1H).
Sintesi del composto 23
Cl HO OH O 2-cloro-4,4’-diidrossibifenil-3-carbaldeideLa reazione è stata condotta in un pallone a due colli, sotto atmosfera di N2.
Una soluzione del composto 22 (33 mg, 0.12 mmol) in CH2Cl2 anidro (1.4 ml) è stata
raffreddata a -78 °C. È stato quindi aggiunto BBr3 goccia a goccia (0.77 ml) e la miscela
di reazione è stata lasciata, sotto agitazione magnetica, a -78 °C per 5 minuti, poi portata a 0 °C per 1 h circa.
Alla miscela di reazione, sempre a 0 °C, è stata aggiunta una soluzione acquosa satura di NaHCO3 e acqua. Il tutto è stato portato a temperatura ambiente, trasferito in imbuto
separatore ed estratto con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed
evaporata, ha fornito un grezzo che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/AcOEt 7:3.
Le opportune frazioni riunite ed evaporate hanno fornito 12.3 mg (0.05 mmoli) del composto 23 puro come solido giallo (resa 41 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 6.90 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 6.88 – 7.28 (m, 4H); 7.46 (d, 1H, J =
Sintesi del composto 6
Cl O OH N H HO (E)-6-cloro-5-p-idrossifenilsalicilaldossimaIn un pallone, è stata introdotta una soluzione del composto 23 (12.3 mg, 0.05 mmoli) in etanolo assoluto (0.84 ml). Dopo riscaldamento a 50 °C, è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di NH2OH·HCl (6.95 mg, 0.1 mmoli) in acqua (0.17 ml). La miscela
risultante è stata lasciata sotto agitazione magnetica, a 50 °C, per 1 h.
L’etanolo è stato evaporato ed il residuo è stato diluito con acqua ed estratto con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un
grezzo che è stato sottoposto ad una rapida filtrazione su silice (mediante siringa munita di setto) usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 4:6 e raccogliendo direttamente l’eluato in un palloncino. Dopo evaporazione sono stati ottenuti 13.8 mg (0.05 mmoli) di prodotto 6 puro come solido giallo (resa > 99 %).
1
H NMR (CD3OD) δ (ppm): 6.81 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6 Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz); 6.89 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 7,17 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz); 7.20 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 8.79 (s, 1H). 13 C NMR (CD3OD) δ (ppm): 115.66, 115.73, 115.86, 116.22, 131.65, 131.72, 131.97, 133.79, 133.87, 150.27, 157.83, 158.85. MS m/z: 263 (M+, 13%), 265 (M++2, 2. 5%).
Sintesi del composto 24 (condizioni di Suzuki)
MeO OMe OMe O 2,3-di(p-metossifenil)-6-metossibenzaldeideLa reazione è stata condotta in fiala chiusa, sotto atmosfera di N2.
Nella fiala sono stati aggiunti toluene ed etanolo assoluto (1.03 ml ciascuno), Pd(AcO)2
(3.14 mg, 0.014 mmoli) e PPh3 (18.36 mg, 0.07 mmoli), sotto agitazione magnetica. Dopo
10 minuti è stata aggiunto il composto 21 (115 mg, 0.46 mmol), una soluzione di Na2CO3
2M (1.03 ml) e infine l’acido 4-metossifenilboronico (112.34 mg, 0.74 mmoli). La miscela di reazione è stata fatta reagire a 100 °C, per 24 h, sotto agitazione magnetica.
Dopo raffreddamento fino a t. a., il contenuto della fiala è stato diluito con acqua e trasferito in imbuto separatore, dove la fase acquosa è stata estratta con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è stato
sottoposto ad un ulteriore cilco di cross-coupling nelle stesse condizioni viste sopra, usando le stesse quantità di reagenti e di solventi. La miscela di reazione ottenuta, è stata raffreddata fino a t. a., diluita con acqua e trasferita in imbuto separatore, dove la fase acquosa è stata estratta con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata
ed evaporata, ha fornito un grezzo purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 8:2.
Le opportune frazioni riunite ed evaporate, hanno fornito 31.3 mg (0.09 mmoli) del composto 24 puro come solido giallo (resa 19 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.76 (s, 3H); 3.78 (s, 3H); 3.97 (s, 3H); 6.68 – 6.78 (m,
Sintesi del composto 25
HO OH OH O 2,3-di(p-idrossifenil)-6-idrossibenzaldeideLa reazione è stata condotta in un pallone a due colli, sotto atmosfera di N2.
Una soluzione del composto 24 (26 mg, 0.074 mmoli) in CH2Cl2 anidro (0.87 ml) è
stata raffreddata a -78 °C. È stato quindi aggiunto BBr3 goccia a goccia (0.72 ml) e la
miscela di reazione è stata lasciata, sotto agitazione magnetica, a -78 °C per 5 minuti, poi portata a 0 °C per 1 h circa.
Alla miscela di reazione, sempre a 0 °C, è stata aggiunta una soluzione acquosa satura di NaHCO3 e acqua. Il tutto è stato portato a temperatura ambiente, trasferito in imbuto
separatore ed estratto con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed
evaporata, ha fornito un grezzo che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/AcOEt 7:3.
Le opportune frazioni riunite ed evaporate hanno fornito 22.64 mg (0.074 mmoli) del composto 25 puro come solido giallo (resa >99 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 6.64 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX ’= 2.5 Hz); 6.74 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6 Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz); 6.86 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz); 6.97 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX’ = 2.4 Hz); 7.02 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 7.52 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 9.70 (s, 1H); 12.0 (s, 1H).
Sintesi del composto 7
O OH N H OH HO 5,6-di(p-idrossifenil)salicilaldossimaIn un pallone, è stata introdotta una soluzione del composto 25 (47.7 mg, 0.16 mmoli) in etanolo assoluto (2.96 ml). Dopo riscaldamento a 50 °C, è stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di NH2OH·HCl (21.72 mg, 0.31 mmoli) in acqua (0.58 ml). La
miscela risultante è stata lasciata sotto agitazione magnetica, a 50 °C, per 1 h.
L’etanolo è stato evaporato ed il residuo è stato diluito con acqua ed estratto con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo
che è stato sottoposto ad una rapida filtrazione su silice (mediante siringa munita di setto) usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 2:8 e raccogliendo direttamente l’eluato in un palloncino. Dopo evaporazione sono stati ottenuti 32.3 mg (0.1 mmoli) di prodotto 7 puro come solido giallo (resa 64 %).
1
H NMR (CD3OD) δ (ppm): 6.54 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6 Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz); 6.69 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6 Hz, JAA’XX’ = 2.3 Hz); 6.80 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6 Hz, JAA’XX ’= 2.6 Hz); 6.82 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.6 Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz); 6,91 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 7.22 (d, 1H, J = 8.4 Hz); 7.94 (s, 1H) 13 C NMR ( CD3OD ) δ (ppm): 115.30, 115.64, 116.15, 116.55, 129.77, 130.61, 131.86, 133.18, 133.23, 134.09, 134.67, 142.66, 152.15, 156.45, 157.48, 157.94. MS m/z: 321 (M+, 100%), 322 (M++1, 67%), 303 (M+-H2O, 29% ).
Tentativo di sintesi del composto 26 (condizioni di FU)
O HO OMe OMe 4,5-di(p-metossifenil)salicilaldeideLa reazione è stata condotta in fiala chiusa sotto flusso di N2.
Ad una soluzione di 4,5-dicloro-2-idrossibenzaldeide commerciale (100 mg, 0.52 mmoli) in diossano anidro (2.0 ml) sono stati addizionati nell’ordine: Cs2CO3 (286.72 mg,
0.88 mmoli), acido p-metossifenilboronico (115.38 mg, 0.76 mmoli), Pd2(dba)3 (14.65 mg,
0.016 mmoli) e PCy3 (20 % in toluene, 88 % di purezza, 0.05 ml).
La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione magnetica, alla temperatura di 80 °C, per 16 ore.
Il contenuto della fiala è stato quindi raffreddato fino a temperatura ambiente, diluito con AcOEt, filtrato su celite e portato a secco al rotavapor. Il grezzo ottenuto è stato sottoposto ad un ulteriore ciclo di cross-coupling nelle stesse condizioni viste sopra, usando le stesse quantità di reagenti e di solventi. Dopo le 16 ore previste per la reazione, la miscela è stata portata a temperatura ambiente, diluita con AcOEt, filtrata su celite ed evaporata. Il grezzo ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna in gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 8:2.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 30.6 mg di un prodotto oleoso giallo che, all’analisi 1H-NMR, è risultato corrispondere ad una miscela di prodotto di partenza, prodotto mono-aril-sostituito e composto 26.
Abbiamo quindi pensato di sottoporre altri 100 mg (0.52 mmoli) della 4,5-dicloro-2-idrossibenzaldeide commerciale anziché a due cicli, a tre cilci di cross-cuopling in condizioni FU.
Il contenuto della fiala, dopo il terzo ciclo di cross-coupling, è stato quindi lasciato raffreddare fino a temperatura ambiente, diluito con AcOEt, filtrato su celite ed evaporato. Il grezzo ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna in gel di silice
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 40.0 mg di un prodotto oleoso giallo, il cui spettro 1H-NMR è risultato di difficile interpretazione; l’unica particolarità ben evidente è stata la scomparsa del segnale aldeidico.
Sintesi del composto 27
Cl Cl HO H O O 4,5-dicloro-2-(2-metil-1,3-diossolan-2-il)fenoloIn un palloncino, sono stati dissolti 800 mg (4.19 mmoli) della 4,5-dicloro-2-idrossibenzaldeide commerciale in toluene anidro (13.19 ml), ai quali sono stati addizionati etilen glicole (0.73 ml, 13.13 mmoli) (preventivamente anidrificato su setacci, in stufa a 120 °C) e quantità catalitiche di acido p-toluensolfonico (anch’esso reso anidro sottoponendolo a tre lavaggi consecutivi in toluene anidro e portandolo a secco con il rotavapor). La miscela così ottenuta è stata rifluita, usando l’apparecchiatura di Dean-Stark per 80 ore a 130 °C, sotto agitazione magnetica.
Dopo raffreddamento fino a t. a., alla miscela di reazione è stata aggiunta una soluzione acquosa satura di NaHCO3 e acqua. Il tutto è stato trasferito in imbuto separatore ed
estratto con CH2Cl2. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha
fornito un grezzo che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/AcOEt 8:2 + 0.01 % di trietilammina (allo scopo di ridurre l’acidità della silice per evitare l’eventuale idrolisi dell’acetale ciclico formatosi). Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 487.2 mg (2.08 mmoli) del composto 27 come olio giallo (resa 50%). Non è stato possibile stabilire con esattezza se il prodotto ottenuto fosse puro, poiché dallo spettro 1H-NMR, oltre alla presenza dei picchi caratteristici del composto 27, sono risultati evidenti due doppietti (a 6.46 ppm e 7.62 ppm) aventi la stessa costante di accoppiamento (J = 9.7 Hz). È stata quindi ipotizzata un’interazione tra l’OH fenolico e l’idrogeno acetalico.
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 4.27 (s, 4H); 6.46 (d, 1H, J = 9.7 Hz); 7.46 (s, 1H); 7.58 (s,
1H); 7.62 (d, 1H, J = 9.7 Hz).
1
Tentativo di sintesi del composto 28 (condizioni di FU)
HO H OMe OMe O O 2-(1,3-diossolan-2-il)-4,5-di-(p-metossifenil)-fenoloLa reazione è stata condotta in fiala chiusa sotto flusso di N2.
Ad una soluzione di composto 27 (477 mg, 2.04 mmoli) in diossano anidro (7.85 ml) sono stati aggiunti nell’ordine: Cs2CO3 (1.12 g, 3.45 mmoli), l’acido
p-metossifenilboronico (452.63 mg, 2.98 mmoli), Pd2(dba)3 (58.91 mg, 0.064 mmoli) e PCy3
(20 % in toluene, 88 % di purezza, 0.25 ml).
La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione magnetica, alla temperatura di 80 °C, per 16 ore.
Il contenuto della fiala è stato quindi raffreddato fino a temperatura ambiente, diluito con AcOEt, filtrato su celite e portato a secco al rotavapor. Il grezzo ottenuto è stato sottoposto ad un ulteriore ciclo di cross-coupling nelle stesse condizioni viste sopra, usando le stesse quantità di reagenti e di solventi. Dopo le 16 ore previste per la reazione, la miscela di reazione è stata portata a temperatura ambiente, diluita con AcOEt, filtrato su celite ed evaporata. Il grezzo ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna in gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 8:2.
Dalla purificazione, sono state ricavate quattro frazioni: - frazione A, 76.8 mg;
- frazione B, 12.3 mg; - frazione C, 45.7 mg; - frazione D, 14.6 mg
Gli spettri 1H-NMR di ciascuna frazione sono risultati di difficile interpretazione, ma comunque nessuno ha confermato la formazione del composto 28.
Era stato anche ipotizzato che la doppia cross-coupling in condizioni di FU, sul composto 28, potesse portare alla rottura dell’acetale ciclico, fornendo in questo modo il prodotto 4,5-di(p-metossifenil)salicilaldeide (composto 26). Ma nessuno degli spettri 1
H-NMR delle frazioni sopra menzionate, ha mostrato la presenza del tipico segnale del gruppo aldeidco.
È stato comunque deciso, di provare un’idrolisi acida sulla frazione quantitativamente più grande (frazione A).
Secondo Tentativo di sintesi del composto 26
O HO OMe OMe 4,5-di(p-metossifenil)salicilaldeideIn un palloncino sono stati dissolti 76.8 mg (0.203 mmoli) del composto 28 in etanolo assoluto (2.03 ml), ai quali sono stati addizionati 2.03 ml di HCl 1N.
Le TLC di controllo non hanno mostrato alcuna evidenza di nuovi prodotti formati. Dopo 72 ore è stato comunque deciso di trattare la reazione. La miscela è stata diluita con una soluzione acquosa satura di NaHCO3, trasferita in imbuto separatore ed estratta con
AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito 57.8
mg di grezzo che è stato sottoposto ad analisi 1H-NMR.
Lo spettro 1H-NMR, di difficile interpretazione, non ha evidenziato la formazione del prodotto 26 (assenza del segnale caratteristico del gruppo aldeidico).
Sintesi del composto 29
Br
HO OH
O
Acido 2-bromo-5-idrossibenzoico
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli, sotto atmosfera di N2.
Una soluzione dell’acido 2-bromo-5-metossibenzoico commerciale (1 g, 4.33 mmol) in CH2Cl2 anidro (50.0 ml) è stata raffreddata a -78 °C, quindi addizionata di una soluzione di
BBr3 in CH2Cl2 anidro (2.8 ml). La miscela di reazione è stata lasciata, sotto agitazione
magnetica, a -78 °C per 5 minuti, poi portata a 0 °C per 1 h circa.
Alla miscela di reazione, sempre a 0°C, è stata aggiunta una soluzione acquosa satura di NaHCO3, e acqua. Il tutto è stato portato a temperatura ambiente e trasferito in imbuto
separatore ed estratto con AcOEt. La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed
evaporata, ha fornito 885 mg di grezzo che, dall’analisi 1H-NMR, è risultato essere costituito esclusivamente dal prodotto 29 puro come solido rosa pallido. Di conseguenza, si è proceduto al passaggio successivo senza ulteriore purificazione.
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 6.82 (dd, 2H, J = 8.6, 2.9 Hz); 7.20 (d, 1H, J = 2.9 Hz);
Sintesi del composto 30
Br HO O OMe (2-bromo-5-idrossifenil)(4-metossifenil)metanoneIn un palloncino, sono stati introdotti 392 mg (32.65 mmoli) di grafite e 1.27 ml di acido metansolfonico (MeSO3H). Dopo riscaldamento a 80 °C, sono stati aggiunti 885 mg
(4.081 mmoli) del composto 29 e 0.45 ml di anisolo. La reazione è stata lasciata sotto agitazione magnetica per circa 3 ore.
La miscela di reazione è stata portata a t. a., diluita con una soluzione acquosa satura di NaHCO3 e con acqua, trasferita in imbuto separatore ed estratta con CHCl3. La fase
organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è stato
purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/AcOEt 7:3.
Le opportune frazioni riunite ed evaporate hanno fornito 243 mg (0.79 mmoli) del composto 30 puro come olio giallo-bruno (resa 19 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.88 (s, 1H); 6.92 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX’ = 2.2 Hz); 7.43 (d, 1H, J = 7.7 Hz); 7.78 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 2.5 Hz).
Sintesi del composto 31
Br O O OMe (5-allilossi)-2bromofenil)(4 metossifenil)metanoneLa reazione è stata condotta in un pallone a due colli munito di refrigerante.
Ad una soluzione del composto 30 (243mg, 0.79 mmoli) in CH3CN ( 2.3 ml) è stato
addizionato K2CO3 ( 132.0 mg, 0.95 mmoli). La miscela è stata riscaldata a 80 °C, e dopo è
stata aggiunta, goccia a goccia, una soluzione di allil bromuro (1.26 mmoli, 0.11 ml) in CH3CN (0.5 ml) e lasciata reagire a 80 °C per 3 h, sotto agitazione magnetica.
La miscela è stata quindi raffreddata fino a temperatura ambiente, diluita con CH2Cl2,
filtrata su celite e portata a secco al rotavapor. Il grezzo ottenuto (241 mg) dall’analisi 1 H-NMR, è risultato essere costituito esclusivamente dal prodotto 31 puro come olio giallo. Di conseguenza, si è proceduto al passaggio successivo senza ulteriore purificazione.
1 H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.88 (s, 3H); 4.52 (dt, 2H, J = 5.3, 1.5 Hz); 5.29 (dq, 1H, J =10.4, 1.5 Hz); 5.39 (dq, 1H, J = 17.4, 1.6 Hz); 6.01 (ddt, 1H, J = 15.7, 10.4, 5.3Hz); 6.89 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz); 6.90 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.2 Hz, JAA’XX ’= 2.5 Hz); 6.97 (d, 1H, J = 2.8 Hz); 7.50 (d, 1H, J = 8.4 Hz); 7.80 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.2 Hz, JAA’XX’ = 2.2 Hz).
Sintesi dei composti 32 e 34
Br HO O OMe Br HO O OMe 32 34 (4-allil-2-bomo-5-idrossifenil)(4-metossifenil)metanone (4-allil-2-bomo-5-idrossifenil)(4-metossifenil)metanoneLa reazione è stata condotta in fiala, sotto atmosfera di N2.
Una soluzione del composto 31 (241 mg, 0.69 mmoli) in N-metilanilina distillata (1.1 ml) è stata lasciata a 180 °C, sotto agitazione magnetica, per 4-5 ore.
Dopo raffreddamento fino a temperatura ambiente, il contenuto della fiala è stato trasferito in imbuto separatore, diluito con AcOEt e lavato con una soluzione acquosa di HCl 1 N. La fase organica, essiccata su Na2SO4, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo
che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/AcOEt 7:3.
Dalla purificazione, sono state ricavate tre frazioni: - frazione A, 115 mg;
- frazione B, 14 mg; - frazione C, 29 mg.
Dall’analisi 1H NMR delle frazioni, è emerso che: - la frazione A corrisponde al prodotto 31 (115 mg);
- la frazione B corrisponde al prodotto 32 puro come solido giallo intenso (14 mg, 0.04 mmoli) (resa 6 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.39-3.42 (m, 2H); 5.13-5.22 (m, 2H); 5.88-6.14 (m, 1H);
6.80 (s, 1H); 6.92 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 3.1 Hz ); 7.32 (s, 1H); 7.80 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 3.1 Hz).
- la frazione C corrisponde al composto 34 puro come solido giallo (29 mg, 0.083 mmoli) (resa 12 %) .
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.18-3.29 (m, 2H); 3.87 (s, 3H); 4.97-5.06 (m, 2H); 5.56
(bs, 1H); 5.69-5.86 (m, 1H); 6.81 (d, 1H, J = 8.6 Hz); 6.93 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.8 Hz, JAA’XX’ = 2.0 Hz); 7.35 (d, 1H, J= 8.8Hz); 7.79 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.2 Hz, JAA’XX’ = 2.0 Hz).
Sintesi del composto 33
Br
HO
O
OMe
2-bromo-5 idrossi-4-( (E)-prop-1-enil)fenil)(4-metossifenil)metanone
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli, munito di refrigerante e tappo al CaCl2.
Una miscela costituita dal composto 32 (48.5 mg, 0.14 mmoli), DMSO (0.49 ml) e t-BuOK (48.56 mg, 0.35 mmoli) è stata lasciata reagire a 55 °C per 12 h circa.
Dopo raffreddamento fino a t. a., è stata aggiunta una soluzione acquosa di HCl 1 N. La miscela ottenuta è stata trasferita in imbuto separatore ed estratta con Et2O. La fase
organica, essiccata su Na2SO4, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è stato
purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice, utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/Acetato 6:4.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 16.9 mg del composto 33 puro come solido giallo (resa 35 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 1.64-1.78 (m, 3H); 1.92-1.96 (m, 3H); 3.87 (s, 3H); 6.79 (s,
1H); 6.92 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.4 Hz, JAA’XX’ = 2.2 Hz ); 7.51 (s, 1H); 7.80 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 2.1 Hz).
Sintesi del composto 35
Br
HO
O
OMe
6-bromo-3 idrossi-2-( (E)-prop-1-enil)fenil)(4-metossifenil)metanone
La reazione è stata condotta in un pallone a due colli, munito di refrigerante e tappo al CaCl2.
Una miscela costituita dal composto 34 (104.8 mg, 0.30 mmoli), DMSO (1.09 ml) e t-BuOK (104.06 mg, 0.75 mmoli) è stata lasciata reagire a 55 °C per 12 h circa.
Dopo raffreddamento fino a t. a., è stata aggiunta una soluzione acquosa di HCl 1 N. La miscela ottenuta è stata trasferita in imbuto separatore ed estratta con Et2O. La fase
organica, essiccata su Na2SO4, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è stato
purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice, utilizzando, come eluente, una miscela di Esano/Acetato 7:3.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 48,4 mg del composto 35 puro come solido giallo (resa 47 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 1.60-1.72 (m, 3H); 3.20-3.25 (m, 1H); 3.87 (s, 3H);
4.96-5.05 (m, 1H); 6.81 (d, 1H, J= 8.6Hz); 6.92 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.0 Hz, JAA’XX’ = 2.1 Hz); 7.34 (dd, 1H, J = 8.6 Hz); 7.76 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.4 Hz, JAA’XX’ = 2.1 Hz).
Poiché lo spettro 1H NMR di tale composto presenta picchi anomali, forse attribuibili ai rotameri, è stato pensato quindi, di sottoporre questi pochi mg ricavati del composto 35, a scissione ossidativa. Tale reazione, non è prevista a questo punto dello schema di sintesi, ma è stata effettuata nella speranza di ottenere una semplificazione dello spettro 1H NMR del nuovo composto, per poter avere un chiarimento e una conferma sulla struttura del composto 35. Non è stato possibile inoltre, ricavare la costante di accoppiamento dei protoni relativi al doppio legame per poter stabilire con esattezza se si tratta dell’isomero
Sintesi del composto 36
Br HO O OMe O 3-bromo-6idrossi-2(4-metossibenzoil)benzaldeideUna miscela costituita dal composto 35 (43 mg, 0.12 mmoli), diossano (1.17 ml), acqua (0.59 ml), NaIO4 (57.75 mg, 0.27 mmoli) e OsO4 (soluz. al 2.5% in t-BuOH, 0.04 ml,
0.003 mmoli) è stata lasciata reagire a temperatura ambiente, sotto agitazione magnetica, per 2 h circa.
La miscela è stata diluita con acqua ed estratta, in imbuto separatore, con CHCl3. La
fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo che è
stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 7:3.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 11.1 mg del composto 36 puro come solido giallo (resa 28 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 6.97 (AA’XX’, 2H, JAX = 9.2 Hz, JAA’XX’ = 3.0 Hz ); 7.00 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 7.69 (d, 1H, J = 9.0 Hz); 7.80 (AA’XX’, 2H, JAX = 8.4 Hz, JAA’XX’ = 3.0 Hz); 9.70 (s, 1H); 11.60 (bs, 1H).
Sintesi del composto 37
N O OMe OMe MeO H N-2,4-(dimetossifenil)-3-metossibenzamideLa reazione è stata condotta in un pallone a due colli e sotto flusso di N2.
Ad una soluzione di 2,4-dimetossianilina commerciale (300 mg, 1.96 mmoli) in CH2Cl2 anidro (minima quantità necessaria) è stata aggiunta la N,N-dietilmetilammina
(0.28 mL, 2.35 mmoli). Tale miscela è stata addizionata di una soluzione di 3-metossi-benzoilcloruro (0.32 ml, 2.35 mmoli) in CH2Cl2 anidro (minima quantità necessaria),
goccia a goccia e di DMAP in quantità catalitiche. La reazione è stata lasciata sotto agitazione magnetica a temperatura ambiente per 24 ore.
Il contenuto del pallone è stato quindi trasferito in un imbuto separatore e neutralizzato con una soluzione acquosa satura di K2CO3. La fase acquosa è stata estratta con AcOEt.
La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo
che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 6:4.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 486 mg (1.7 mmoli) del composto 37 puro come solido cristallino rosa (resa 87 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.82(s, 3H); 3.88 (s, 3H); 3.90 (s, 3H); 6.52-6.56 (m, 2H);
7.04-7.10 (m, 1H); 7.38-7.41 (m, 2H); 7.46 (d, 1H, J = 1.3 Hz); 8.33 (s, 1H); 8.40 (d, 1H, J = 9.5 Hz).
Sintesi del composto 38
N S OMe OMe MeO H N-2,4-(dimetossifenil)-3-metossibenzotiammideLa reazione è stata condotta in una fiala chiusa, sotto N2.
Ad una soluzione del composto 37 (450 mg, 1.56 mmoli) in clorobenzene (2 mL) è stato aggiunto il reattivo di Lawesson (380.20 mg, 0.94 mmoli). La reazione è stata lasciata sotto agitazione magnetica a 130 °C per 3 ore.
Dopo raffreddamento a temperatura ambiente, il contenuto della fiala è stato versato in un palloncino ed il solvente evaporato. Il grezzo ottenuto è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 7:3.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 255.5 mg (0.84 mmoli) del composto 38 puro come olio giallo (resa 54 %).
1
H NMR (CDCl3) δ (ppm): 3.84(s, 3H); 3.87 (s, 3H); 3.89 (s, 3H); 6.51-6.58 (m, 2H);
Sintesi del composto 16
N S OH HO OH H N-2,4-(diidrossifenil)-3-idrossibenzotiammideLa reazione è stata condotta in una fiala da microonde. Le aggiunte sono state eseguite sotto flusso di N2.
Ad una soluzione del composto 38 (240 mg, 0.79 mmoli) in CH2Cl2 anidro (8.86 mL) è
stato aggiunto, goccia a goccia, BBr3 (1 M in, CH2Cl2, 9.48 mL).
La fiala è stata poi posta nella cavità dell’apparecchiatura a microonde, impostando i seguenti parametri: Power = 120 Watt; Temperatura massima = 80 °C; Pressione massima = 120 psi; Hold Time = 15 minuti. Il contenuto della fiala è stato diluito con una soluzione acquosa satura di NaHCO3, trasferito in un imbuto separatore ed estratto con CH2Cl2.
La fase organica, essiccata su Na2SO4 anidro, filtrata ed evaporata, ha fornito un grezzo
che è stato purificato mediante cromatografia su colonna di gel di silice usando, come eluente, una miscela Esano/AcOEt 4:6.
Le opportune frazioni, riunite ed evaporate, hanno fornito 17.1 mg (0.06 mmoli) del composto 16 puro come olio gelatinoso giallo (resa 14 %).
1 H NMR (acetone-d6) δ (ppm): 6.43 (dd, 1H, J = 8.8, 2.6 Hz); 6.52 (d, 1H, J = 2.6 Hz); 7.27 (t, 1H, J = 7.9 Hz); 7.49-7.38 (m, 3H); 7.80 (d, 1H, J = 8.8 Hz); 8.45 (bs, 2H); 9.41 (bs, 1H); 10.31 (bs, 1H). 13 C NMR (acetone-d6) δ (ppm): 104.60, 105.71, 107.60 (d, J = 13.7 Hz), 115.44 (d, J = 10.1 Hz), 118.65 (d, J = 6.4 Hz), 119.47 (d, J = 17.4 Hz), 121.19, 124.69, 127.03, 130.24 (d, J= 23.8Hz), 144.77, 152.18, 157.98 (d, J = 4.6 Hz). MS m/z: 227 (M+-H2S, 100%).
Saggio di affinità per i recettori degli estrogeni.
Le affinità di binding sono state determinate mediante saggi radiometrici di spiazzamento competitivo del [3H]estradiolo (2 nM) sui sottotipi recettoriali ERα ed ERβ umani ricombinanti purificati.35, 36 Le incubazioni sono state fatte a 0 °C per 18-24 h e, per assorbire il complesso recettore-ligando purificato, è stato utilizzato idrossiapatite. Le affinità di binding sono espresse come valori relativi di affinità di legame (RBA), in cui la RBA dell’estradiolo è considerata il 100 %; in queste condizioni la Kd dell’estradiolo per
ERα è 0.2 nM e per ERβ è 0.5 nM.
Saggi biologici per l’enzima 17ββββ-HSD1
Per quanto riguarda il calcolo dell’attività inibitoria alle concentrazioni di 1 µM o 100 nM dei potenziali inibitori sull’enzima 17β-HSD1 si fa riferimento all’enzima 17β-HSD1 della placenta umana ricombinato.34
L’enzima 17β-HSD1 umano ricombinato è ricavato per l’inserimento del baculovirus ricombinante all’interno delle cellule Sf9 di insetto usando “Cellfectin Reagent” (Invitrogen). Sei ore dopo le cellule sono transfectate e la frazione microsomiale contenete l’enzima 17β-HSD1 è isolata. Parte di questa frazione (0.1 µg/ml) è incubata con una soluzione di KH2PO4 (20 mM) a pH 7.4, estrone (30 nM) e NADPH (1 mM) per 30
minuti a t. a. in presenza di potenziali inibitori, alla concentrazione di 1 µM o 100 nM. La fine del processo enzimatico si ha con l’introduzione di acido tricloroacetico al 10% , dopodichè tutto il campione viene posto in centrifuga a 4000 rpm per 10 minuti. Il surnatante ottenuto è purificato tramite HPLC in fase inversa. La percentuale di conversione di estrone ad estradiolo è calcolata secondo la seguente formula: % conversione = 100[(cpm E2 del campione in presenza di inibitore)/(cpm E1 del campione in presenza di inibitore + cpm E2 del campione in presenza di inibitore)]/[(cpm E2 del campione in assenza di inibitore)/(cpm E1 del campione in assenza di inibitore + cpm E2 del campione in assenza di inibitore)]. Mentre per la percentuale di inibizione si fa riferimento alla seguente formula: % di inibizione= 100 - % di conversione. Composti con una percentuale di inibizione minore del 10% a una concentrazione di 1 µM vengono considerati inattivi.
Metodi di docking
Gli studi di docking sono stati eseguiti dal Dr. Tiziano Tuccinardi del gruppo di ricerca del Prof. Adriano Martinelli presso l’Università di Pisa.
La struttura cristallografica di ERα (codice PDB 2I0J38) e di ERβ (codice PDB 2I0G38) è stata presa dal Protein Data Bank. Dopo l’aggiunta di atomi di idrogeno, le due proteine complessate con il loro inibitore sono state minimizzate utilizzando il programma Amber 939 e parm03 come campo di forza a 300K. Il complesso è stato inserito in un parallelepipedo rettangolare costituito da acqua, in un solvente esplicito. Sono stati aggiunti ioni sodio per neutralizzare il sistema.
I ligandi sono stati costruiti utilizzando Maestro40 e sono stati minimizzati con l’aiuto di Macromodel40 in ambiente acquoso, utilizzando il metodo Conjugate Gradient fino a raggiungere un valore di convergenza pari a 0.05 kcal/Å•mol, MMFFs come campo di forza e una costante dielettrica di 1.0.
Il docking è stato effettuato mediante il programma AUTODOCK 4.0.37 AUTODOCK Tools è stato utilizzato al fine di individuare gli angoli di torsione nei ligandi, addizionare solvente e assegnare la carica atomica di Kollman alla proteina. La carica dei ligandi è stata calcolata usando il metodo di Gasteiger. Durante il docking, per prevenire la perdita del legame ad idrogeno intramolecolare del sistema pseudociclico è stata bloccata la torsione coinvolta in tale legame.
Usando Lamarckian Genetic Algorithm, i composti dokati sono soggetti a 100 cicli di ricerca di Autodock.
