ADP + HPO 3 NAD +, NADP +, FAD (TRASEFRIMENTO DI ELETTRONI) ATP (LEGAMI AD ALTA ENERGIA) NADH, NADPH, FADH 2 (EQUIVALENTI RIDUCENTI)

MOLECOLE di PRECURSORI Amminoacidi

Zuccheri Ac. Grassi Basi azotate

ANABOLISMO (biosintesi)

MACROMOLECOLE CELLULARI

Proteine Polisaccaridi

Lipidi Acidi nucleici

Metaboliti complessi RICCHI DI ENERGIA

Carboidrati Lipidi Proteine

Composti semplici POVERI DI ENERGIA

CO₂ H₂O NH₃

CATABOLISMO (degradazione)

NADH, NADPH, FADH₂

(EQUIVALENTI RIDUCENTI)

NAD⁺, NADP⁺, FAD (TRASEFRIMENTO DI

ELETTRONI) ADP + HPO₃^2-

ATP

(LEGAMI AD ALTA ENERGIA)

METABOLISMO: Descrive tutte le numerose reazioni con cui le molecole biologiche sono sintetizzate e degradate, e che permettono di ricavare, accumulare e utilizzare energia

BIOENERGETICA: Studia i cambiamenti energetici che si verificano durante le reazioni metaboliche.

Le reazioni metaboliche possono essere di due tipi

1) Reazioni reversibili (vicine all’equilibrio): la maggior parte delle reazioni di una via metabolica sono vicine all’equilibrio. Gli enzimi che catalizzano queste reazioni hanno un’attività sufficiente a mantenere i livelli di substrati e prodotti vicino allo stato di equilibrio. Il flusso dei metaboliti in una direzione o nell’altra è regolato dalle concentrazioni di substrati e prodotti.

2) Reazioni irreversibili (lontane dall’equilibrio): si trovano nei punti di controllo delle vie metaboliche. Gli enzimi che catalizzano reazioni in un’unica direzione. Il flusso dei metaboliti attraverso queste reazioni è controllato attraverso la modulazione degli enzimi che le catalizzano.

Puntualizziamo 2 concetti fondamentali:

1) EQUILIBRIO

2) VARIAZIONE DI ENERGIA LIBERA

1a legge della termodinamica: L’ENERGIA NON PUO’ ESSERE NE’

CREATA NE’ DISTRUTTA MA SOLO TRASFORMATA

L’ENERGIA TOTALE DI UN SISTEMA RIMANE COSTANTE: VIENE CONSERVATA

ES: l’ENERGIA chimica contenuta nel glucosio viene trasformata durante la glicolisi nell’energia chimica dell’ATP

2a legge della termodinamica: L’ENTROPIA DI UN SISTEMA (IL GRADO DI DISORDINE, DI CASUALITA’) TENDE A RAGGIUNGERE IL MASSIMO.

ENTROPIA = PARTE DI ENERGIA CHE NON PUO’ ESSERE TRASFORMATA IN LAVORO UTILE

MASSIMA ENTROPIA = RAGGIUNGIMENTO DI UNO STATO DI EQUILIBRIO I SISTEMI VIVENTI SONO ALTAMENTE ORDINATI E QUINDI

LONTANI DALL’EQUILIBRIO

IN UN SISTEMA VIVENTE L’ENTROPIA NON è FACILMENTE MISURABILE PER CAPIRE SE IL SISTEMA STA ALL’EQUILIBRIO

IN UN SISTEMA VIVENTE SI TIENE CONTO DI UN ALTRO PARAMETRO PER CAPIRE QUANTO è LONTANO/VICINO ALL’EQUILIBRIO: ENERGIA LIBERA

ENERGIA DISPONIBILE PER COMPIERE UN LAVORO UTILE

Ogni reazione metabolica comporta un trasferimento sia di materia sia di energia.

Durante una reazione la trasformazione di un reagente in prodotto comporta una variazione di energia libera che è chiamata

ΔG

uguale alla differenza fra l’energia libera del prodotto e quella del reagente.

Studiare la variazione di energia che si verifica durante una reazione ci permette di:

- determinare la costante di equilibrio di quella reazione - predire in quale direzione andrà una reazione

- predire se una data reazione ha la possibilità di verificarsi spontaneamente

VARIAZIONE DI ENERGIA LIBERA di GIBBS (G)

La variazione di energia libera di Gibbs è stata misurata in condizioni standard per le diverse reazioni metaboliche.

ΔG⁰’ = variazione di energia libera in condizioni STANDARD

Pressione 1 atm

Temperatura 25°C = 298 K pH = 7.0

Concentrazione di ogni reagente e prodotto = 1M

ΔG⁰’ > 0 → la reazione è endoergonica, sfavorita dal punto di vista energetico, non spontanea ΔG⁰’ < 0 → la reazione è esoergonica, favorita dal punto di vista energetico, spontanea

Le reazioni metaboliche in vivo avvengono in condizioni

NON-STANDARD (ΔG’), cioè in condizioni REALI: pH 7, 36- 37 °C, concentrazioni di prodotti e reagenti mM o μM con valori ≠ 1

all’equilibrio, ΔG’ = 0 Endoergoniche, ΔG’ > 0 Esoergoniche, ΔG’ < 0

La variazione reale di energia libera (e quindi la spontaneità della reazione)

dipende dal rapporto fra le

concentrazioni di reagenti e prodotti

presenti nell’ambiente cellulare.

A + B C + D

R = cost. universale dei gas (8.315 J/K·mol) T = temperatura in Kelvin

[C] [D]

ΔG’_reaz = ΔG⁰’_reaz + RT In [A] [B]

Se la reazione metabolica raggiunge l’equilibrio: il rapporto di concentrazioni è uguale alla costante di equilibrio e la

variazione di energia libera della reazione è nulla (la reazione è facilmente reversibile)

[C_eq] [D_eq]

[A_eq] [B_eq] = K_eq ^{e quindi}:

ΔG’

= ΔG

’

+ RT In K

→ ΔG

’ = - RT In K

Poiché all’equilibrio il

ΔG’ = 0

La reazione raggiunge l’equilibrio quando non ci sarà una variazione netta nelle concentrazioni dei reagenti e dei prodotti.

Isomerizzazione del glucosio-6-fosfato fruttosio-6-fosfato (G6P) (F6P)

Se le concentrazioni sono all’equilibrio, il loro rapporto è uguale alla Keq e il ΔG’ = 0

Raggiungere l’equilibrio NON significa uguale concentrazione di reagente e prodotto, MA concentrazioni di reagente e prodotto tali da

non osservare nessuna trasformazione netta di reagenti in prodotti e viceversa

Se la concentrazione del reagente è MAGGIORE di quella all’equilibrio

E la concentrazione del prodotto è INFERIORE rispetto a quella all’equilibrio:

[G6P] > [G6P_eq]

[F6P] < [F6P_eq] ΔG’ < 0 reazione esoergonica

Glucosio 6-fosfato → fruttosio 6-fosfato ΔG’ < 0 È favorita la formazione di fruttosio 6-P (reazione diretta)

ΔG’ > 0 È favorita la formazione di glucosio 6-P (reazione inversa) Se la concentrazione del reagente è MINORE di quella all’equilibrio

E la concentrazione del prodotto è MAGGIORE rispetto a quella all’equilibrio:

[G6P] < [G6P_eq]

[F6P] > [F6P_eq] ΔG’ > 0 reazione endoergonica

Fruttosio 6-fosfato → Glucosio 6-fosfato

Nei processi metabolici una reazione

termodinamicamente sfavorita può esser resa favorita:

1) Se le reazioni di una via metabolica sono concatenate.

Grazie al fatto che il prodotto della reazione viene velocemente consumato nella reazione successiva della

via metabolica.

2) Accoppiando la prima reazione ad una seconda reazione sufficientemente esoergonica, poiché le

variazioni di energia libera sono additive

ΔG⁰’ < 0 (negativa) = processo SPONTANEO, avviene senza richiedere energia dall’esterno, anzi libera energia

(ESOERGONICO).

ΔG⁰’ > 0 (positiva) = processo NON SPONTANEO, richiede energia dall’esterno (ENDOERGONICO).

Idrolisi di ATP (ΔG⁰’ = -30 Kj/mol) ATP → ADP + P_i

coordinata di reazione

ΔG

Fosforilazione del glucosio (ΔG⁰’ = +13.8 Kj/mol) Glu + P_i → Glu-6-P

- 30.5 KJ/mol

coordinata di reazione

+ 13.8 KJ/mol

Reazioni accoppiate

Reazione endoergonica

Reazione esoergonica

+ 13.8 KJ/mol

Coordinata di reazione

Energia libera , G

Fosforilazione del glucosio: l’energia liberata dalla rottura del legame fosfoanidridico dell’ATP è sfruttata per trasferire il gruppo fosfato dall’ATP sul glucosio

- 30.5 KJ/mol

ΔG₃ = + 13.8 KJ/mol + (-30.5 KJ/mol)

= - 16.7 KJ/mol

ATP: Trasportatore di energia metabolica, è un donatore di energia e, nel contempo, un donatore di gruppi fosforici e adenilici

La rottura dei legami fosfoanidridici dell’ATP è accoppiata nei processi

metabolici a reazioni di sintesi di diversi metaboliti, reazioni che nell’ambiente cellulare sono endoergoniche.

L’energia liberata dall’idrolisi dell’ATP è la forza trainante della reazione, e garantisce un ΔG’ (ΔG⁰’) < 0 all’intero processo.

Fattori che contribuiscono a rendere esoergonica l’idrolisi di ATP:

1) Nei prodotti di idrolisi si ottiene una maggiore neutralizzazione delle cariche negative dei gruppi fosfoanidridici da parte degli ioni Mg²⁺

(diminuzione della repulsione elettrostatica)

2) I prodotti di idrolisi (ADP, AMP, P_i) sono meglio solvatati che non l’ATP stesso. La sfera di solvatazione aiuta a schermare le cariche negative.

ADP (adenosina 5’-difosfato) Idrolisi legame

fosfoanidridico in γ con liberazione di fosfato e ADP

γ β α

3) I prodotti di idrolisi (ADP, AMP, P_i) sono più stabili dell’ATP. La stabilizzazione si ha per risonanza:

gli elettroni sugli atomi di ossigeno terminali sono maggiormente delocalizzati che non sugli ossigeni che fanno da ponte nei legami fosfoanidridici.

ATP (adenosina 5’-trifosfato)

L’ATP partecipa alla reazione in 2 possibili modi

Dona al substrato o

all’intermedio di reazione il fosfato in γ

Dona al substrato o

all’intermedio di reazione il gruppo ADENILATO (AMP)

TRASFERIMENTO DI MATERIA E DI ENERGIA (ROTTURA DEI LEGAMI FOSFOANIDRIDICI ESOERGONICA)

Se la trasformazione del Glu in Gln avvenisse in questo modo il processo sarebbe sfavorito: ΔG⁰’ = + 14.5 KJ/mol

ATP + H₂O ADP + P_i ΔG⁰’ = - 30.5 KJ/mol

Affinché avvenga, occorre una spesa energetica: per mandare avanti la reazione è necessario accoppiarla all’idrolisi di ATP

+ H₂O

Glutammina-sintetasi: sintetizza glutammina a partire da glutammato

Legame anidridico

:NH₃

Glutammil-fosfato ΔG⁰’_TOT = +14.5 KJ/mol + (- 30.5 KJ/mol)

= - 16.0 KJ/mol REAZIONE ESOERGONICA Glutammato + NH₃ + ATP glutammina + ADP + P_i

L’ATP può essere sintetizzato in 2 possibili modi 1) Processo di fosforilazione

ossidativa mitocondriale (respirazione cellulare)

2) Reazioni di fosforilazione a livello del substrato (citosol)

È sfruttata l’energia liberata dai COMPOSTI FOSFORILATI

AD ALTA ENERGIA

Variazione di energia libera nelle reazioni metaboliche di ossidoriduzione

È ASSOCIATA AL FLUSSO DI ELETTRONI SCAMBIATI TRA GLI INTERMEDI METABOLICI.

Il flusso di elettroni è “spontaneo” quando sono trasferiti da un donatore a basso potenziale di riduzione (bassa affinità per gli e^– ) ad

un accettore ad alto potenziale di riduzione (alta affinità per gli e^–).

SE IL FLUSSO DI ELETTRONI E’ SPONTANEO LA REAZIONE E’

ESOERGONICA

LA VARIAZIONE DI ENERGIA LIBERA DI UNA REAZIONE DI OSSIDORIDUZIONE E’ LEGATA ALLA CAPACITA’ DI CEDERE O

ACQUISTARE ELETTRONI DELLE MOLECOLE COINVOLTE.

∆G

’ = - n F ∆E

’

n = n° di elettroni scambiati

F = costante di Farady (96.5 kj/V▪ mole)

∆E⁰’ = differenza fra i potenziali di riduzione standard delle coppie redox

∆E

’ = E

’

- E

’

Specie che nella reazione si riduce (accetta elettroni)

Specie chenella reazione si ossida (dona elettroni)

LE REAZIONI DI OSSIDORIDUZIONE CHE AVVENGONO NEI SISTEMI BIOLOGICI PREVEDONO:

1) trasferimento diretto di elettroni:

Fe

+ 1 e

→ Fe

(centri ferro/zolfo; citocromi) 2) trasferimento di atomi di idrogeno:

H = 1 H

+ 1 e

(1 protone e 1 elettrone)

(coenzimi FAD; FMN; Ubichinone) 3) trasferimento di 1 ione idruro:

H:

(1 protone e 2 elettroni) (coenzimi NAD; NADP)

4) incorporazione di ossigeno (es.: -OH) da parte di ossigenasi

H H

│ │

H —C — C —H

│ │ H H

- 2 e-, - 2H⁺

+ 2 e-, + 2H⁺ OSSIDAZIONE

RIDUZIONE

H

│

H —C C —H

│ H

Formazione di un doppio legame

Saturazione di un doppio legame

H H

│ │

H —C — C —OH

│ │ H H

- 2 e-, - 2H⁺

+ 2 e-, + 2H⁺ ALCOOL PRIMARIO

H H

│ │

H —C C O

│ H

ALDEIDE

H OH H

│ │ │

H —C — C —C —H

│ │ │ H H H

- 2 e-, - 2H⁺

+ 2 e-, + 2H⁺ OSSIDAZIONE

RIDUZIONE

CHETONE

ALCOOL

SECONDARIO

H O H

│ │ │

H —C — C —C —H

│ │ H H

- 2 e-, - 2H⁺

+ 2 e-, + 2H⁺ H H

│ │

H —C C O

│ H ALDEIDE

H OH

│ │

H —C C O

│ H

ACIDO CARBOSSILICO

COENZIMI che coadiuvano l’azione di enzimi che catalizzano reazioni di ossidoriduzione

(ossidoriduttasi, deidrogenasi):

I derivati della NIACINA (B3),

I derivati della RIBOFLAVINA (B2), COENZIMA Q,

AC. LIPOICO

NAD, NADP FAD, FMN

Coenzimi nicotinammidici

NAD⁺ (NICOTINAMMIDE ADENINA DINUCLEOTIDE)

NADP⁺ (NICOTINAMMIDE ADENINA DINUCLEOTIDE FOSFATO)

Derivano dall’acido nicotinico o niacina, Vitamina B3 o dalla nicotinammide

Sono coinvolti nelle reazioni di ossido-riduzione catalizzate dalle DEIDROGENASI, trasferiscono 2 elettroni e 1 protone dal o al substrato sotto forma di ione idruro

:H^-

Sono associati al sito attivo dell’enzima attraverso interazioni elettrostatiche (debolmente)

Niacina

Ac. nicotinico

H:^- NAD⁺

(ossidato)

NADP⁺ fosfato in posizione 2 ossidato

(OPO₃^2-)

+

NADH (NADPH) (ridotto)

4

L’attacco dello ione idruro può avvenire sopra (A) o sotto (B) il piano dell’anello nicotinammidico

OSSIDATO

RIDOTTO

La misura dell’assorbimento a 340 nm consente di seguire il decorso di molte reazioni catalizzate dalle deidrogenasi NAD(P)⁺ dipendenti.

SPETTRO DI ASSORBIMENTO DEL NAD

ASSORBANZA

LUNGHEZZA D’ONDA

Lattato

deidrogenasi

Piruvato L-lattato

+

Uno ione idruro :H^- è trasferito dal C-4 del NADH al C-2 del piruvato

Uno ione H⁺ è trasferito da un residuo di His del sito attivo dell’enzima sull’ossigeno carbonilico che

diventa un ossidrile

H

R

Carenza Cattivo funzionamento delle deidrogenasi NAD(NADP) dipendenti: sono più di 200

Pellagra (malattia diffusissima piu’ di secolo fa nelle popolazioni con una dieta basata su alimenti poveri di triptofano )

Malattia collaterale frequente negli alcolisti (carenza generale di vitamine), in cui e’ molto ridotto l’assorbimento intestinale di niacina

NIACINA (VIT. B3) Diffusa in quasi tutti gli alimenti (pesce, carne, cereali, legumi……)

In alcuni alimenti è in forma legata e non disponibile (mais)

Piccole quantità possono essere sintetizzate nell’uomo a partire dal triptofano

COENZIMI FLAVINICI

FAD (FLAVINA ADENINA DINUCLEOTIDE) FMN (FLAVINA MONONUCLEOTIDE)

Derivano dalla riboflavina (vitamina B2)

Sono saldamente associati (in qualche caso anche covalentemente) al sito attivo di DEIDROGENASI chiamate flavoproteine.

Partecipano a reazioni di ossidoriduzione in cui possono accettare o rilasciare 2 elettroni e 2 protoni (due atomi di idrogeno)

7,8-dimetil-isoallossazina

Ribitolo legato in N-10

7

8 10

Forma completamente ridotta

5 1

Accetta 1 atomo di idrogeno alla volta oppure 2 insieme

+ H⁺ + H:^-

.

+H⁺ + e^- +H⁺ + e^-

Semichinone

Centri reattivi:

N-5 e N-1

Forma completamente ossidata

RIBOFLAVINA (VIT. B2)

Diffusa in quasi tutti gli alimenti, in particolare latte, uova, carne, verdure fresche.

Carenza Tra le popolazioni dei paesi in via di sviluppo Alcolisti

Soggetti affetti da infezioni croniche Può essere sintetizzata dalla flora intestinale di particolari

ruminanti, l’uomo la introduce con la dieta, è assorbita nel primo tratto intestinale e circola nel sangue legata a proteine (tra cui immunoglobuline)

O

O CH₃O

CH₃ CH₃O

(CH₂ CH C CH₂)_nH CH₃

OH

OH CH₃O

CH₃ CH₃O

(CH₂ CH C CH₂)_nH CH₃

e⁻ + 2H⁺ coenzyme Q

coenzyme QH₂

O⁻

O CH₃O

CH₃ CH₃O

(CH₂ CH C CH₂)_nH CH₃

e⁻

coenzyme Q •⁻

OH

UBICHINONE (COENZIMA Q): benzochinone con 4 sostituenti uno dei quali è una lunga catena isoprenoide (6-10 unità).

Si solubilizza nel doppio strato lipidico delle membrane e essendo un forte agente ossidante ha un ruolo chiave nel trasporto di elettroni attraverso i complessi della catena respiratoria mitocondriale.

O

O CH₃O

CH₃ CH₃O

(CH₂ CH C CH₂)_nH CH₃

OH

OH CH₃O

CH₃ CH₃O

(CH₂ CH C CH₂)_nH CH₃

e⁻ + 2 H⁺ coenzyme Q

coenzyme QH₂

O⁻

O CH₃O

CH₃ CH₃O

(CH₂ CH C CH₂)_nH CH₃

e⁻

coenzyme Q •⁻

1H⁺, 1e^-

1H⁺, 1e^-

semichinone

2H⁺, 2e^-

Ossido-riduzione in 2 tappe oppure in un’unica tappa

1H⁺, 1e^-

ACIDO LIPOICO

Acido carbossilico a 8 atomi di carbonio con due gruppi tiolici in C-6 e C-8.

Viene sintetizzato dagli animali.

Partecipa a reazioni di

ossidoriduzione e di trasferimento di gruppi acilici intermedi di reazione.

È il gruppo prostetico delle diidrolipoammidi aciltransferasi, enzimi che fanno parte di complessi multienzimatici

(piruvato-deidrogenasi,

α-chetoglutarato deidrogenasi)

Forma ossidata

Forma ridotta

Funziona come un braccio oscillante che

trasferisce gruppi acilici

Forma acetilata

2 H⁺ , 2 e-

Si lega con legame ammidico all’ε- amminogruppo di una Lys del sito

attivo dell’enzima che lo utilizza.

+ NADH

Acetaldeide (forma ossidata) >> si deve ridurre ad etanolo

NADH (forma ridotta) >>

si deve ossidare a NAD⁺

Il NADH cede 2 e^- e 1H⁺ (ione idruro H:^-) al C carbonilico dell’acetaldeide,

L’ossigeno acquista un protone (1H⁺ ) dal mezzo

H⁺

+ Etanolo (forma ridotta)

NAD⁺

R

NAD⁺, forma ossidata

CH₃ C

O H CH₃ C

O H

La reazione è reversibile, l’etanolo può essere ossidato nuovamente ad acetaldeide e il NAD⁺ può essere ridotto nuovamente a NADH

H:^-

H

CH₃- CH- OH

Per calcolarmi il ∆E⁰’ considero le due semireazioni di riduzione e i relativi potenziali di riduzione standard delle due coppie redox:

Acetaldeide + 2e^- + 2 H⁺ → etanolo E⁰’ = - 0.197 V

NAD⁺ + 2e^- + H⁺ → NADH E⁰’ = - 0.320 V

∆E⁰’ = E⁰’ (Acet/Etan) - E⁰’ (NAD⁺/NADH)

= - 0.197 – (- 0.320)

= - 0.197 + 0.320

= + 0.123 V Accettore di e^- nella reazione da noi considerata

Donatore di e^- nella reazione da noi considerata

∆G⁰’ = - n F ∆E⁰’

= - 2 x (96.5 Kj/V▪ mole) x (+ 0.123 V)

= - 23.7 Kj/mole

In condizioni standard la reazione redox considerata è favorita dal punto di vista energetico: stiamo trasferendo elettroni da una coppia redox a più basso potenziale

di riduzione (NAD⁺/NADH) ad una a più alto potenziale di riduzione (Acetaldeide/etanolo).

Che succede se la reazione non avviene in condizioni standard ?

Supponiamo che uno dei componenti del nostro sistema di reazione non si trovi alla concentrazione standard di 1 M

Devo rivalutare tutto considerando la concentrazione reale di tutti i partecipanti alla reazione

Per es.:

[CH₃-CHO] = 1 M

[CH₃-CH₂-OH] = 0.1 M

[NAD⁺] = 1 M [NADH] = 1 M

Devo ricalcolare il potenziale di riduzione per la coppia redox Acetaldeide/Etanolo.

Applico l’equazione di Nernst

E’

= E

’ + RT x 2.3 log [specie ossidata]

nF [specie ridotta]

[CH₃ CHO]

[CH₃ CH₂ OH]

Acetaldeide + 2e^- + 2 H⁺ → etanolo 1 M 0.1 M

=

E’

= -0.197V + 0.013V x 2.3 log 1 0.1

= -0.197 + 0.03 = - 0.167 V

∆E’ = - 0.167 – (- 0.320)

= + 0.153 V

∆G’ = - n F ∆E’

= - 2 x (96.5 Kj/V▪ mole) x (+ 0.153 V)

= - 29.0 Kj/mole

R = cost. universale dei gas (8.315 J/K·mol) T = temperatura in Kelvin (298 K)

F = costante di Faraday (96.5 KJ/ V·mol) n = n° elettroni

RT

nF RT

nF = (0.008315 KJ/K· mol) x 298K 2 x 96.5 KJ / V·mol

E⁰’

= 0.013 V

acetaldeide + NADH + H⁺ → etanolo + NAD⁺