Materiali e Metodi
2.4.b Mutagenesi in vitro
Abbiamo utilizzato questa procedura per modificare una sequenza di DNA, allo scopo di mutagenizzare singoli codoni, o per introdurre un sito di restrizione ed effettuare, di conseguenza, uno scambio di domini proteici (swap-domain).
Il protocollo utilizzato è quello suggerito da “QuikChangeTM Site-Direct Mutagenesis Kit” della Stratagene. Occorre, innanzitutto, disporre dei due
primers tra loro complementari contenenti le basi mutate (cioè le mutazioni
che si vogliono inserire nella sequenza di interesse). Questi vengono utilizzati in una reazione di PCR su molecole circolari di DNA plasmidico, contenenti la sequenza wild-type:
DNA 20 ng
Pfu Turbo 1 µl
Reaction Buffer 1/10 volume finale
Primer 5’ 125 ng
Primer 3’ 125 ng
Mix deossinucleotidi 250 µM ognuno
H20 mq fino a volume di 50 µl
Si effettua poi un tipico protocollo per PCR, con un ciclo iniziale di 30 secondi a 95°C, seguito da 12-18 cicli (variabili a seconda del tipo di mutazione da inserire) con un passaggio di denaturazione a 95°C per 30 secondi, 1 minuto di annealing a 55°C ed una estensione a 68°C la cui durata dipende dalla lunghezza del plasmide. Gli oligonucleotidi servono da innesco 64
Materiali e Metodi
per produrre, nella PCR, molecole di DNA amplificato contenenti la mutazione, utilizzando come stampo iniziale il plasmide wild-type. Mentre quest'ultimo, essendo stato estratto da batteri, è metilato, il DNA amplificato (mutagenizzato), prodotto in vitro, è privo di metilazione.
Dopo una corsa su gel di controllo, si effettua una digestione con l’endonucleasi di restrizione Dpn I, in grado di riconoscere sequenze metilate ed emimetilate di DNA, presenti solo sul DNA parentale non mutagenizzato e sulle molecole ibride (emimetilate) formate da una catena parentale ed una di nuova sintesi. Con questo passaggio si elimina, dal nostro campione, il DNA che non contiene siti mutagenizzati. Successivamente, con un'aliquota della reazione si effettua una trasformazione, cui segue l'estrazione del vettore plasmidico mediante "midi-prep", effettuate a partire da singole colonie. Il DNA estratto, infine, viene controllato per sequenziamento.
2.4.b Screening di colonie tramite PCR
La PCR è una tecnica che abbiamo utilizzato anche per effettuare uno
screening delle colonie trasformate con le miscele di ligation.
Le singole colonie devono essere prelevate con un'ansa sterile, stemperandole in 40 µl di brodo LB per 15 minuti. Sulle sospensioni ottenute si esegue il protocollo della PCR per verificare l'esito del clonaggio. La scelta dei primers è importante per poter diagnosticare la presenza dell'inserto all'interno del vettore plasmidico di cui abbiamo effettuato la ligation, nonché il suo corretto orientamento nel vettore. Per questo, abbiamo utilizzato come
primer 5' un primer SP6, che riconosce la sequenza dell'SP6 promoter, a
