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4.Discussione
In questo lavoro di tesi si è studiata l’organizzazione genomica di patz1 attraverso l'analisi di dati in silico, si è definito il profilo spaziotemporale dell'espressione dei trascritti di questo gene durante lo sviluppo di Xenopus laevis, attraverso esperimenti di WISH e tramite RT-PCR semiquantitativa, ed infine si sono effettuati studi funzionali preliminari di sovraespressione e down-regolazione, utilizzando la tecnica della microiniezione, per iniziare a valutare funzione e posizione di patz1 nella gerarchia dei fattori coinvolti nello sviluppo delle creste neurali.
Il gene patz1 codifica per un fattore di regolazione trascrizionale. Esso è espresso a livelli differenti nei diversi stadi di sviluppo embrionale di Xenopus laevis, anche durante gli stadi non riportati nei database di espressione (Figura 3.3), ottenuti tramite la conta delle ESTs (vedi paragrafo “3.1 ANALISI IN SILICO DI XPATZ1”). È stato visto in questo lavoro di tesi come la sua espressione, durante la neurulazione si concentri a livello del SNC, incluse le vescicole ottiche in formazione, il mesenchima perioculare e i territori presuntivi delle creste neurali. Allo stadio di tailbud, l'espressione di patz1 non si rivela solo nel tubo neurale. In particolare, nella testa, la positività è visibile anche nella vescicola otica e in quella ottica; inoltre, sono particolarmente evidenti, ai lati del rombencefalo, gli streams migratori delle NCCs.
Infine, l'espressione nel SNC non è uniforme manifestandosi più forte nella regione anteriore.
Figura 4.1 Pattern di espressione di Xhmga2 durante diversi stadi di sviluppo embrionale di Xenopus laevis, da neurula a stadio tailbud.(Macrì et al., in preparazione)
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Il segnale di espressione risulta così avere un pattern parzialmente sovrapponibile a quello presentato da HMGA2 (Figura 4.1); per questa ragione, e per l'interazione biochimica dimostrata tra PATZ1 e HMGA2 (Fedele et al., 2012) questa similitudine ha catturato la nostra attenzione. Le proteine HMGA, e il loro coinvolgimento nel processo di transizione epitelio-mesenchima, sono da diversi anni oggetto di studio nel nostro laboratorio (Macrì et al., in preparazione).
L'indagine di tale processo vede come riscontro pratico la possibilità di applicare tali conoscenze nella ricerca di strategie terapeutiche rispetto ai fenomeni metastatici (Kuriyama e Mayor, 2008).
La mancata conoscenza della sequenza completa del cDNA di patz1 in Xenopus laevis, ha costituito inizialmente per questo studio un limite nell'analisi sperimentale.
Il sequenziamento del genoma di Xenopus laevis è stato intrapreso solo successivamente a quello della specie affine Xenopus tropicalis, a causa della sua condizione pseudo-tetraploide. Abbiamo quindi fatto riferimento al genoma di Xenopus tropicalis, a causa della vicinanza genomica tra le due specie. Le regioni che risultano maggiormente conservate, dal confronto della sequenza genomica di tropicalis e le ESTs di laevis, sono state utilizzate per disegnare i primers per l'amplificazione del frammento per la produzione di un probe per WISH. Inoltre come approccio preliminare si è effettuata una ricerca in silico che permettesse di avere delle indicazioni iniziali sulla putativa sequenza del cDNA di Patz1. I database ci mostrano un gene con 6 sequenze esoniche in cui è stata identificata una cornice di lettura che corrispondeva chiaramente ad una proteina omologa a PATZ1 umana.
Questa sequenza è stata poi confrontata con alcune proteine PATZ note di altri vertebrati (Figura 1.1) mostrando una particolare conservazione dei tre domini principali: POZ, AT-hook e Zinc-finger (Fedele et al., 2000; Kobayashi et al., 2000;
Mastrangelo et al., 2000; Pero et al., 2002), e suggerendo quindi una possibile
conservazione funzionale interspecifica. La natura di questi domini ci dà una forte
indicazione di quelle che sono le funzioni osservate della proteina, ovvero un fattore
di regolazione dell’espressione genica (Pero et al., 2002; Kobayashi et al., 2000;
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Fedele et al., 2000) che grazie alla possibilità di creare interazioni con altre molecole (proteine o RNA) può avere effetti opposti (vedi sezione “1.1.2.2 FUNZIONE”).
L'analisi di espressione negli embrioni wild type ci ha permesso di osservare che il trascritto di patz1 è localizzato a livello dei territori delle creste neurali ed è espresso durante il processo di EMT e migrazione. La RT-PCR semiquantitativa mostra un interessante incremento di espressione a stadio 18 (Nieuwkoop-Faber) che potrebbe essere messo in correlazione con i picchi espressione a cui sono soggetti i geni neural crest specifiers (Figura 4.2) e con la EMT e la fase migratoria iniziale delle NCCs.
L'analisi funzionale effettuata attraverso gli esperimenti di microiniezione prende principalmente in esame la possibile correlazione tra l’azione di patz1 e il dominio delle creste neurali. La down-regolazione di due dei geni essenziali per lo sviluppo delle creste neurali, Xmsx1 e Xslug mostra una conseguente riduzione del dominio di espressione di Xpatz1 e una diminizione dell'intensità del relativo segnale in esperimenti di ibridazione in situ. Il gene msx1 permette la determinazione dei bordi delle creste neurali (Monsoro-Burq et al., 2005; Sato et al., 2006) mentre slug agisce nel processo di specificazione delle cellule della cresta neurale e di promozione della EMT (Patthey et al., 2009; Steventon et al., 2009). I due geni, inoltre, permettono un equilibrio tra attività pro-apoptotica, propria di msx1, e attività antiapoptotica, propria
Figura 4.2 Profili di espressione di Xslug (a) e Xtwist (b) negli embrioni di X.laevis; le frecce indicano la fase di picco di espressione intorno allo stadio 18. (http://www.xenbase.org/)
