LABORATORIO DI CHIMICA per VITICOLTURA ED ENOLOGIA

LABORATORIO DI CHIMICA per VITICOLTURA ED ENOLOGIA

4^a ESPERIENZA

Determinazione degli zuccheri riducenti

Prof. Claudio Lo Sterzo (closterzo@unite.it)

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Nell’uva il dosaggio degli zuccheri permette di seguire l’evoluzione della maturazione e di determinare la data ottimale di vendemmia, in quanto al di sotto di certi valori minimi di zuccheri, le uve non sono adatte a produrre vini.

Il contenuto zuccherino è usato per determinare il prezzo dell’uva.

Nell’uva sono presenti gli zuccheri sia in forma di zuccheri semplici (monosaccaridi) che in forma di disaccaridi come il saccarosio, e polisaccaridi come pectina e gomme.

Nel mosto è necessario conoscere il contenuto in zuccheri allo scopo di calcolare il titolo alcolometrico del futuro vino. Infatti, da 1 grammo di zucchero si ottengono 0.6 ml di alcol, pertanto dal tenore zuccherino del mosto moltiplicando per il coefficiente 0,6 si ottiene la gradazione alcolica del futuro vino.

Nel vino il dosaggio degli zuccheri permette di rilevare la fine della fermentazione alcolica. Si considera ultimata quando il contenuto in zuccheri risulta inferiore a 2 g/l. Questa quota residua di zuccheri nel vino è dovuta alla presenza di pentosi, infatti nel vino non è normalmente presente il saccarosio, e la sua eventuale presenza è uno dei parametri di controllo della genuinità. Per questo motivo nel vino i suoi derivati di idrolisi (glucosio e fruttosio) si trovano solo in tracce.

Nel mosto sono contenuti varie tipologie di zuccheri:

gli esosi: (glucosio e saccarosio e fruttosio) che sono zuccheri fermentescibili, ovvero durante la fermentazione alcolica sotto l’azione dei lieviti vengono trasformati in alcol.

Il glucosio e fruttosio sono chiamati zuccheri riducenti, ovvero sono capaci di ossidarsi.

C

OH H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH

CH₂OH

C O

H HO

OH H

OH H

CH₂OH

D-glucosio D-fruttosio

O H O

H

HO

H HO

H

OH

H H

O CH₂OH

2 1 3

4

5 6

CH₂OH

CH₂OH

H OH H

H OH 1 O

2

3 4

5 6

Saccarosio

4

Altri zuccheri presenti nel mosto sono i pentosi e rappresentano quella quantità di zuccheri, anch’essi con proprietà riducenti, ma non sono zuccheri fermentescibili, quindi sono ancora presenti e determinabili nel vino, cioè in un vino in cui i lieviti hanno finito la fermentazione alcolica e quindi hanno consumato tutti gli esosi.

Per questo nel vino sono presenti forme levo dell'arabinosio, dello xilosio e quella destro del ribosio. In piccole quantità è presente un altro zucchero appartenente ai pentosi, nonostante abbia sei atomi di carbonio, il ramnosio, che è considerato un è un metilpentosio.

C

OH H

OH H

OH H

CH₂OH D-Ribosio O H

C H HO

OH H

H HO

CH₂OH L-Xilosio O H

C

OH H

H HO

H HO

CH₂OH L-Arabinosio O H

C

OH H

OH H

H HO

L-Ramnosio O H

CH₃ H HO

Il glucosio è presente in modo largamente prevalente nella forma di glucopiranosidica D(+), mentre per il fruttosio è prevalente la forma fruttofuranosidica D (-). Secondo la

nomenclatura tradizionale vengono anche chiamati destrosio e levulosio. Per il verso destrorso e sinistrorso in cui ruotano il piano della luce polarizzata.

C OH H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH D-glucosio O H

H O

OH

OH

H H

OH H

OH CH₂OH

1

2 3 4 5 6 1

3 2 4

5 6

H O

OH

H

OH H

OH H

OH CH₂OH

1 3 2

4 5 6

β-D-glucopiranosio

α-D-glucopiranosio

CH₂OH C O H HO

OH H

OH H

CH₂OH CH₂OH

OH

H CH₂OH

OH H

H OH

O

1

2 3 4 5 6 1

2

4 3 5

6

OH CH₂OH

H CH₂OH

OH H

H OH

O

1

2

4 3 5

6

6

Gli zuccheri sono classificati in riducenti e non riducenti secondo la loro capacità di ridurre particolari reattivi in ambiente basico.

Il gruppo aldeidico di uno zucchero riducente come ad esempio quello del glucosio può quindi essere ossidato formando un gruppo carbossilico.

Anche se il glucosio esiste in soluzione in forma prevalentemente ciclica, in cui il gruppo aldeidico è presente in forma semiacetalica, nell’ambiente basico in cui viene condotta l’ossidazione, è favorita l’idrolisi della funzione semiacetalica con ricostituzione della funzionalità aldeidica libera che può quindi essere ossidata, esplicando così la sua azione riducente.

C O H

ossidazione C O OH

+1 +3

C

OH H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH D-glucosio O H

C

OH H

H HO

OH H

O H

CH₂OH β-D-glucosio

H

HO C

OH H

H HO

OH H

O H

CH₂OH α-D-glucosio

OH H

O H

HO

H HO

H

H

H OH OH

CH₂OH

O H

HO

H HO

H

OH

H OH H

CH₂OH H O

OH

OH

H H

OH H

OH CH₂OH

2 1 3

4 5

6 1

2 3 4 5 6

1

2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

1 3 2

4

5 6

2 1 3

4 5

6

H O

OH

H

OH H

OH H

OH CH₂OH

1 3 2

4

5 6

β-D-glucosio

β-D-glucosio

α-D-glucosio

α-D-glucosio

8

C

OH H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH D-glucosio O H

Ossidazione

C

OH H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH Acido D-gluconico

O OH

Ossidazione del glucosio ad acido gluconico

L’ossidazione avviene in ambiente basico anche su zuccheri che inizialmente non contengono la funzione aldeidica, come nel caso del fruttosio, ma che la possono generare per isomerizzazione alcalina. Infatti, nelle condizioni in cui viene condotta tale analisi, si ottiene risposta positiva anche su zuccheri con funzionalità chetoniche (chetosi), come il fruttosio, che viene isomerizzato a glucosio e mannosio e poi in queste forme viene ossidato, rispettivamente ad acido gluconico e acido mannonico

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CH₂OH

C O

H HO

OH H

OH H

CH₂OH D-fruttosio

C

C O

H HO

OH H

OH H

CH₂OH D-fruttosio

OH^-

C

C OH H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H OH

enediolo C

C O

H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H OH

H₂O H

H OH C

C O

H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H OH

carbanione stabilizzato per risonanza

Formazione di funzionalità aldeidiche a partire dal fruttosio

OH^- C

C OH H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H OH

enediolo

C

C OH H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H O C

C OH H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H O

H₂O

C

C OH H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H O

H

D-glucosio Ox

C

C OH H HO

OH H

OH H

CH₂OH

HO O

H

Acido D-gluconico

C C H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH

H O

HO

D-mannosio Ox

C C H

H HO

OH H

OH H

CH₂OH

HO O

HO

Acido

Isomerizzazione del fruttosio a glucosio e mannosio

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La conoscenza del grado zuccherino è un parametro che permette di seguire la maturazione dell'uva nei suoi vari stadi ed a trovare il momento esatto per la vendemmia.

La determinazione delle quantità di zuccheri presenti nei mosti è tra le analisi più importanti, poichè dalla maggiore o minore ricchezza zuccherina dipenderà la maggiore ricchezza alcolica del futuro vino.

E' indispensabile inoltre per trarre norme sicure sulle eventuali correzioni da farsi sui mosti deficienti di zucchero e per la preparazione di filtrati dolci.

E' importante la determinazione degli zuccheri residui nei vini anche per conoscere e corrispondere ad esigenze legali e tecnologiche nella preparazione dei vini amabili e dolci, dei vini speciali (liquorosi, spumanti, aromatizzati ecc.).

Al termine del processo di vinificazione, nel vino rimane spesso un residuo zuccherino dello 0,5-1,5 % ( ad eccezione dei vini dolci dove la percentuale sale al 5-8% ).

Secondo il tenore di zuccheri presenti, i vini vengono classificati come secchi, amabili, dolci....; vini dolci e liquorosi contengono una quantità di zuccheri non fermentati più elevata che ne conferisce il sapore dolce.

La quantità di zuccheri riduttori viene espressa in g/L di zucchero invertito (C₆H₁₂O₆).

I vini

- si definiscono “secchi” quando il loro contenuto in zuccheri è inferiore a 2 g/l, in quanto fino a tale valore gli zuccheri non sono rilevabili al gusto.

- si definiscono “abboccati” se contengono dai 10 ai 20 g/l di zuccheri, - si definiscono “amabili” se contengono dai 20 ai 30 g/l di zuccheri, - si definiscono “dolci” se contengono più di 30 g/l di zuccheri.

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O H

HO

H HO

H OH

H H

O CH₂OH

2 1 3

4 5 6

CH2OH

CH₂OH

H OH H

H OH 1 O 2

3 4

5 6

Saccarosio

O H

HO

H HO

H OH

H H

OH CH₂OH

2 1 3

4 5 6

O H

HO

H HO

H OH

H OH

H CH₂OH

2 1 3

4 5 6

H CH₂OH

CH₂OH OH

OH H H OH

O

1 2 4 3

5 6

H CH₂OH

OH CH2OH

OH H H OH

O

1

2 3 4 5

6

+

+

β-D-fruttofuranosio α-D-fruttofuranosio

β-D-glucopiranosio α-D-glucopiranosio

α = + 66.5°

α = + 52.5°

α = - 92°

α = - 20.2°

Lo zucchero invertito è una miscela di glucosio e fruttosio ottenuta dal saccarosio in seguito all'idrolisi catalizzata da acidi. Lo zucchero invertito viene così definito perché il saccarosio ha un potere rotatorio specifico di +66.5°. In seguito a idrolisi si forma una miscela equimolare di glucosio e fruttosio (ciascuno di essi in equilibrio tra forme anomeriche α e β attraverso la forma aperta). La miscela degli anomeri α e β del glucosio ha potere rotatorio +52.5°, mentre la miscela degi anomeri α e β del fruttosio ha potere rotatorio - 92°, pertanto il potere rotatorio complessivo della miscela è di -20.2°. Complessivamente quindi con l’idrolisi si passa dal potere rotatorio positivo (+66.5) del saccarosio a quello negativo (-20.2°) della miscela dei prodotti di idrolisi (inversione del senso di rotazione della luce polarizzata).

Determinazione degli zuccheri nei vini per via chimica

Il metodo più diffuso per la determinazione degli zuccheri per via chimica è quello volumetrico. Esso consiste nel misurare il volume di soluzione zuccherina necessario per la completa riduzione di un certo volume di reattivo (soluzione cupro-alcalina o reattivo di Fehling), impiegando come indicatore il blu di metilene.

Questo è il metodo ufficiale Italiano che differisce da quello ufficiale C.E.E. (che prevede un dosaggio iodometrico) e offre una rapidità e semplicità delle operazioni nonché una buona riproducibilità e precisione dei risultati.

L'impiego delle soluzioni rameiche permette di riconoscere gli zuccheri aventi libera una funzione aldeidica o chetonica che, direttamente o per isomerizzazione a caldo e in soluzione alcalina, riducono il sale rameico, facendo precipitare il caratteristico ossidulo di rame, rosso, mentre gli zuccheri si ossidano ad acidi. In pratica avviene una reazione di ossido-riduzione, in cui il sale rameico, l'agente ossidante, si riduce reagendo con gli zuccheri riducenti, con il rame che precipita sotto forma di ossido rameoso.

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Reazione redox con il reattivo di Fehling

Nel reattivo di Fehling è presente lo ione rameico (Cu²⁺), che si riduce, in ambiente basico, a ione rameoso (Cu⁺), formando un precipitato di ossido rameoso (Cu₂O), di colore rosso mattone. Il gruppo aldeidico dello zucchero invece, si ossida a acido carbossilico.

R C

O H

+ 2 OH

R C

O OH

+ H₂O + 2 e

2 Cu²⁺ + 2 e

+ 2 OH

Cu₂O + H2O

R C

O

H + 2 Cu²⁺ ₊ 4 OH R C O OH

Cu₂O + H2O +

ossido rameoso (rosso)

+1 +2 +3

+1 +3

+2 +1

+1

semireazione di ossidazione semireazione di riduzione

Preparazione del reattivo di Fehling

Il reattivo di Fehling non è molto stabile, in quanto lo ione rameico (Cu²⁺), contenuto nella soluzione, potrebbe precipitare come idrossido rameico per la presenza di NaOH.

Per ovviare a questo problema si preparano due soluzioni chiamate, Fehling A e Fehling B.

La soluzione Fehling A viene preparata disciogliendo del solfato rameico pentaidrato (CuSO₄Ÿ5 H₂O) in acqua distillata. La soluzione Fehling B viene preparata disciogliendo il tartrato doppio di sodio e potassio ( detto sale di Rochelle o sale di Seignette) in acqua, seguito da aggiunta di idrossido di sodio.

Cu²⁺ + 2 OH^- Cu(OH)₂

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Il tartrato di sodio e potassio è un sale misto di sodio e potassio dell'acido tartarico che viene chiamato anche sale di Rochelle o sale di Seignette.

Il tartrato ha sostanzialmente la funzione di mantenere gli ioni rameici in soluzione a pH alcalino, evitando la formazione di idrossido di rame.

C C C C

O O

O O

Na

K OH H

OH H

Mescolando le due soluzioni, si forma un complesso rame-tartrato in cui lo ione rameico grazie al complesso tartrato sodico potassico che rimane in soluzione, impedendogli quindi di precipitare come idrossido.

Le due soluzioni vanno conservate separatamente e al momento dell’uso si mescolano in parti eguali nella quantità necessaria per l’esperienza. Il reattivo è stabile per circa 30 minuti dalla preparazione.

C C C C

O O

O O

Na

K OH H

OH H

C C C C

O O

O O

Na

K

O H

O

H Cu

C C C C O O

O O

Na

K

O H

O H

H

H 2+ - -

2

Tartrato di Sodio e Potassio (Soluzione Fehling A)

+ CuSO₄ + 2 NaOH Solfato rameico in NaOH (Soluzione Fehling B)

Complesso rameico di tartrato di sodio e potassio (Reattivo di Fehling)

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ANALISI DEGLI ZUCCHERI RIDUCENTI (METODO DI FEHLING) Procedimento

(per l’esperienza di laboratorio verrà fornita una scheda pratica sulle procedure)

Questo metodo permette di analizzare sia da un punto di vista qualitativo, come test, la presenza di zuccheri riducenti, sia da un punto di vista quantitativo, mediante un metodo volumetrico (titolazione con buretta) o gravimetrico (determinazione della massa di Cu₂O prodotta nella reazione di Fehling).

Altri metodi per determinare gli zuccheri sono il metodo densimetrico (con misure di

densità), il metodo rifrattometrico (utilizza il rifrattometro di Abbe, strumento facile, rapido e veloce per avere un primo indice dello zucchero presente) e il metodo polarimetrico (utilizza un polarimetro).

La determinazione, che può essere sia qualitativa che quantitativa prevede diverse fasi:

1) DILUIZIONE:

a) Si determina il probabile contenuto zuccherino del vino in esame con un comune densimetro Baumè (la temperatura del vino deve essere intorno ai 20°C).

b) Si effettua sul vino un numero di diluizioni tale da avere, dopo aver defecato e portato a volume, una concentrazione zuccherina compresa tra 0.5 e 1%, questo perché tale metodo è valido per contenuti di zuccheri nel vino non superiori all’1%, altrimenti è necessario diluire.

La seguente tabella fornisce il numero delle diluizioni da effettuare una volta determinata la densità del vino .

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Altra possibilità di diluizione:

Per eseguire questa operazione può essere utile lo schema seguente.

In pallone tarato da 100 ml porre a seconda dei casi:

1) vini secchi: 50 ml vino non diluito;

2) vini abboccati: con densità compresa fra 0,997 e 1,006, 20 ml di vino non diluito;

3) vini dolci: con densità compresa fra 1,005 e 1,038, 20 ml di vino diluito al 20%;

4) mosti: porre nel pallone 10 ml di mosto diluito al 10%.

Si porta a volume 100 ml con acqua distillata.

Pertanto:

1 ) 1 ml corrisponde a 0,5 ml vino secco;

2) 1 ml corrisponde a 0,2 ml vino abboccato;

3) 1 ml corrisponde a 0,04 ml vino dolce;

4) 1 ml corrisponde a 0,01 ml mosto.

2) NEUTRALIZZAZIONE: Il campione di mosto, o di vino, diluito viene neutralizzato impiegando idrossido di sodio NaOH 1N utilizzando una cartina indicatrice. E’ bene però che il pH del campione risulti appena inferiore a 7, per questo è sufficiente che venga raggiunto un pH intorno a 6.5-7. Eventualmente dopo l’aggiunta della base, se necessario si aggiungono alcune gocce di acido acetico diluito.

3) DEFECAZIONE: serve ad eliminare dal mosto o dal vino, mediante precipitazione e/o filtrazione, le sostanze riducenti diverse dagli zuccheri e che falserebbero la

titolazione.

a) Decolorazione con carbone

Si prelevano 100 ml di vino o mosto in esame, già preventivamente diluiti (se

necessario), si pongono in una beuta e si aggiungono, a seconda dell'intensità della colorazione da 0,5 g a 2 g di carbone colorante in polvere. Si agita ripetutamente ogni 3-5 minuti e dopo 5 minuti si filtra su filtro a pieghe. Per i vini e i mosti bianchi, diluiti almeno 10 volte, può non essere necessario procedere alla decolorazione.

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b) Defecazione con acetato neutro di piombo Reattivi:

•Acetato neutro di piombo Pb (CH₃COO)₂ x 3 H₂O; Sciogliere 250 grammi di acetato neutro di piombo in acqua molto calda, agitare fino a completa dissoluzione e portare a volume a 500 ml

•NaOH 1N

•Carbonato di calcio CaCO₃ Procedimento

Vini secchi: Introdurre 50 ml in un pallone tarato da 100 ml; aggiungere ½ (n-0,5) ml di

soluzione 1 M di idrossido di sodio dove n è il volume di soluzione 0,1 M di idrossido di sodio utilizzati per dosare l’acidità totale di 10 ml di vino. Aggiungere agitando 2,5 ml di soluzione satura di acetato di piombo e 0,5 gr di carbonato di calcio; agitare a più riprese e lasciare riposare per almeno 15 minuti; portare a volume con acqua. Filtrare. 1 ml di filtrato

corrisponde a 0,5 ml di vino

Mosti, vini amabili e dolci: In un pallone tarato da 100 ml introdurre un volume di vino o di mosto definito come segue (le diluizioni sono riportate a titolo indicativo):

•mosti: diluire il prodotto 10 volte (10%) prelevare 10 ml di tale soluzione (totale 100 dil.)

•vini dolci: diluire il prodotto 5 volte (20%) prelevare 20 ml di tale soluzione (totale 25 dil.)

•vini amabili: prelevare 20 ml di vino non diluito (totale 5 dil.)

Aggiungere 0,5 gr. di carbonato di calcio; ca. 60 ml di acqua e 0,5, 1,0, 2,0 ml di soluzione satura di acetato di piombo; agitare a più riprese e lasciare riposare per almeno 15 minuti;

portare a volume con acqua. Filtrare.

c) Defecazione (con Carez1 e Carez2) Reattivi:

n. 1 = ferrocianuro di potassio (soluzione al 15%). Pesare 75 grammi di potassio ferrocianuro alla bilancia tecnica in un pallone da 500 ml. Aggiungere acqua distillata senza raggiungere il livello. Agitare, senza capovolgere il pallone, per favorire la dissoluzione del sale. Se necessario immergere il pallone nel bagno ad ultrasuoni fino al completo scioglimento. Quindi aggiungere altra acqua distillata fino ad un paio di cm dal livello ed immergere il pallone nel bagno termostatico affinché la temperatura della soluzione raggiunga i 20°C dopo di ché portare a volume ed agitare capovolgendo il pallone almeno tre volte.

n. 2 = zinco acetato (soluzione al 30%). Pesare 150 grammi di zinco acetato alla bilancia tecnica in un pallone da 500 ml. Aggiungere acqua distillata senza raggiungere il livello.

Agitare, senza capovolgere il pallone, per favorire la dissoluzione del sale. Se necessario immergere il pallone nel bagno ad ultrasuoni fino al completo scioglimento. Quindi aggiungere altra acqua distillata fino ad un paio di cm dal livello ed immergere il pallone nel bagno termostatico affinché la temperatura della soluzione raggiunga i 20°C dopo di ché portare a volume ed agitare capovolgendo il pallone almeno tre volte.

Procedimento

Al campione di mosto o di vino, posto in matraccio tarato, neutralizzato e diluito con un pò di acqua, si aggiungono 2 mL della soluzione n: 1 e 2 mL della soluzione n: 2. Si agita e quindi si lascia a riposo per qualche minuto; infine si porta a volume e si filtra. I vini rossi, molto colorati, si decolorano difficilmente. In questo caso si può aggiungere circa mezzo grammo di carbone decolorante, si porta a volume, si agita e si lascia riposare qualche tempo prima di filtrare.

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4) DOSAGGIO:

Per effettuare la prova qualitativa si pone in una provetta 1 mL del liquido in cui si vuol evidenziare la presenza di zuccheri e si aggiungono 2 mL della miscela preparata (Fehling A+ Fehling B).

Si scalda il tutto alla fiamma per alcuni secondi.

In presenza di zuccheri il liquido acquisterà una colorazione variabile tra il

giallo-uovo, l'arancio ed il rosso mattone, lasciando a riposo la provetta per un po' di tempo il colore si depositerà sul fondo sotto forma di un precipitato

insolubile di composti di rame.

Per poter apprezzare meglio l'effetto è opportuno che il liquido su cui si effettua il test sia limpido, nel caso siano presenti particelle solide in sospensione è meglio effettuare la filtrazione prima di effettuare la ricerca ed utilizzare la soluzione limpida così ottenuta.

Nel caso la quantità di zuccheri presente nel campione fosse bassa il colore può diventare, invece che giallo o rosso, di un verde torbido.

Materiali:

Acqua distillata.

Blu di metilene (soluzione acquosa all'1 %).

Preparazione della soluzione di Fehling A: in pallone tarato da 1000 mL si sciolgono 69,278 g di solfato rameico pentaidrato CuSO₄ • 5 H₂O con acqua distillata o deionizzata e si porta a volume, si ottiene una soluzione

intensamente colorata in blu.

Preparazione della soluzione di Fehling B: in pallone tarato da 1000 mL si sciolgono 346 g di sale di Seignette (tartrato di sodio e potassio) e 100 g di idrossido di sodio (NaOH) in acqua distillata o deionizzata; a soluzione

avvenuta si porta a volume.

Attrezzatura:

Piastra riscaldante Beuta da 250 mL Buretta da 50 mL

Cilindro graduato da 50 mL Matraccio tarato da 100 mL

Palline di vetro (o pietra pomice)

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Procedimento per la determinazione quantitativa degli zuccheri riduttori:

Una piccola aliquota (alcuni ml) di vino o il mosto da analizzare che è stato diluito (punto 1), neutralizzato (punto 2), defecato (punto 3a, punto 3b oppure punto 3c,) e filtrato, viene utilizzata per avvinare la buretta (due volte) e quindi scartata, quindi con si riempie quindi la buretta con la soluzione da analizzare.

In una beuta da 250 mL si pongono nell'ordine 5 mL di soluzione di Fehling A; 5 mL di soluzione di Fehling B e 40 mL di acqua distillata. Si ottiene una soluzione intensamente colorata in blu. Si aggiungono inoltre 3-4 palline di vetro (o pietra pomice) per regolare l'ebollizione così da evitare pericolosi schizzi nella parte successiva del procedimento.

Si pone su una piastra riscaldante e si porta all'ebollizione il contenuto della beuta.

Raggiunta l’ebollizione dalla buretta graduata si fa scendere goccia a goccia la soluzione in esame interrompendo quando si ha la quasi decolorazione del liquido di Fehling con la formazione di un introbidamento color rosso mattone. Si lascia bollire un minuto esatto, quindi si aggiungono 2 gocce di blu di metilene, con formazione di una soluzione blu scura. Si lascia bollire un minuto esatto e sempre mantenendo il liquido in ebollizione si fa cadere altra soluzione zuccherina fino a scomparsa della colorazione azzurra del blu di metilene, con il ritorno del colore rosso mattone.

Infatti questo indicatore viene ridotto e decolorato dagli zuccheri riducenti quando tutto il rame è precipitato.

Leggere sulla buretta la quantità di vino-mosto utilizzata.

Osservazioni

La prova è tanto migliore quanto più risulta rapida, l'uso del blu di metilene non è obbligatorio ma è molto difficile distinguere il punto di fine titolazione solo utilizzando la colorazione azzurrina del rame rameico.

Si consiglia inoltre di utilizzare solo una-due gocce di blu di metilene per evitare di avere un eccesso di colore blu, il viraggio dovrebbe essere sufficientemente chiaro per tutti gli occhi. Si consiglia inoltre di utilizzare un cartoncino o un foglietto di carta così da coprire la beuta nel corso della titolazione così da evitare che l'ossigeno dell'aria, entrando nel sistema, reagisca nuovamente con il blu di metilene ridotto (incolore) riossidandolo (alla forma blu) che come si intuisce crea un errore casuale in eccesso sul valore reale della titolazione.

Terminata la titolazione l'ossigeno dell'aria se entra nel sistema lo ricolora a blu in base a quanto appena descritto, quindi non preoccuparsi e rimanere tranquilli sul proprio risultato.

Il metodo risulta valido solo se la titolazione è rapida (3 minuti) e la concentrazione in zuccheri del campione è compreso tra lo 0,5 e l'1%.

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Se per la titolazione sono stati utilizzati meno di 5 ml di soluzione zuccherina, si sottraggono 0.1 ml per tener conto della quantità che occorre per decolorare il blu di metilene. Se invece sono stati utilizzati più di 5 ml, se ne sottraggono 0.2 ml dalla formula per il calcolo della quantità di zuccheri riduttori. Per il calcolo indicando con

"A" il numero dei ml di liquido zuccherino necessari per ridurre 10 ml di liquido di Fehling e con "D" la diluizione totale del vino, gli zuccheri riduttori sono espressi dalle seguenti formule:

Calcoli:

La determinazione degli zuccheri avviene attraverso la formula:

g/L di monosaccaride (tipicamente glucosio) = 0,05154 • 1000 • D / A

dove:

0,0515 che indica la quantità di zucchero necessaria per ridurre la soluzione di Fehling impiegata (mL 10);

D il numero delle diluizioni operate sul prodotto (mosto o vino);

A la quantità di soluzione impiegata per ridurre i 10 mL di liquido di Fehling diluito con 40 mL di acqua.

Le formule di calcolo possono anche essere così rappresentate: