3. MATERIALI E METODI
3.1 GENERAZIONE DEI TOPI Otx1
-/-pSil/Scl
Per la generazione dei topi doppi mutanti Otx1-/-; pSil/Scl, oltre alla linea
knock-out per Otx1 generata nel laboratorio del Dr. Simeone (Acampora et al.,
1996), ho impiegato anche quella dei topi pSil/Scl generata dal gruppo di Aplan
(Aplan et al., 1997). A causa delle gravi anomalie fenotipiche i topi Otx1-/- non
sono adatti alla riproduzione, per cui ho utilizzato, negli incroci tra le due linee
primarie, topi Otx1+/- e topi pSil/Scl. Nella generazione F1 ho selezionato
animali Otx1+/-; pSil/Scl, dal reincrocio dei quali ho ottenuto una progenie F2 di
diversi individui, tra cui alcuni Otx1-/-; pSil/Scl.
Il genotipo dei topi generati è stato analizzato tramite PCR sul DNA genomico
ricavato da frammenti prelevati dall’estremità distale della coda.
3.2 SAGGIO CLONOGENICO IN METILCELLULOSA
Per lo studio dei precursori ematopoietici dei topi wild type e Otx1-/-, dal
momento che si tratta di cellule rare, indifferenziate e pertanto non isolabili in
maniera omogenea sulla base dell’espressione di antigeni di superficie, viene
utilizzato il saggio clonogenico in terreno semisolido. Questo sistema di coltura
consente di analizzare le potenzialità proliferative e differenziative dei
precursori ematopoietici in base al tipo di cloni da essi derivati in vitro. La
metilcellulosa viene in genere utilizzata come mezzo semisolido perché è
solubile in acqua a qualsiasi temperatura, inerte, priva di contaminanti
3.2.1 Protocollo del saggio clonogenico
Le colture di metilcellulosa sono eseguite in piastre Petri dal diametro di 35
mm, in un volume finale di 1 ml.
Le condizioni utilizzate per il test clonogenico sono le seguenti:
Fetal Calf Serum (FCS) 5%
Bovine Serum Albumin (BSA) 20%
Transferrina (Tf) 300ng/ml
Lipidi 0.8%
Eritropoietina (Epo) 2U/ml
Stem Cell Factor (SCF) 10 ng/ml
Interleuchina-3 (IL-3) 10 ng/ml
Trombopoietina (TPO) 25 ng/ml
Metilcellulosa (Mtc) 60%
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) a volume
Un fattore determinante per la corretta riuscita del saggio è la percentuale di
metilcellulosa, infatti il mezzo di coltura deve essere abbastanza fluido da
permettere alle cellule di sedimentare in un unico piano entro 24 ore
(impedendo quindi la formazione di multistrati sovrapposti), tuttavia
abbastanza viscoso da sfavorire la fluttuazione delle colonie o la loro
disgregazione. Il midollo è prelevato dai femori e dalle tibie dei topi
sciacquando la cavità midollare delle ossa con una siringa; le sue cellule
vengono disgregate, risospese in IMDM al 5% di FCS, contate in una camera
di Burker e coltivate a diverse concentrazioni: 25.000, 100.000 per ml. Le
incubatore a 37°C, al 5% CO2 atmosferica. Al giorno 2 è possibile osservare
colonie di tipo eritroide CFU-E formate da piccole cellule compatte originate
da precursori tardivi della linea eritroide, e a giorno 7 si riconoscono colonie
emoglobinizzate, derivate da precursori unipotenti precoci, appartenenti alla
linea eritroide (BFU-E); colonie di tipo granulocitico-macrofagico derivate da
precursori bipotenti (CFU-GM), colonie miste, formate anche da milioni di
cellule, appartenenti a differenti tipi cellulari (eritrociti, granulociti, macrofagi,
megacariociti) che derivano da precursori multipotenti (CFU-MIX).
Infine si possono trovare colonie formate da soli megacariociti, derivanti da un
precursore unipotente CFU-Mk, da soli macrofagi o da soli granulociti, le
prime derivate da precursori unipotenti CFU-M, le seconde da precursori
unipotenti CFU-G e sono distinguibili ad un’analisi morfologica delle cellule
che le compongono.
3.3 CONGELAMENTO DELLE CELLULE
Le cellule vengono congelate in IMDM in presenza di 10% DMSO
(dimetilsulfossido) e 30% di FCS, in un volume finale di 1,5 ml e ad una
concentrazione finale pari a 7x106c/vial.
3.4 SCONGELAMENTO DELLE CELLULE
Le cellule vengono scongelate a 37°C per accelerare il processo ed impedire
eventuali danni da parte del DMSO, che è tossico. La sospensione cellulare
viene immediatamente trasferita in una provetta contenente IMDM al 10% di
cellulare viene risospeso in IMDM al 10% di siero. Le cellule sono poi contate
e poste in coltura nelle opportune condizioni.
3.5 REAGENTI
3.5.1 IMDM ( Iscove’s modified Dulbecco’s medium)
Una confezione di IMDM (Gibco) viene sciolta in 900ml di acqua bidistillata.
A questi sono aggiunti:
- 6,3 μl di α-tioglicerolo;
- penicillina e streptomicina ad una concentrazione finale di 100u/ml;
- 50 ml di una soluzione contenente 3,024 gr di NaHCO3.
Infine la soluzione è portata a volume (1 litro) con acqua bidistillata.
Il mezzo viene poi filtrato utilizzando filtri di acetato di cellulosa (diametro dei
pori 0.2 μm) e conservato a + 4°C.
3.5.2 Preparazione della metilcellulosa
In una beuta sterile e pesata, vengono versati 450 ml di acqua bidistillata e
portati ad ebollizione su fiamma bunsen. Si aggiunge all’acqua 20 gr di Mtc e
la beuta viene coperta con un foglio di alluminio.
La Mtc viene accuratamente sospesa con un vigoroso scuotimento della beuta,
la sospensione è nuovamente scaldata fino ad ebollizione e immediatamente
tolta dalla fiamma.
La beuta viene poi raffreddata sotto acqua corrente fino ad una temperatura di
Si aggiungono 500 ml di IMDM 2x e acqua distillata fino a raggiungere un
peso di 1006 grammi. Dopo ulteriore agitazione, la beuta è posta in ghiaccio
per 1-2 ore. Successivamente il preparato viene suddiviso in aliquote da 50 ml
conservate a –20°C. Prima dell’uso le aliquote devono essere scongelate per
due giorni a + 4°C.
3.6 ESTRAZIONE DELL’RNA TOTALE DA CELLULE DI
MIDOLLO
L’RNA totale è stato isolato a partire da 107 cellule di midollo di topi wild type
e Otx1-/- di 1 mese di vita. L’estrazione è stata effettuata utilizzando il kit di purificazione GenEluteTMMammalian Total RNA (Sigma). Ad ogni campione
vengono aggiunti 500μl di soluzione di lisi e del β-mercaptoetanolo che serve ad inattivare le RNasi. Dopo aver omogeneizzato le cellule vortexandole o
facendole passare per l’ago di una siringa, il lisato viene passato in una colonna
di filtrazione, centrifugato per rimuovere i detriti cellulari e il DNA e lavato in
etanolo al 70%, per essere pronto al legame. La miscela di lisato /etanolo viene
quindi passata in una colonna che lega specificamente l’RNA (GenElute
Binding Column), centrifugata e sottoposta ad una serie di lavaggi di
purificazione. Infine l’RNA totale viene eluito dalla colonna da una soluzione
3.7 ESTRAZIONE DELL’mRNA DA POOLs DI COLONIE
CFU-GM
L’RNA messaggero è stato isolato a partire da pools da 500.000 fino a
2.500.000 cellule di colonie GM al giorno 7 di topi wild type e Otx1-/-. L’estrazione è stata effettuata utilizzando il kit di purificazione MicroPoly(A)
PuristTM (Ambion). A ciascun campione è aggiunto un opportuno volume di soluzione di lisi che favorisce la disgregazione e l’omogenizzazione delle
cellule. Il lisato viene diluito (Diluition Solution) e centrifugato al fine di far
depositare e quindi rimuovere le proteine insolubili. Ad ogni campione viene
aggiunto 1 tube di Oligo(dT) Cellulosa (fornita dal kit) che serve a far avvenire
l’ibridazione fra le sequenze di acido poliadenilico, presenti all’estremità 3’
degli mRNA, e gli oligo(dT) attaccati covalentemente alla resina. La miscela
viene lasciata in incubazione a temperatura ambiente per 15 minuti (per
permettere un primo arricchimento in RNA), e centrifugata per ottenere la
precipitazione dei complessi formatisi. A seguito della rimozione del
sovranatante, il pellet è stato risospeso in tampone (Lysate Wash) e trasferito in
una colonna da centrifuga in grado di trattenere gli ibridi formatisi. Terminata
questa prima selezione, la resina viene nuovamente sospesa in una soluzione
(2XBinding Solution) la quale crea le condizioni ottimali per l’ulteriore
ibridazione dell’mRNA alla resina. Segue un’incubazione, dapprima a 68-75°C
per 5 minuti (per denaturare le strutture secondarie formate dall’RNA) e
successivamente a temperatura ambiente per 15 minuti con una costante
agitazione (per permettere l’ibridazione tra gli oligo (dT) e le code di poli-A). I
campioni a questo punto sono stati centrifugati per ottenere la precipitazione
2) che servono a rimuovere il materiale che si è legato alla resina in maniera
aspecifica e l’RNA ribosomale Una volta centrifugati, i campioni di mRNA
sono stati eluiti con un tampone di eluizione (THE RNA Storage Solution),
precedentemente riscaldato per migliorare la resa della reazione, e quindi
precipitati in etanolo con Acetato di ammonio e glicerolo a -80°C per 30
minuti, centrifugati e risospesi nella soluzione di storaggio. L’RNA
messaggero viene conservato a -80°C.
3.8 TRATTAMENTO DELL’RNA TOTALE CON DNasiI
L’RNA totale è stato trattato utilizzando la Deossiribonucleasi I (Sigma).
La miscela di reazione contiene :
10x Reaction buffer (costituito da 200mM Tris-HCl, pH 8.3, con 20mM
MgCl2)
Amplification Grade DNasi I (1 unità/μl in 50% glicerolo, 10mM Tris-HCl, pH
7.5, 10mM CaCl2 e 10mM MgCl2)
La miscela è stata incubata a temperatura ambiente per 15 minuti per
consentire l’azione dell’enzima DNasi I.
Successivamente è stata aggiunta la Stop Solution (50 mM EDTA) in grado di
legare gli ioni Calcio e Magnesio e inattivare l’enzima.
La miscela è stata incubata a 70°C per 10 minuti al fine di denaturare la DNasi
3.9 RETROTRASCRIZIONE CLASSICA
L’RNA totale è stato retrotrascritto in cDNA utilizzando il ImProm-IITM
Riverse Transcription System per RT-PCR (Promega) in un volume di reazione
di 20μl.
Il campione è stato dapprima incubato a 70°C per 5 minuti in una soluzione
contenente Random Primers (0.5 μg/μl) e H2O Nuclease-Free.
Successivamente, è stata aggiunta la miscela contenente:
H2O Nuclease-Free
ImProm-IITM 5x Reaction Buffer
MgCl2 (25mM)
Miscela di desossinucleotidi (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), ognuno 10mM
Recombinant RNasin Ribonucleasi Inibitrice
ImProm-IITM Retrotrascrittasi
La miscela di reazione è stata incubata prima a 25°C per 5 minuti (in modo da
permettere l’ibridazione dei primers all’RNA) e poi a 42°C per 60 minuti (per
consentire l’azione dell’enzima). Successivamente l’enzima è stato disattivato
tramite incubazione a 70°C per 15 minuti.
3.10 AMPLIFICAZIONE TRAMITE PCR
SEMIQUANTITATIVA
I campioni retrotrascritti di midollo osseo e di CFU-GM di topi wild type e
Otx1-/- sono stati amplificati mediante PCR per analizzare l’espressione dei geni PU.1 e C/EBPα. Al fine di comparare l’espressione di questi geni in campioni contenenti la stessa quantità di cDNA, ho eseguito una PCR
Per identificare la quantità ottimale di ciascun campione sulla quale
successivamente analizzare l’espressione di PU.1 e C/EBPα ho eseguito la PCR su varie diluizioni (1:10; 1:100; 1:1000) dei cDNA finché, confrontando
le rese di tutte le amplificazioni, ho individuato la coppia di cDNA Otx1+/+ e
Otx1-/- che mi amplificasse Hprt in quantità paragonabili.
Per evitare la sintesi di falsi prodotti di PCR, derivanti da possibili
contaminazioni di DNA genomico, ho cercato di scegliere le varie coppie di
primers in modo che comprendessero una regione intronica, cosicché i prodotti
di amplificazione del cDNA e dell’eventuale DNA genomico contaminante
venissero discriminati in base alla loro lunghezza. Questo è stato possibile per
Hprt e PU.1, ma non per C/EBPα, dal momento che si tratta di un gene senza introni. I primers specifici per PU.1, C/EBPα e Hprt
(Ipoxantina-Fosfo-Ribosil-Transferasi) sono stati sintetizzati da Invitrogen con le seguenti
sequenze:
Hprt primer al 5’: 5’-GGCCAGACTTTGTTGGATTTG-3’ Hprt primer al 3’: 5’-GGCCACAGGACTAGAACACC-3’
PU.1 primer al 5’: 5’-TCAGTCACCAGGTTTCCTACAT-3’ PU.1 primer al 3’: 5’-GAACTGGTACAGGCGAATCTTT-3’
C/EBPα primer al 5’: 5’-AAAGCCAAGAAGTCGGTGGAC-3’ C/EBPα primer al 3’: 5’-CCTTGACCAAGGAGCTCTCA-3’
La miscela di reazione per la PCR con Hprt è composta da 5μl di cDNA , 1x (finale) Green Go TaqTM Reaction Buffer (1.5 mM MgCl2), 1 μM (finale) di
ciascun primer Hprt, 0.2mM (finale) di miscela di nucleotidi dNTP
(EuroClone), 1.25unità/50 μl di Go TaqTM
DNA Polymerase.
Le condizioni utilizzate per la PCR, eseguita in un Thermal cycler Delphi, sono
state: 95 °C per 5 minuti 95 °C per 30 secondi 35 cicli 61°C per 60 secondi 72 °C per 40 secondi 72 °C per 5 minuti
I prodotti della PCR, rappresentati da una banda di 217 bp per Hprt, sono stati
separati tramite elettroforesi su gel di agarosio all’1.7%.
La miscela di reazione per la PCR con PU.1 è composta da 5μl di cDNA , 1x (finale) Green Go TaqTM Reaction Buffer (1.5 mM MgCl2), 1 μM (finale) di
ciascun primer PU.1t, 0.2mM (finale) di miscela di nucleotidi dNTP
(EuroClone), 1.25unità/50 μl di Go TaqTM
DNA Polymerase.
Le condizioni utilizzate per la PCR, eseguita in un Thermal cycler Delphi, sono
state: 95 °C per 5 minuti 94 °C per 30 secondi 35cicli 59 °C per 60 secondi 72 °C per 35 secondi 72 °C per 5 minuti
I prodotti della PCR, rappresentati da una banda di 209 bp per PU.1, sono stati
separati tramite elettroforesi su gel di agarosio all’1.7%.
La miscela di reazione per la PCR con C/EBPα è composta da 5μl di cDNA , 1x (finale) Green Go TaqTM Reaction Buffer (1.5 mM MgCl2), 1 μM (finale) di
ciascun primer C/EBPα, 0.2mM (finale) di miscela di nucleotidi dNTP (EuroClone), 1.25unità/50 μl di Go TaqTM
DNA Polymerase.
Le condizioni utilizzate per la PCR, eseguita in un Thermal cycler Delphi, sono
state: 95 °C per 5 minuti 94 °C per 30 secondi 40 cicli 60°C per 60 secondi 72 °C per 35secondi 72 °C per 5 minuti
I prodotti della PCR, rappresentati da una banda di 241 bp per C/EBPα, sono stati separati tramite elettroforesi su gel di agarosio all’1.7%.
Una quantificazione delle bande ottenute su gel per Hprt, PU.1 e CEBPα è stata ricavata attraverso l’analisi con il programma Scion Image Beta 4.02
(Scion Corporation) delle immagini acquisite con un transilluminatore
