2. MATERIALI E METODI
2.1 Reagenti e soluzioni
Buffer di digestione proteinasi K 10X con Bovine Serum Albumin (BSA): 500mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, 1% BSA, pH 7.00 ÷ 8.00
Buffer di digestione proteinasi K 10X senza Bovine Serum Albumin (BSA): 500mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7.00 ÷ 8.00
Soluzione proteinasi K (Sigma): 2 mg PK in 1 ml buffer digestione 1X senza BSA
Anticorpo primario anti proteina prionica: 3F4 (Chemicon)
Kit per immunodetection: WesternBreeze Chemiluminescent Kit con anticorpo secondario anti-mouse
Marcatore di peso molecolare per WB (20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 e 220 kDa): Magic Mark XP (Invitrogen)
Marcatore di peso molecolare pre stained (3, 6, 14, 17, 28, 38, 49, 62, 98 e 188 kDa): SeeBlue Plus 2 (Invitrogen)
Metanolo (Carlo Erba)
E-PAGE Loading Buffer 4X (Invitrogen) Pre-cast gel: E-PAGE 48 8% gel (Invitrogen) iBlot Gel Transfer Stack Regular kit (Invitrogen) Lastre per autoradiografia X-OMAT (Kodak)
Soluzione di sviluppo lastre autoradiografiche GBX Developer/Replenisher (Kodak)
Soluzione di fissaggio per sviluppo lastre autoradiografiche GBX Fixer/Replenisher (Kodak)
DTT (ditiotreitolo) 500mM (soluzione 10X) o Reducing agent (Invitrogen)
2.2 Strumenti per elettroforesi e blotting
Apparato per elettroforesi di proteine: Mother E-Base (Invitrogen)
Apparato per il trasferimento di proteine a secco: iBlot Dry Blotting System (Invitrogen)
2.3 Campioni
Il metodo è stato validato utilizzando come matrice di partenza omogenato di cervello (Brain homogeneate 10% p/v) di criceti infettati con la proteina prionica (ceppo di Scrapie 263K).
Il ceppo di Scrapie 263 K viene propagato facilmente tramite inoculazione in cervello di criceti, permettendo di ottenere elevati titoli di infettività (108-109 ID50 in preparati di omogeneati di cervello al 10% p/v); la PrPSc che deriva da tale ceppo è resistente alla digestione con proteinase K permettendone un ampio utilizzo negli studi di validazione della rimozione dei prioni.
2.4 Principio del metodo
Il metodo di Western Blotting viene comunemente utilizzato al fine di determinare semi-quantitativamente i livelli della PrPSc, proteina considerata come efficiente marker del livello di infettività nelle Encefalopatie Spongiformi Trasmissibili in studi di rimozione dei prioni.
Il principio del metodo risiede nel fatto che, essendo PrPSc resistente al trattamento con proteinasi K, la digestione proteolitica dei campioni contenenti entrambe le isoforme di PrP causa uno shift nella corsa elettroforetica della PrPSc determinando un caratteristico pattern di bandeggio all’altezza di 25-33 kDa, mentre degrada completamente la forma cellulare.
La rilevazione della proteina mutata può essere quindi effettuata, utilizzando un anticorpo primario specifico (3F4) per la proteina prionica ed un anticorpo secondario in grado di riconoscere l’anticorpo primario e coniugato con fosfatasi alcalina in grado di determinare un segnale in chemioluminescenza in seguito all’aggiunta di un substrato specifico.
Per effettuare la titolazione di un campione, questo viene diluito in modo seriale con passo 0.5 unità logaritmiche decimali (Log) prima della corsa elettroforetica. Al termine della rilevazione, il titolo del campione viene attribuito come il reciproco della prima diluizione a cui non è più possibile rilevare visivamente la banda relativa alla proteina; ad esempio: se la banda scompare alla diluizione di 3 Log, si attribuisce il titolo di 3 Log/ml al campione di partenza.
La determinazione di proteina prionica tramite questo tipo di saggio è una determinazione semiquantitativa ed è di tipo relativo in quanto non esistono standard assoluti.
2.5 Fasi operative del metodo
2.5.1 Digestione dei campioni con proteinasi K
Si prepara la miscela di digestione con proteinasi K in una provetta tipo Eppendorf da 1,5 ml aggiungendo a 350 µl di campione 40 µl di buffer di digestione con BSA (10X) e 10 µl di soluzione di proteinasi K (concentrazione finale 50 µg/ml). Il volume finale della miscela è di 400 µl.
Si pone il campione a 37°C per 1 h in bagnetto ad acqua e quindi si centrifuga a 22000 x g a +4°C per 2 h. Al termine della centrifugazione il surnatante viene asportato ed il pellet deve essere risospeso in 30µl di una miscela costituita da 7,5 µl di loading buffer 4x (1x concentrazione finale), 3 µl di DTT o reducing agent (concentrazione finale: DTT 50 mM o reducing agent 1x) e 19,5 µl di PW. Il campione così preparato può essere congelato a -20°C e mantenuto a tale temperatura fino ad un massimo di 7 giorni oppure si può procedere alla successiva analisi.
2.5.2 Denaturazione e diluizioni seriali dei campioni
Il campione deve essere denaturato immergendolo per 10 minuti in acqua portata ad ebollizione e quindi estraendolo e mettendolo in ghiaccio.
Per effettuare le diluizioni seriali di 0.5 Log da caricare sul gel per l’elettroforesi si possono utilizzare piastre multiwell da 96 pozzetti: mettere il campione denaturato nel primo pozzetto, prelevare 20 µl e trasferire nel pozzetto adiacente a destra contenente 43,2 µl di Loading Buffer 1X. Per ogni campione si ha quindi una fila con il primo pozzetto contenente il campione tal quale e nei pozzetti adiacenti le diluizioni successive con passo 0,5 Log.
Nel caso in cui sia conosciuto l’intervallo in cui ricade il titolo di un determinato campione è possibile non caricare tutte le diluizioni effettuate, ma può essere limitato il range di diluizioni da caricare.
2.5.3 Separazione mediante elettroforesi
La fase di separazione delle proteine mediante elettroforesi avviene grazie all’ausilio del dispositivo Mother E-Base (Figura 1) che è uno strumento automatizzato programmabile che consente l’esecuzione di elettroforesi di gel pre-cast del tipo E-PAGE da 96 e 48 pozzetti per la separazione di proteine.
Il dispositivo funziona contemporaneamente da supporto per il gel e da alimentatore. Una volta impostato il programma di corsa e incrementato il tempo di corsa a 30 minuti, si procede a inserire il gel nel dispositivo Mother E-base. Entro 20 minuti dalla rimozione del gel dalla confezione, si caricano 20 µl di ciascuna diluizione nei pozzetti adiacenti del gel, si caricano quindi 10µl di PW + 5µl di marcatore di peso molecolare Magic Mark (in uno dei due pozzetti identificati con la lettera M presenti alle estremità di ciascuna fila o in un altro pozzetto non occupato dai campioni) e 10µl di PW + 5 µl di marcatore di peso molecolare Pre stained (nell’altro pozzetto identificato con la lettera M o in un altro pozzetto non occupato dai campioni in ciascuna fila).
La corsa deve partire entro 10 minuti dal caricamento; passato il tempo di corsa impostato, la cassetta del gel viene rimossa dal Mother E-Base e si recupera il gel per la processazione successiva (Western blotting) da effettuare entro 20 minuti dalla fine della corsa per evitare la diffusione delle bande.
2.5.4 Trasferimento delle proteine su membrana
Il trasferimento viene effettuato tramite l’iBlot Blotting system (Figura 2), impostando un programma di trasferimento che consiste in una corsa per 7 minuti a 20 volt. Questo sistema prevede il trasferimento di proteine a secco: il
gel viene posto fra due lastre di rame che costituiscono il catodo (in alto) e l’anodo (in basso). Le due lastre sono contenute nell’iBlot Gel Transfer Stack kit; l’anodo reca sulla superficie superiore la membrana in PVDF su cui vengono trasferite le proteine. Il sandwich, formato dall’anodo, gel e catodo, viene posto sulla superficie di trasferimento (blotting surface). Una volta effettuato il trasferimento, la membrana in PVDF viene recuperata e quindi si può procedere con la fase di immunodetection.
Questa fase può seguire direttamente il blotting oppure la membrana può essere asciugata all’aria e conservata all’interno di una bustina di plastica a +2/+8°C overnight prima di procedere.
2.5.5 Immunodetection
Se la membrana in PVDF è stata asciugata e conservata a +2/+8°C, essa deve essere lavata con metanolo per 5-10 secondi e successivamente sciacquata con PW. Se la membrana viene direttamente dal trasferimento senza essere stata asciugata, si procede direttamente ai successivi passaggi senza fare i lavaggi in metanolo e acqua.
Si aggiungono 20 ml di Blocking solution, ottenuta dalla miscelazione di 10 ml di PW, 4 ml di Blocker Diluent (Part A) e 6 ml di Blocker Diluent (Part B)) e si incuba per 30 minuti in agitazione a temperatura ambiente. Al termine dell’incubazione la soluzione viene buttata ed si procede ad eseguire 2 lavaggi con 40 ml di PW di 5 minuti ciascuno. Si passa ad incubare la membrana per 1 h a temperatura ambiente con 20 ml di Primary Antibody solution, ottenuta miscelando 14 ml di PW, 4 ml di Blocker Diluent (Part A), 2 ml di Blocker Diluent (Part B) e 2 µl di anticorpo primario 3F4 (diluizione 1:10000).
Alla fine dell’incubazione, si eseguono 3 lavaggi con 40 ml di Antibody Wash (preparato miscelando 300 ml di PW e 20 ml di Antibody Wash solution
16X) della durata di 5 minuti ciascuno. La membrana viene quindi incubata con 20 ml di Secondary Antibody solution per 30 minuti in agitazione a temperatura ambiente. Alla fine dell’incubazione si eseguono 3 lavaggi con 40 ml di Antibody Wash della durata di 5 minuti ciascuno e 2 lavaggi con 40 ml di PW di 2 minuti ciascuno.
A questo punto i successivi passaggi vengono effettuati in camera oscura per la rilevazione delle lastre autoradiografiche. La membrana viene portata su un foglio di pellicola trasparente, evitando di farla asciugare, e vi viene distribuito sopra il Chemiluminescent Substrate per far sviluppare la reazione.
Passati 5 minuti si preleva il liquido in eccesso e si ricopre la membrana con uno strato di pellicola trasparente. Dopo altri 5 minuti, si pone la membrana in una cassetta per autoradiografia a contatto con una lastra autoradiografica, si chiude la cassetta e si mantiene l’esposizione per 10 minuti. La lastra viene poi sviluppata immergendola per 1-2 minuti nella soluzione Developer/Replenisher, lavandola in acqua per 30 secondi in costante agitazione ed infine immergendola per 3-5 minuti nella soluzione Fixer/Replenisher. La lastra viene nuovamente lavata e lasciata asciugare all’aria.
2.5.6 Criteri di accettazione e condizioni di retesting
Per validare i risultati ottenuti devono essere sempre caricati i seguenti controlli in ogni gel:
marcatore di peso molecolare visibile in Western blotting;
controllo positivo costituito da un campione di omogenato di cervello di criceto infetto il cui titolo teorico sia stato precedentemente determinato in base al presente metodo e calcolato come media di sei titolazioni indipendenti. Il titolo del controllo positivo utilizzato in una sessione di analisi non deve differire per più di 0,5 Log dal titolo teorico;
Per validare la seduta analitica devono essere presenti i seguenti controlli almeno in uno dei gel preparati nella stessa seduta:
controllo negativo costituito da omogenato di cervello di criceto non infetto digerito con proteinasi K. Questo campione rappresenta il controllo positivo di digestione. In questo campione non deve essere evidente alcuna banda all’altezza specifica;
controllo costituito da omogenato di cervello di criceto non infetto, non digerito con proteinasi K. In questo controllo deve essere visibile la banda relativa alla proteina prionica (dato dalla presenza della forma cellulare non infettiva).
Nel caso uno dei suddetti controlli non dia il risultato atteso, il saggio deve essere invalidato e la seduta di titolazione ripetuta.
Qualora non sia possibile attribuire il titolo ad un campione perché dalle diluizioni caricate su gel non è possibile vedere la scomparsa del segnale, la titolazione del campione deve essere ripetuta testando diluizioni maggiori.
Qualora un campione risulti negativo il campione deve essere ritestato, possibilmente ad una minore diluizione, e comunque per confermare il dato. Nel caso in cui le diluizioni del campione non risultino scalari, il campione deve essere ritestato. Nell’eventualità in cui il campione sia stato testato in doppio e le due repliche mostrino risultati discordanti (differenza nei titoli > 0,5 Log), il campione deve essere nuovamente ritestato in doppio.
2.6
Validazione del metodo
La convalida di un metodo analitico è il processo attraverso il quale si stabilisce, per mezzo di studi di laboratorio, se un metodo di analisi presenta caratteristiche di efficienza tali da soddisfare i requisiti previsti per le applicazioni specifiche del metodo stesso.
In accordo alle linee guida ICH Q2 (R1) [103], per la validazione di questo metodo sono state valutate le seguenti caratteristiche:
1. Linearità 2. Accuratezza
3. Precisione intermedia 4. Precisione entro la serie 5. Range
6. Robustezza
7. Limite di quantificazione
La specificità, pur essendo secondo le vigenti linee guida un parametro da prendere in considerazione per la valutazione dell’efficienza di un metodo, non è stata qui stimata in quanto in questo caso il metodo è destinato ad essere
applicato all’analisi di campioni la cui matrice può variare considerevolmente e di conseguenza interferire con la determinazione del titolo. Per questo motivo tale parametro deve essere valutato di volta in volta in esperimenti preliminari specifici per i singoli studi di inattivazione/rimozione della proteina prionica.
2.6.1 Verifica della linearità
La verifica della linearità del metodo ci indica se il metodo è idoneo per ottenere dei risultati direttamente proporzionali (mediante ben definita relazione matematica) alla quantità di analita presente nei campioni di analisi, all’interno di un determinato intervallo di concentrazione.
Al fine di accertare se il metodo è lineare, per ogni sessione di analisi, il coefficiente di determinazione r2, calcolato dalla regressione lineare ottenuta attraverso l’interpolazione tra i risultati analitici e le corrispondenti concentrazioni di analita, deve essere maggiore o uguale a 0,95.
La linearità del metodo è determinata analizzando in 9 sessioni indipendenti 5 diverse diluizioni di uno stock di proteina prionica a titolo noto. Le diluizioni scelte sono: tal quale (non diluito), diluizione 1:10 (1 Log), 1:100 (2 Log), 1:1000 (3 Log), 1:10000 (4 Log). Per ogni campione è stato determinato il titolo in base a quanto descritto nel paragrafo 2.4.
L’analisi di regressione lineare è stata poi effettuata per i risultati ottenuti in ogni sessione di analisi. I più importanti parametri statistici quali la pendenza, l’intercetta sull’asse y ed il coefficiente di correlazione r2, sono stati calcolati secondo le formule sotto indicate.
2 ) ( ) )( (
x x y y x x m i i i
x x x y y x x y b i i i 2 ) ( ) )( (
n i n i n i y y x x y y x x r i i i i 1 1 1 2 ) ( 2 ) ( 2 ) ( ) ( 2dove:
xi = valore di concentrazione del titolo teorico i-esimo;
yi = risposta corrispondente alla concentrazione i-esima;
n = numero di diluizioni analizzate per ciascuna sessione; m = pendenza;
b = intercetta.
2.6.2 Verifica dell’accuratezza
L’obiettivo di questo test è quello di valutare l’accuratezza del metodo analitico, cioè quanto esso è capace di ottenere risultati prossimi al valore vero. L’accuratezza si esprime come valore di recupero percentuale tra il risultato ottenuto ed il valore atteso in unità logaritmiche.
Il valore medio di recupero dei campioni analizzati per ogni livello di concentrazione deve essere compreso tra 80% e 120% rispetto al valore teorico.
Tre diversi campioni, ottenuti dalla diluizione dello stock prionico di partenza a titolo teorico noto, sono stati analizzati in triplicato in modo tale da coprire l’intero range della metodica analitica. Il titolo di ogni campione è stato determinato e i dati ottenuti sono stati espressi come recupero percentuale secondo la formula sotto riportata:
100 % Re x Titolo Titolo c vero calcolato
Dal momento che non è disponibile uno standard a titolo noto, per titolo vero si intende il titolo dello stock di partenza ottenuto dalla media di sei titolazioni indipendenti.
La media del recupero % di ogni livello di concentrazione è stata calcolata secondo la formula: n Ri c n i Conc Liv
1 . . % Redove n = numero di repliche per livello di concentrazione = 3.
L’accuratezza del metodo è stata determinata utilizzando i dati ottenuti durante le prove di linearità del metodo.
2.6.3 Verifica della precisione intermedia
La precisione intermedia è definita come il grado di precisione dei risultati analitici ottenuti in condizioni operative diverse all’interno dello stesso laboratorio di analisi.
La precisione intermedia è stata determinata analizzando in 3 sedute indipendenti, eseguite da tre diversi operatori in 3 giorni diversi, 3 campioni con titoli diversi per ogni seduta, che coprivano l’intero range di interesse. Per tali ragioni è stato possibile utilizzare i dati ottenuti durante le prove di linearità. I campioni sono stati preparati effettuando opportune diluizioni dallo stock prionico originale. Per ogni titolo si è proceduto a calcolare la media dei 3 valori e la deviazione standard secondo la seguente formula:
n x x n i i
1
1 1 2
n x x s n i i dove:x = media delle letture dei campioni allo stesso titolo;
n = numero dei campioni = 3
Per ogni titolo la deviazione standard calcolata in unità logaritmiche deve essere ≤ 0,5 Log.
2.6.4 Verifica della precisione entro la serie
L’obiettivo di questo test è quello di valutare la riproducibilità del metodo analitico intra-saggio, ovvero quando la procedura analitica è applicata ripetutamente su uno stesso campione omogeneo all’interno di una stessa seduta di analisi.
Si è proceduto ad analizzare in triplicato, nella stessa seduta analitica e da parte dello stesso operatore, 3 diversi titoli in modo tale da coprire l’intero range della metodica analitica. Si è poi calcolato per ciascun titolo teorico la media dei tre valori determinati e la deviazione standard secondo le formule riportate nel paragrafo 2.6.3. Per ogni titolo la deviazione standard dei risultati analitici ottenuti deve essere ≤ 0,5 Log.
Per verificare la precisione entro la serie è stato possibile utilizzare i dati raccolti durante la prova di precisione intermedia.
2.6.5 Verifica del range del metodo
Il range del metodo è definito come l’intervallo di concentrazione di analita all’interno del quale il metodo risulta accurato, preciso, lineare.
L’ obiettivo del test è quello di identificare il range di applicazione del metodo, ovvero l’intervallo dei livelli di analita all’interno del quale il metodo risulta accurato, preciso, lineare. Per tale ragione per stabilire tale valore ci si è avvalsi dei risultati ottenuti nella valutazione delle suddette caratteristiche.
2.6.6 Verifica della robustezza del metodo
La robustezza del metodo è definita come la capacità del metodo analitico di non essere influenzato da piccole variazioni di parametri operativi critici. Per il metodo oggetto di validazione, sono stati considerati critici i parametri indicati in tabella 1.
Nella tabella sono inoltre indicati i valori standard dei singoli parametri ed i valori massimi e minimi che definiscono il range di robustezza valutato per ogni parametro. Come condizioni di massimo, si intendono le condizioni che teoricamente potrebbero dare come risultato un titolo maggiore di quello ottenuto nelle condizioni standard, mentre come condizioni di minimo, si intendono le condizioni che teoricamente potrebbero dare come risultato un titolo minore di quello ottenuto nelle condizioni standard.
Condizioni di minimo Condizioni standard Condizioni di massimo
Parametro Valore minimo Valore standard Valore massimo
Tempo di digestione con proteinase K
45 min 1 h 1h e 15 min
Tempo di centrifugazione 1h e 45 min 2 h 2 h e 15 min Quantità di anticorpo primario 1,5 l/20 ml 2,0 l/20 ml 2,5 l/20 ml Tempo di incubazione con
anticorpo primario
50 min 1 h 1 h e 10 min
Tempo di incubazione con anticorpo secondario
20 min 30 min 40 min
Tempo di incubazione con substrato
4 min 5 min 6 min
Tempo di attesa fra rimozione substrato ed esposizione
3 min 5 min 7 min
Tempo di esposizione 8 min 10 min 12 min
Tabella 1
Il metodo viene definito robusto se, in tutti i campioni analizzati, il titolo ottenuto eseguendo il metodo con i parametri modificati (nelle due condizioni: valori minimi dei parametri e valori massimi dei parametri) non differisce più di 0,5 Log dal titolo teorico.
È stata effettuata una diluizione di 3 Log dello stock prionico di partenza, determinato il titolo in triplicato eseguendo il metodo alle condizioni indicate come condizioni di massimo, determinato il titolo in triplicato eseguendo il metodo alle condizioni indicate come condizioni di minimo e per ogni replicato è stata calcolata la differenza fra il titolo ottenuto ed il titolo teorico.
2.6.7 Limite di quantificazione
L’ obiettivo del test è quello di individuare la più bassa quantità di analita che può essere quantificata in maniera accurata e precisa. Il limite di quantificazione deve quindi corrispondere al limite inferiore del range della metodica. Per il valore di concentrazione corrispondente al limite di quantificazione si è proceduto a verificare che siano soddisfatti i criteri di accuratezza e precisione riportati nelle relative sezioni.
Utilizzando i titoli per il campione a concentrazione minima ottenuti durante le prove di linearità, precisione ed accuratezza, sono stati calcolati la deviazione standard ed il Recupero % utilizzando le seguenti formule:
n x x n i i
1
1 1 2
n x x s n i i 100 % Re x Titolo Titolo c atteso calcolato dove:x = media delle letture dei campioni allo stesso titolo;
