Indice
3. RISULTATI... 74
1. Isolamento del trascritto Ft312B-WRKY nel clone I-214... 76
2. Analisi di espressione di Ft312B-WRKY nei cloni I-214 e Eridano ... 78
3. Isolamento del trascritto Ft32C-WAK nel clone I-214 e Eridano ... 79
4. Analisi di espressione di Ft312B-WRKY nei cloni I-214 e Eridano ... 86
5. Isolamento della sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214 ... 88
3. RISULTATI
A B
Al fine di analizzare i meccanismi molecolari coinvolti nella risposta allo stress da ozono nelle piante arboree, questo lavoro si è avvalso di due specie appartenenti al genere Populus (genere modello per eccellenza) caratterizzate da una differente sensibilità a
questo inquinante ambientale. In particolare abbiamo utilizzato due cloni di pioppo ibridi, Populus deltoides x maximowiczii, clone Eridano, e P. x euramericana, clone I-214, rispettivamente sensibile e tollerante all’ozono.
Talee di entrambi i cloni sono state sottoposte ad una esposizione acuta (150 ppb per 5 ore) in ambiente controllato per ridurre al massimo l’influenza di fattori esterni. Le talee usate come controllo sono state mantenute nelle stesse condizioni (vedi Materiali e Metodi par.
1).
Dopo il trattamento sono stati riscontrati effetti macroscopici esclusivamente a carico del materiale sensibile (Figura 3.1). Sulle foglie del clone Eridano, dopo poche ore dalla fine del trattamento, si sono manifestati i primi segni visibili, rappresentati da appassimento seguito dalla comparsa di bronzature sulla superficie adassiale. Dopo 24 ore si sono sviluppate le prime necrosi in forma di punteggiature scure (brune-rossastre) localizzate soprattutto nelle aree internervali della pagina superiore. Nelle forme più lievi il danno è rimasto localizzato soprattutto nelle porzioni marginali, mentre in casi più severi le lesioni si sono estese fino ad arrivare in prossimità della nervatura centrale. Una correlazione di proporzionalità tra età della foglia e percentuale di area necrotizzata ha evidenziato una maggiore sensibilità delle foglie più giovani al trattamento.
Figura 3.1: Foglia del clone Eridano in seguito al trattamento acuto con l’O
3.
A. Superficie abassiale e adassiale (i sintomi visibili si riscontrano solo nella
superficie adassiale). B. Dettaglio della regione necrotica.
1050 bp 1018 bp
1. Isolamento del trascritto Ft312B-WRKY nel clone I-214
L’intero trascritto di Ft312B-WRKY è stato amplificato mediante RT-PCR utilizzando una coppia di primer (vedi Tabella 2.1, Materiali e Metodi) disegnati sulla sequenza del gene di Populus trichocarpa (fgenesh1_pm.C_LG_VI000803) più simile (99%) alla porzione del trascritto precedentemente a nostra disposizione (Rizzo et al., 2007). L’amplificato ottenuto presenta una lunghezza di 1050 bp (Figura 3.2).
Il trascritto è stato clonato in vettore plasmidico (vettore TOPO T/A, Invitrogen) e sequenziato mediante sequenziatore automatico. La sequenza aminoacidica dedotta (Figura 3.3A) presenta il dominio WRKY, definito dalla sequenza aminoacidica WRKYGQK e dal motivo zinc finger-like (C–X
4–5–C–X
22-23–H–X
1–H, x = qualsiasi amino acido) (Eugelm et al., 2000). Nella figura 3.3B e C sono riportati i risultati ottenuti mediante l’analisi della sequenza aminoacidica di Ft312B-WRKY effettuata con i software PROSITE (B) e SMART (C) (vedi Materiali e Metodi par 16) presenti in rete: in
Figura 3.2. Trascritto Ft312B-WRKY. Tt, mRNA isolato dal clone I-214 dopo il trattamento; MX, marker X di peso molecolare (Roche).
MX Tt
A
B
C
Figura 3.3. (A) Sequenza aminoacidica dedotta di Ft312B-WRKY; sono evidenziati la sequenza WRKYGQ (rosso), il motivo zinc finger-like (grigio) e il motivo leucine zipper (giallo). (B)(C) Rappresentazioni schematiche del dominio WRKY ottenuto mediante i software PROSITE (B) e SMART (C).
entrambi i casi il dominio WRKY è stato identificato nella stessa regione della proteina, come indicato da Eugelm et al. (2000) in Arabidopsis thaliana.
Dal confronto della sequenza aminoacidica di Ft312B-WRKY con quelle di Arabidopsis thaliana (Eugelm et al., 2000), è emersa una maggiore similarità con i membri del gruppo
IIa. Queste WRKY presentano un motivo leucine zipper (evidenziato in giallo in figura 3.3A) nella porzione ammino-terminale (N-terminale) della proteina.
M D S S W V N T S L D L N I N P F
K H V N E T Q A Q E S K E F E G Y
S T R V E Q K V Q V K K E A G V S
A L V E E L N R V N S E N Q K L T
E V L G V V C E K Y L T L Q K H L
A D L T S K N S E K E L M T T P V
I S M K R K A E S E D Y S N V I N
A I N G G N T E S S S S D E D S S
K R P Q E N L K T K I S R A Y F P
T N A S D T S L V V R D G Y Q W R
K Y G Q K V T R D N P S P R A Y F
K C S F A P S C P V K K K V Q K S
A E N P S I L V A T Y E G E H N H
A S H S Q P E L S L G S S Q N S S
F G P V P S P S S I R T S V P T V
T L D L I Q S G M H V D S V R K T
V Q E N L Q V P E V Q K V L V Q Q
M A S S L T R D P N F T A A L A A
A I S G R F N Q T R I E K L
A B
0,00 0,50 1,00 1,50
C 1 2 4 5
Intervalli di tempo in ore
Ft312B-WRKY / ß-actina 0
0,5 1 1,5 2
C 1 4 12 24 48
Intervalli di tempo in ore
Ft312B-WRKY / ß-actina
2. Analisi di espressione di Ft312B-WRKY nei cloni I-214 e Eridano
Utilizzando la stessa coppia di primer usati in precedenza (Rizzo et al., 2007) abbiamo analizzato, mediante RT-PCR Relativa, il pattern di espressione del gene a precisi intervalli di tempo sia durante le 5 ore di trattamento che nelle successive 48 ore dopo l’esposizione (Figura 3.4). Come gene costitutivo di riferimento abbiamo utilizzato la ß-actina (vedi Materiali e Metodi, par 5).
ß-actina
(447bp)
Ft312B-WRKY
(220bp)
C 1 2 4 5 MIX C 1 2 4 5 C 1 4 12 24 48 C 1 4 12 24 48 MIX
Eridano I-214 Eridano I-214
Figura 3.4. RT-PCR Relativa (in alto) di Ft312B-WRKY durante il trattamento (A) e dopo il trattamento (B). In basso, andamento dell’espressione di Ft312B-WRKY nel clone Eridano (blu) e nel clone I-214 (rosso) durante il trattamento (A) e dopo (B). C, controllo; 1,2, ecc., intervalli di tempo in ore durante (A) e dopo (B) il trattamento;
MIX, marker IX (Roche).
Dai risultati ottenuti emerge che nel clone Eridano (Figura 3.4A) il trascritto aumenta sensibilmente solo dopo cinque ore di esposizione, e la sua attivazione permane fino a 24 ore dopo l’esposizione (Figura 3.4B) per poi decrescere fino a sparire dopo 48 ore.
Diverso è l’andamento dell’espressione nel clone I-214, in cui l’attivazione si verifica già dopo due ore di trattamento(Figura 3.4A), alla quarta ora subisce una lieve diminuzione e poi riprende fino ad una ora dopo il trattamento (Figura 3.4B), per poi diminuire fino a 24 ore dall’esposizione e subire una nuova attivazione dopo 48.
3. Isolamento del trascritto Ft32C-WAK nel clone I-214 e Eridano
Per l’isolamento Ft32C-WAK si è proceduto in maniera analoga a quanto fatto per Ft312B-WRKY. Il trascritto è stato amplificato utilizzando una coppia di primer (Tabella 2.1, Materiali e Metodi) costruiti sulla sequenza del gene di Populus trichocarpa
(eugene3.00061998) più simile (95%) alla porzione del trascritto a nostra disposizione.
Mediante RT-PCR è stato ottenuto un amplificato di 2253 bp (Figura 3.5).
MX Tt
2253 bp
1018 bp
Figura 3.5. Trascritto Ft32C-WAK. Tt, mRNA isolato dal
clone I-214 dopo il trattamento; MX, marker X di peso
molecolare (Roche ).
L’amplificato è stato clonato in vettore plasmidico e durante lo screening delle colonie
sono emerse due forme del trascritto Ft32C-WAK, chiamate H e L: entrambe sono state
identificate e sequenziale tramite sequenziatore automatico. In figura 3.6A è riportata la
sequenza aminoacidica dedotta di Ft32C-WAK H del clone I-214 con indicati tutti i
domini funzionali caratterizzanti le proteine WAK, identificati sia mediante l’utilizzo di
PROSITE e SMART, sia grazie lavoro svolto su Arabidopsis thaliana da Walker (1994),
He et al. (1999) e Verica e He (2002).
A
B
C
Figura 3.6. (A) Sequenza aminoacidica dedotta di Ft32C-WAK; sono evidenziati i domini EGF (fucsia), EGF-Ca
2+(celeste), il dominio transmembrana (rosso) e gli 11 sottodomini (giallo) del dominio serina-treonina chinasico (grassetto). (B)(C) Rappresentazioni schematiche dei domini di Ft32C-WAK ottenuti mediante i software PROSITE (B) e SMART (C).
M A L Q F T I T G V L L L A A V T A A T E F P I A K P G C Q D K C G N V S I P Y P F G T R K D C Y Y G P E F L I T C N H S F N P P K A F L T A S T I N V T E I T L Q G K L H I E Q Y I A K D C Y N A S G Q T L N N I P S L T L A D F I I S D A D N M F V S I G C D T V A S L T G N L K A G S T D N E Y E V G C T S L C N S L K Y V P N D T C S G I G C C Q T S L A K G V E Y F D I A V S S K K N H K D I L D F S P C S Y A F I I E K K M F N F S R S Y L Q D L K D V D E L P M V V D W S I G K N S C A K V K K S T K N A C Q G N S T C Y D P D S G Y G Y L C R C L D G Y R G N P Y L P N G C L
D I D E C T D A T V N N N C T H I C T N L Q G N Y T C S C P K G Y H G D G R K N G E G C I R Q R S L V I Q
V A VG I G A G L T S L L M G I T W L Y W G Y S K W K L M K L
K E K F F R Q N G G L M L E Q Q L S R R E G S V T E T A K I F
T A E E L E K A T D K Y H E S R I L G R G G F G T V Y R G T L
T D G R T V A I K K S K T I D Q S Q I E Q F I N E V V V L Y Q
I N H R N V V K L L G C C L E T E V P L L V Y E Y V A N G T L
Y D H I H D K S K V S A L T W E I R L K I A S E T A G V L S Y
L H S A A S V P I I H R D V K S T N I L L D N S Y T A K V S D
F G T S R L I P L D Q D E L S T M V Q G T L G Y L D P E Y L H
T S Q L T D K S D V Y S F G V V L V E L L T G M K A I S F H K
P E G E R N L S S Y F L C A L K E D R L V H I L Q D S M V N Q
D N I R Q L K G V A N I A K K C L R V K G E E R P N M K H V A
M E L E G L R T S A K H P W T N D K S D V E E T E Y L L G E S
A E T V R S E E M A G T S A G Y H S L H L I Q S Q G D G R
La proteina dedotta del trascritto Ft32C-WAK H del clone I-214 presenta porzione extracellulare N-terminale (che occupa due dei tre esoni presenti nel gene) e una porzione citoplasmatica carbossi- terminale (C-terminale), separate da un dominio transmembrana (indicato in rosso in figura 3.6A). Nella porzione C-terminale risiede l’attività serina/treonina chinasica (il dominio chinasico è indicato in grassetto).
Il dominio chinasico consta di 11 domini (evidenziati in giallo), tra i quali i domini VIb e VIII (evidenziati in verde) sono fondamentale per la differenziazione del dominio serina- treonina chinasico da quello tirosina-chinasico (Walker 1994). All’interno del sottodominio I (evidenziato in giallo e sottolineato) PROSITE individua una regione ricca in glicine (G) che si trovano in vicinanza di un residuo di lisina (K, evidenziato in nero) che sono coinvolti nel legame con l’ATP; inoltre individua anche all’interno del domino VIb (evidenziato in verde e sottolineato) un residuo di acido aspartico (D, evidenziato in grigio) che è importante per l’attività catalitica della proteina. Queste due regioni (indicate anche nella figura 3.6B) sono identificative di questo tipo di dominio kinasico.
La porzione extracellulare è caratterizzata da due ripetizioni EGF-like (Epidermal Growth Factor- like): le ripetizioni tipo EGF, caratterizzate da residui di cisteina (C, evidenziati in grigio nelle figura 3.6A) responsabili della formazione di ponti disolfuro (indicati nella figura 3.6B), sono coinvolti nell’interazione proteina-proteina e spesso giocano un ruolo
regolatorio in numerose attività recettoriali di superficie cellulare (Khorn, 2001). Nella regione extracellulare sono presenti due tipi di ripetizioni EGF-like, che si distinguono per la capacità (EGF) o meno (EGF- Ca
2+) di legare il Ca
2+(Figura 3.7).
DOMINIO EGF
X
(4)-C-X
(0-48)-C-X
(1-70)-C-X
(1-6)-C-X
(2)-G-A-X
(0-21)-G-A-X
(0-21)-G-X
(0-2)-C-X
DOMINIO EGF-Ca
2+NXNNC-X
(3-14)-C-X
(3-7)-CXXBXXXXAXC-X
(1-6)-C-X
(8-13)-CX
Figura 3.7. Domini EGF e EGF-Ca
2+. C, cisteina; G, glicina; A, residuo aminoacidico
aromatico; N, residuo aminoacidico polare o carico negativamente; X, qualsiasi residuo
aminoacidico.
La distribuzione dei due domini EGF è caratteristica e distintiva delle RLK appartenenti alla famiglia delle WAK (vedi Introduzione , par. 4.5).
La sequenza aminoacidica dedotta del trascritto Ft32C-WAK L presenta alcune differenze rispetto alla forma H pur mantenendo l’architettura distintiva dei membri della famiglia WAK (Figura 3.8).
WAKL I-214 MALQFTIIGVLLLAAVAA---FPIAKPGCQDRCGNVIIPYPFGTRKDCYYDPQFPITCNH WAKH I-214 MALQFTITGVLLLAAVTAATEFPIAKPGCQDKCGNVSIPYPFGTRKDCYYGPEFLITCNH ******* ********:* **********:**** *************.*:* *****
WAKL I-214 TLNPPKAFLGNGNLSVTEITLDGKLRLMQYIAKDCYNRAGARTTTNRPWINLPVQGPYVF WAKH I-214 SFNPPKAFLTASTINVTEITLQGKLHIEQYIAKDCYNASGQTLNN----IPSLTLADFII ::******* ..:.******:***:: ********* :* .. * . . :::
WAKL I-214 SDTDNVFVAIGCDTLAEMLG--RREDKNDTYLVGCISKCSNKKYVP-NTCSGIGCCQTSL WAKH I-214 SDADNMFVSIGCDTVASLTGNLKAGSTDNEYEVGCTSLCNSLKYVPNDTCSGIGCCQTSL **:**:**:*****:*.: * : ..:: * *** * *.. **** :************
WAKL I-214 AKGIKYFDVSLFSYNNHTGIWEFNPCSFAFMIEEKQFSFFPSNLSDLEQVSKVPIIVDWS WAKH I-214 AKGVEYFDIAVSSKKNHKDILDFSPCSYAFIIEKKMFNFSRSYLQDLKDVDELPMVVDWS ***::***::: * :**..* :*.***:**:**:* *.* * *.**::*.::*::****
WAKL I-214 IGRNNCETLEKNKMSNACQGQSKCHDPENGSGYICKCLDGYQGNPYLPNGCQNINECSDP WAKH I-214 IGKNSCAKVKKSTKN-ACQGNSTCYDPDSGYGYLCRCLDGYRGNPYLPNGCLDIDECTDA **:*.* .::*.. . ****:*.*:**:.* **:*:*****:********* :*:**:*.
WAKL I-214 KVAHNCSHKCIDTEGNYTCSCPKGYHGDGRVDGERCTRNRSSVIQVAVGTGVGLISLLMG WAKH I-214 TVNNNCTHICTNLQGNYTCSCPKGYHGDGRKNGEGCIRQRSLVIQVAVGIGAGLTSLLMG .* :**:* * : :**************** :** * *:** ******* *.** *****
WAKL I-214 ITWLYWGYNKWKLMKLKEKFFRQNGGLMLEQQLSRREGPVIETAKIFSAEELEKATDKYH WAKH I-214 ITWLYWGYSKWKLMKLKEKFFRQNGGLMLEQQLSRREGSVTETAKIFTAEELEKATDKYH ********.*****************************.* ******:************
WAKL I-214 ESRILGRGGFGTVYKGTLTDGRTVAIKKSKTIDHNQIEQFINEVVVLYQINHRNVVKLLG WAKH I-214 ESRILGRGGFGTVYRGTLTDGRTVAIKKSKTIDQSQIEQFINEVVVLYQINHRNVVKLLG **************:******************:.*************************
WAKL I-214 CCLETEVPLLVYEYVANGTLYDHIHDKSKVSALTWEIRLKIASETAGVLSYLHSAASVPI WAKH I-214 CCLETEVPLLVYEYVANGTLYDHIHDKSKVSALTWEIRLKIASETAGVLSYLHSAASVPI ************************************************************
WAKL I-214 IHRDVKSTNILLDNSYTAKVSDFGTSRLIPLDQDELSTMVQGTLGYLDPEYLHTSQLTDK WAKH I-214 IHRDVKSTNILLDNSYTAKVSDFGTSRLIPLDQDELSTMVQGTLGYLDPEYLHTSQLTDK ************************************************************
WAKL I-214 SDVYSFGVVLVELLTGMKAISFDKPEGERNLSSFFLCALKEDRLVHILQDSMVNQDNIRQ WAKH I-214 SDVYSFGVVLVELLTGMKAISFHKPEGERNLSSYFLCALKEDRLVHILQDSMVNQDNIRQ **********************.**********:**************************
WAKL I-214 LKEVANIAKKCLRVKGEERPNMKNVAMELEGLRTSAKHPWTNDKSDVKETEYLLGESVET WAKH I-214 LKGVANIAKKCLRVKGEERPNMKHVAMELEGLRTSAKHPWTNDKSDVEETEYLLGESAET ** ********************:***********************:*********.**
WAKL I-214 VRSEEMAGTSAGYHSLYLMQSQGDGR WAKH I-214 VRSEEMAGTSAGYHSLHLIQSQGDGR ****************:*:*******
Figura 3.8. Multiallineamento delle sequenze aminoacidiche di Ft32C-WAK H e L
del clone I-214. In figura sono evidenziati i principali domini funzionali (vedi figura
3.6A)
Al fine di verificare la presenza delle due forme anche nel clone Eridano il trascritto Ft32C-WAK è stato amplificato usando la stessa coppia di primer utilizzati per il sensibile (Figura 3.9).
Anche nel caso del clone Eridano, lo screening effettuato dopo il clonaggio ha evidenziato la presenza delle due forme H e L, piuttosto simili alle rispettive due forme del clone I-214, come si può vedere nella figura 3.10 dove è riportato il multiallineamento effettuato mediante ClustalW (vedi Materiali e Metodi par 16) delle sequenze aminoacidiche di Ft32C-WAK H del clone Eridano e I-214.
St MX Tt
2253 bp 1018 bp
Figura 3.9. Trascritto Ft32C-WAK. St e Tt, mRNA isolato rispettivamente dal clone Eridano e I-214 dopo il trattamento;
MX, marker X di peso molecolare (Roche).
WAKH I-214 MALQFTITGVLLLAAVTAATEFPIAKPGCQDKCGNVSIPYPFGTRKDCYYGPEFLITCNH WAKH Eridano MALQFTITGVLLLAAVTAATEFPIAKPGCQDRCGNVRIPYPFGTRKDCYYGPEFLITCNH *******************************:**** ***********************
WAKH I-214 SFNPPKAFLTASTINVTEITLQGKLHIEQYIAKDCYNASGQTLNNIPSLTLADFIISDAD WAKH Eridano SFNPPKAFLNTSTINVTEITLEGKLHIEKFIAKECYNASGQTLRNIPFLTLANFTISDAD *********.:**********:******::***:*********.*** ****:* *****
WAKH I-214 NMFVSIGCDTVASLTGNLKAG-STDNEYEVGCTSLCNSLKYVPNDTCSGIGCCQTSLAKG WAKH Eridano NMFVSIGCDTVASLTGNLKAAGSTDNEYEVGCTSLCNSLKYVPNDTCSGIGCCQTSLAKG ********************. **************************************
WAKH I-214 VEYFDIAVSSKKNHKDILDFSPCSYAFIIEKKMFNFSRSYLQDLKDVDELPMVVDWSIGK WAKH Eridano VNHFDIAVSSKKNHEDILDFSPCSYAFIIEKKMFNFSRSYLQDLKDVDELPMVVDWSIGK *::***********:*********************************************
WAKH I-214 NSCAKVKKSTKNACQGNSTCYDPDSGYGYLCRCLDGYRGNPYLPNGCLDIDECTDATVNN WAKH Eridano NSCAKVKS-TKNACQGNSTCYDPDSGYGYLCRCLDGYRGNPYLPNGCLDIDECTDATVNN *******. ***************************************************
WAKH I-214 NCTHICTNLQGNYTCSCPKGYHGDGRKNGEGCIRQRSLVIQVAVGIGAGLTSLLMGITWL WAKH Eridano TCKHICTNLQGNYTCSCPKGYHGDGRTNGEGCIRHRSLVIQVAVGIVVVLTSLLMGITWL .*.***********************.*******:*********** . ***********
WAKH I-214 YWGYSKWKLMKLKEKFFRQNGGLMLEQQLSRREGSVTETAKIFTAEELEKATDKYHESRI WAKH Eridano YWGYNKWKLMKLKEKFFRQNGGLMLEQQLSRREGSVTETAKIFTAEELEKATDKYHESRI ****.*******************************************************
WAKH I-214 LGRGGFGTVYRGTLTDGRTVAIKKSKTIDQSQIEQFINEVVVLYQINHRNVVKLLGCCLE WAKH Eridano LGRGGFGTVYRGTLTDGRTVAIKKSKTIDQSQTEQFINEVVVLYQINHRNVVKLLGCCLE ******************************** ***************************
WAKH I-214 TEVPLLVYEYVANGTLYDHIHDKSKVSALTWEIRLKIASETAGVLSYLHSAASVPIIHRD WAKH Eridano TEVPLLVYEYVANGTLYDHIHDKSKVSALTWEIRLKIASETAGVLSYLHSAASVPIIHRD ************************************************************
WAKH I-214 VKSTNILLDNSYTAKVSDFGTSRLIPLDQDELSTMVQGTLGYLDPEYLHTSQLTDKSDVY WAKH Eridano VKSTNILLDNSYTVKVSDFGTSRLIPLDQVELSTMVQGTLGYLDPEYLHTSQLTDKSDVY *************.*************** ******************************
WAKH I-214 SFGVVLVELLTGMKAISFHKPEGERNLSSYFLCALKEDRLVHILQDSMVNQDNIRQLKGV WAKH Eridano SFGVVLVELLTGMKAISFDKPEGERNLSSYFLCALKEDRLVHILQDCMVNQDNNRQLKEV ******************.***************************.****** **** *
WAKH I-214 ANIAKKCLRVKGEERPNMKHVAMELEGLRTSAKHPWTNDKSDVEETEYLLGESAETVRSE WAKH Eridano ANIAKKCLRVKGEERPNMKKVAMELEGLRTSAKHPWTNDESNVEETEYLLGKSVETARFE *******************:*******************:*:*********:*.**.* *
WAKH I-214 EMAGTSAGYHSLHLIQSQGDGR-- WAKH Eridano EMAGTSAGYHSLQNYLMQSLDGGR ************: *. .
Figura 3.10. Multiallineamento delle sequenze aminoacidiche di Ft32C-WAK H
del clone I-214 e Eridano.
4. Analisi di espressione di Ft312B-WRKY nei cloni I-214 e Eridano
Al fine di valutare il pattern di espressione delle due forme di Ft32C-WAK sia nel clone Eridano che nel clone I-214, sono stati disegnati due coppie di primer (Tabella 2.1, Materiali e Metodi) per ciascun clone, che amplificano una frammento di 297bp
localizzato nella porzione extracellulare. Inizialmente abbiamo analizzato, mediante RT- PCR Relativa, l’espressione di Ft32C-WAK H e L agli stessi intervalli di tempo analizzati per Ft312B-WRKY durante le 5 ore di trattamento. Il risultato è che, al contrario della forma H, la forma L non viene attivata dal trattamento (Figura 3.11).
Il pattern espressivo della Ft32C-WAK forma H è stato analizzato più approfonditamente, sia durante il trattamento che dopo (Figura 3.12).
C 1 2 4 5 MIX C 1 2 4 5
Eridano I-214
ß-actina (447bp) Ft32C-WAK L
(297bp)
Figura 3.11. RT-PCR Relativa di Ft32C-WAK L durante il trattamento nel clone Eridano e nel clone I-214. C, controllo; 1,2, ecc., intervalli di tempo in ore;
MIX, marker IX (Roche).
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
C 1 4 12 24 48
Intervalli di tempo in ore
Ft32C-WAK / ß-actina
A B
0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50
C 1 2 4 5
Intervalli di tempo in ore
Ft32C-WAK / ß-actina
Il trascritto presenta, nel clone I-214, un notevole aumento dopo 2 ore di esposizione, ed una graduale diminuzione a partire da 1 ora dopo il trattamento fino a 24 ore, per poi subire un successivo aumento alle 48 ore. Al contrario, nel clone Eridano, si verifica un debole (poco significativo) aumento solo dopo 5 ore di trattamento che si mantiene a livelli bassi anche nella fase successiva all’esposizione.
C 1 2 4 5 MIX C 1 2 4 5
C 1 4 12 24 48 C 1 4 12 24 48 MIX
Eridano I-214 Eridano I-214
ß-actina
(447bp)
Ft32C-WAK H
(297bp)
Figura 3.12. RT-PCR Relativa (in alto) di Ft32C-WAK H durante il trattamento (A) e dopo il trattamento (B). In basso, andamento dell’espressione di Ft32C-WAK H nel clone Eridano (blu) e nel clone I-214 (rosso) durante il trattamento (A) e dopo (B). C, controllo; 1,2, ecc., intervalli di tempo in ore durante (A) e dopo (B) il trattamento;
MIX, marker IX (Roche).
5. Isolamento della sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H nel clone I-214
Con l’intento di isolare la sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H, è stato necessario isolare l’intero gene utilizzando gli stessi primer utilizzati per amplificare il corrispondente trascritto (Figura 3.13).
La sequenza genica di Ft32C-WAK sia del clone Eridano che del clone I-214 è stata clonata e mediante lo screening delle colonie è stato possibile isolare i geni corrispondenti alle forme H e L.
La sequenza promotrice del gene Ft32C-WAK H del clone I-214 è stata isolata utilizzando il Genome Walker Universal kit (BD Bioscences Clontech) (vedi Materiali e Metodi par.
15). Al fine di conoscere preventivamente la dimensione del frammento da amplificare
(contenente la sequenza promotrice) e di scegliere l’opportuno enzima di restrizione da utilizzare durante la procedura di isolamento del promotore, è stato effettuato un Southern blot utilizzando 5 enzimi di restrizione (i siti di restrizione sono indicati in figura 3.14).
MX Tt St
3290 bp
1018 bp
Figura 3.13. Sequenza genica di Ft32C-WAK. St e Tt, DNA
isolato rispettivamente dal clone Eridano e I-214; MX, marker X
di peso molecolare (Roche).
Le dimensioni dei frammenti ottenuti con il Southern blot, effettuato utilizzando DNA gnomico estratto dal clone I-214 digerito con gli enzimi mostrati in figura 3.15 e ibridato con una sonda specifica per Ft32C-WAK H (vedi Materiali e Metodi par. 10), ci ha suggerito l’utilizzo dell’enzima EcoRV (il sito di restrizione è sottolineato nella figura 3.14).
ATGGCCTTACAGTTCACAATAACAGGAGTGCTGTTGTTAGCAGCAGTTACAGCAGCAACAGAGTTTCCTATAGCGAAGCCTGGA TGCCAAGATAAATGTGGGAATGTTAGTATCCCATATCCATTTGGCACCAGAAAAGATTGCTACTACGGCCCCGAGTTCCTCATA ACTTGCAACCATTCTTTCAACCCTCCAAAAGCATTTCTCACGGCAAGTACTATAAACGTAACGGAAATAACACTCCAAGGAAAG CTGCATATCGAGCAATACATAGCCAAGGATTGCTATAATGCATCAGGACAAACTCTCAACAACATACCCTCACTTACGCTCGCC GATTTCATTATCTCTGATGCTGACAATATGTTCGTGTCCATTGGTTGCGATACTGTGGCATCCCTCACTGGCAATTTGAAAGCT GGTAGTACTGATAACGAATACGAGGTAGGATGCACGTCCTTATGTAACAGCTTAAAATATGTACCTAATGATACATGCTCTGGC ATAGGTTGCTGTCAAACATCCCTTGCCAAGGGAGTAGAATACTTTGACATAGCAGTTTCTAGCAAGAAAAATCATAAAGACATC TTGGACTTCAGCCCCTGCAGCTATGCCTTCATTATTGAAAAAAAGATGTTCAATTTTTCTAGAAGTTATCTTCAGGATCTGAAG GACGTTGACGAGCTTCCTATGGTAGTTGACTGGAGTATAGGGAAAAATAGCTGCGCCAAAGTAAAAAAGAGTACCAAGAATGCA TGTCAAGGAAACAGCACTTGTTATGATCCTGACAGTGGATATGGGTACCTCTGCAGGTGCTTGGACGGGTACCGTGGAAACCCA TACCTCCCTAATGGTTGCCTAG
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GAATTGGAGCGGGGCTGACATCTTTGTTGATGGGAATTACTTGGCTGTACTGGGGATACAGTAAATGGAAGCTAATGAAGCTCA AAGAGAAGTTCTTTAGGCAAAATGGTGGTCTAATGTTGGAGCAGCAGCTATCAAGAAGGGAAGGATCCGTTACAGAAACGGCAA AAATCTTTACAGCTGAAGAACTCGAGAAAGCCACCGACAAGTACCATGAAAGTAGAATTCTTGGCCGTGGAGGTTTTGGTACCG TTTACAGGGGAACTTTAACAGATGGAAGAACTGTTGCAATCAAGAAGTCCAAAACAATCGATCAAAGCCAAATCGAGCAGTTTA TCAATGAGGTGGTAGTTCTTTACCAAATCAATCACAGGAGTGTGGTGAAGCTTCTAGGAAGTTGCTTGGAGACAGAAGTCCCAT TACTAGTTTATGAATATGTTGCAAATGGCACCCTCTATGACCACATTCACGACAAGAGTAAGGTGTCGGCCCTCACCTGGGAAA TCCGTTTAAAGATAGCTTCTGAAACTGCAGGTGTTCTATCATATTTGCATTCCGCAGCTTCTGTGCCAATCATTCATAGGGATG TCAAGTCTACAAACATACTCCTGGACAACAGTTACACGGCAAAAGTGTCAGATTTTGGCACTTCTAGGTTAATTCCGTTGGATC AAGTTGAATTGTCAACGATGGTGCAAGGTACTCTAGGATACTTAGACCCTGAGTACCTGCACACAAGCCAACTGACGGACAAAA GTGATGTTTACAGTTTTGGAGTGGTTCTTGTGGAACTACTAACTGGGATGAAGGCAATTTCCTTCCATAAGCCTGAGGGGGAGA GGAATTTATCATCGTATTTTCTTTGTGCACTGAAAGAAGATCGCCTGGTCCATATTCTTCAGGATAGCATGGTGAACCAGGATA ATATTAGGCAGCTGAAGGGAGTTGCCAACATTGCAAAGAAGTGCTTAAGAGTAAAAGGAGAGGAAAGACCCAACATGAAGCATG TAGCAATGGAATTAGAGGGGCTAAGAACATCCGCAAAACATCCTTGGACTAATGACAAATCAGATGTAGAAGAGACAGAGTACT TGCTTGGTGAATCAGCGGAAACTGTTCGTTCTGAGGAAATGGCTGGTACAAGTGCTGGATATCACAGTCTACATTTAATACAAT CACAAGGAGATGGCAGATGA
Figura 3.14. Sequenze nucleotidica della porzione codificante del gene Ft32C-WAK
H del clone I-214. In rosso sono indicati gli introni, in nero gli esoni e in grassetto i siti
di restrizione degli enzimi: SspI (aat-att), DraI (ttt-aaa), EcoRV (gat-atc); SnaI (gta-
tac).
A B
I PCR MX II PCR
1800 bp
Grazie all’utilizzo del Genome Walker Universal kit, effettuato previa digestione del DNA genomico di I-214 con l’enzima di restrizione EcoRV, è stato possibile ottenere, dopo la seconda PCR (vedi Materiali e Metodi par. 15), un amplificato contenente la sequenza promotrice. Il prodotto di amplificazione di 1800 bp (figura 3.16) che è stato eluito da gel, clonato in vettore plasmidico e sequenziato.
MX BoxI DraI Ecorv SnaI SspI
1018 bp
BoxI DraI Ecorv SnaI SspI
4400 bp
Figura 3.15. (A) Corsa elettroforetica del DNA del clone I-214 digerito con alcuni
enzimi di restrizione. (B) Corrispondente analisi Southern blot effettuata con una
sonda specifica per Ft32C-WAK H. MX, marker X (Roche).
Mediante l’utilizzo di alcuni software disponibili in rete (PLACE e Softberry) per la ricerca dei domini nelle sequenze promotorici delle piante, e il lavoro svolto da Yamamoto et al. (2007), è stato possibile ricostruire l’architettura del promotore del gene Ft32C-WAK H (Figura 3.17).
In figura 3.17 sono indicati il sito di inizio di trascrizione (TSS) all’interno dell’elemento INR, caratterizzato nelle piante dalla sequenza consensus YYAN(T/A)YY (Y = C o T; R = A o G; N = qualsiasi nucleotide; sottolineato il TSS) (Yamamoto et al., 2007). La TATAbox si trova a -33 residui aminoacidici dal TSS. Nella regione regola toria sono indicate le W-box ((TT)TGAC(C/T)) in entrambi gli orientamenti: queste occupano una regione ben definita compresa tra le posizioni -656bp-+40bp rispetto al TSS.
CGACGGCCCGGGCTGGTATCAGCATATCAAAACGATCCAAAACGCACAATTCATATTAAA TTTTAACAAAAACAATTTCAAATTTTTTAAGAACACAGCCGTAACCGCGTTCCCAAACAG GACCTGAGTGGGTAACCTCATATTTATGCTTCGGTTGATGTAGATCTAGTACATGAACTT GATAGGTTGTTTCGTACTGTTTTCTTTCTGGTTTTCACGGTTAAAAAAATATTTTGATGG TTTTTAATTTTGTAATGAAAAATTTAGTTTGGCTGTTTAGAGAAAAGGTTAAATATAAGA GGATGAAAAGTAAAAGTAAGTTGAAACTTGAAATGATAACTTTTGATTTAAAAAGAATTA TTTTCTTTACATTACTACTATCTTTCAAGTTACCTAGTCTCTTTAAAAACACCCTGCTAT AGATTGTTTCTCTGCAAGAATTTTTGTTTGTGAGAAATTAACAAAGGTTCAATAGCTAAT TAACAATTGTTCCTTTGGGCTAAAATAACCTCCCTTCCCCCTTTAGTTTTTTTTTTTTTT GAAATAATTTTGATTTTGATTTAAACGGGGTTTGCGTCATGCGTGAGATAATTTGTTGTT TCACCAGCGTTTGATTAACGGCAGACAGCTACTAGTACACAAACCCCTGCCACACGGCTA GTGCAAGTAAACTCTACAAGTGGACCCGCAGGATTAGACTGTGAAGGTGGAATCTGGCTG ACTTTAAAAGGTTACCTCTCAGGTCAAGGTCGCACATCCACTCTACTTGCCATGCAATTT CTTGAAATCAATTGCCTCGCCGTTTGATTTACGGCAGACGGCTACCAATACACAAACCTC TGTCACGTAGCAAGTGCAAGTAAATTTGCTGACTATGATCAAATGATGGATCTGGCTGAG AATCCTTTCCTACGTCGAGGTTCTAATTGAGATAAGAAAAATCGAGGACCTAATTGAAAT TGACCTCAAAGTTTGGGGATTTTATAATGAGATTTCTCAAGGAAAAAAATGTACTGACAC TTCCATATTCAAAATTAGGGGGCTTGACTTAGTCGAGTAAAAAGGCTTCGATTCTAGTAA GTTCTTGCTTGCAAGTCCTCTACCACACGCTCTTTTAGATATTCAGTCACGTATATCCCA ACTGGCATTCAAGCCTAATAATTTGGTCTTCCGTCGACCAATATCGGGGTAATTTGCTTT
ATAAAAAAGGCTAGCTGCCACAGTGAGTTCTGCACCACCCGACTCCATTCTAATTAAACAGAAAAGTAGCTGTCATGAGAATTCGAGGA
ATGGCCTTACAGTTCACAATAACAGGA
