COltivazione di ceppi MIcroalgali SARdi per applicazioni
innovative nei settori agro-alimentare, nutraceutico, cosmetico e ambientale – COMISAR: RISULTATI DEL PROGETTO
Progetto finanziato con fondi POR FESR 2014/2020 - ASSE PRIORITARIO I “RICERCA SCIENTIFICA, SVILUPPO TECNOLOGICO E INNOVAZIONE”
Alessandro Concas, Veronica Malavasi, Santina Soru, Giacomo Fais, Massimo Pisu e Giacomo Cao
Relatore: Alessandro Concas
• Prof. Ing. Giacomo Cao (Coordinatore del Progetto – UNICA/CRS4)
• Dott. Ing. Alessandro Concas (Coordinatore per il CRS4)
• Dott. Giacomo Fais (Dottorando - CINSA)
• Dott.ssa Veronica Malavasi (Ricercatrice - CINSA)
• Dott. Ing. Massimo Pisu (Capo area M&S - CRS4)
• Dott.ssa Santina Soru (Ricercatrice - CINSA)
Gruppo di lavoro
Imprese coinvolte
Imprese coinvolte – aggregazione per settore economico
Agricoltura e zootecnia
32%
Dermocosmesi 10%
Materiali per l'industria 16%
Chimica ed ecologia per
l'ambiente 16%
Biocarburanti 5%
Professionisti privati
5%
Formazione e ricerca 11%
Nutraceutica 5%
Oggi le microalghe costituiscono una materia prima tra le più promettenti per la produzione di diversi prodotti ad elevato valore aggiunto in un contesto di bioraffineria ed economia circolare
Quadro di contesto
Gli obiettivi generali del progetto erano :
• Capire se in Sardegna esistessero ceppi autoctoni che potessero essere sfruttati a livello industriale per applicazioni specifiche con risvolti in diversi settori di mercato.
• Sviluppare conoscenza e mettere a punto tecniche/tecnologie e metodi su scala di laboratorio e/o pilota per l’eventuale sfruttamento dei ceppi sardi.
• Analizzare la fattibilità tecno-economica dei processi investigati per lo sfruttamento
• Connettere la ricerca nel settore con gli stakeholders del mondo imprenditoriale Sardo
• Promuovere l’utilizzo in Sardegna delle microalghe e la nascita di un tessuto produttivo/imprenditoriale legato alle stesse
Obiettivi generali
Obiettivi specifici e articolazione del progetto
WP-1 Coordinamento del progetto
Il coordinamento ha garantito il corretto svolgimento delle attività in coerenza a quanto riportato nel progetto nonché le interazioni tra i vari soggetti ed il rispetto del cronoprogramma. Sono stati inoltre redatti i report semestrali e curate le interazioni con SR.
WP 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 1
2 100%
3
4 100%
5 100%
6
7 38%
8 84%
90%
80%
85%
Non sono emerse particolari criticità nell’ambito di questo WP.
WP-2 Scelta dei ceppi microalgali Sardi da investigare
Individuazione, caratterizzazione e sperimentazione di ceppi microalgali isolati in Sardegna.
WP.2.1
Individuazione di ceppi algali adatti e/o adattati alla
coltivazione in Sardegna ...
WP.2.2.
Caratterizzazione, anche genetica e
metabolica, dei ceppi sardi ...
WP.2.3 Definizione preliminare dei pathway metabolici
coinvolti...
WP.2.4
Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi, .. attraverso ..
ingegneria metabolica e/o
genetica.
WP.2.1-a Individuazione dei ceppi
Sono stati individuati n. 5 ceppi:
• SCCA 024
• SCCA 008
• Picochlorum sp. SCCA 034
• Coccomyxa melkonianii SCCA 048
• Chlorella sorokiniana SCCA 090
Ceppi mentenuti presso la:
Sardinian Culture Collectiono of Algae (SCCA)
WP.2.1-b Individuazione dei ceppi – Coccomyxa melkonianii
Il lavoro si è focalizzato poi in particolare sull’alga Coccomyxa melkonianii, campionata nelle acque contaminate del Rio Rivi a Montevecchio.
Per la sua capacità di accrescersi in condizioni estreme che si associa alla possibilità di coltivazione in condizioni avverse e poco controllate come quelle degli open ponds.
Parameter Unit Value
T °C 21,62
pH 6,85
EH mV -14,2
Cd mg/l 1,43
Co mg/l 1,75
Total Fe mg/l 226,82
Mn mg/l 81,18
Ni mg/l 2,97
Pb mg/l 0,003
Zn mg/l 956,6
SO4 mg/l 3694
Sampling site
A
B C
D
E
G F
WP.2.2-a Caratterizzazione dei ceppi
• Alcuni ceppi (SCCA 034 e SCCA 090) sono stati caratterizzati geneticamente, si è scelto di sequenziare l'rRNA 18S, una molecola molto utilizzata per lo studio della filogenesi negli eucarioti, che ci ha permesso di collocare queste microalghe verdi rispettivamente nei generi Picochlorum e Chlorella;
• Sono state effettuate le analisi dello screening metabolomico di Coccomyxa melkonianii SCCA 048 e di Picochlorum sp. SCCA 034. I campioni sono stati estratti con estrazione solido/liquido con solventi polari ed essiccati sotto flusso di azoto.
Gli estratti secchi sono stati derivatizzati e successivamente è stata eseguita l’analisi GC-MS;
• Analisi metabolomica preliminare di C. melkonianii ha mostrato la presenza di significative quantità di myo-inositolo, composto utilizzato nella produzione di un gran numero di integratori presenti sul mercato;
WP.2.2-b Caratterizzazione dei ceppi - procedura
Foresta di Montarbu, Località Arquerì.
Coccomyxa
melkonianii SCCA 048 Picochlorum sp.
SCCA 034
Rio Irvi , località Montevecchio- Ingurtosu.
WP.2.2-c Caratterizzazione dei ceppi – risultati analisi metabolomica
• Individuati 90 metaboliti appartenenti principalmente alle classi di carboidrati, acidi organici e acidi grassi.
• Coccomyxa melkonianii presentava livelli più elevati di acido malico, treonico, glutammico e mioinositolo.
• Picochlorum sp. possedeva livelli più
elevati acidi grassi. PCA – diversità ceppi
WP.2.2-d Caratterizzazione dei ceppi – Usi commerciali metaboliti
Coccomyxa melkonianii SCCA 048
• Acido malico
• Acido treonico
• Mioinositolo
Picochlorum sp. SCCA 034
• Acido stearico
• Acido palmitico
• Acido nonanoico
Integratori, alimenti e farmaci
Saponi, cosmetici, additivi alimentari e biodiesel
Biofuels
WP.2.2-b Caratterizzazione dei ceppi – Altre informazioni
Caratterizzazione termo-gravimetrica Caratterizzazioni
morfologiche
C H N
C. melkonianii 46,71± 0,47 7,94 6,013±0,16
WP.2.3 Definizione pathway metabolici..
• Si è optato di puntare sugli acidi grassi / lipidi che presentano una più ampia gamma di potenziali applicazioni e valori aggiunti potenzialmente elevati.
• Scelta basata anche sulle caratteristiche delle aziende coinvolte che operavano nel settore della cosmetica, nutraceutica e biocarburanti
• L’analisi di letteratura ha premesso di identificare i principali pathway metabolici coinvolti nella produzione degli acidi grassi e lipidi
WP.2.4-a Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi .
Allo stato attuale la ricerca nel settore della ingegnerizzazione genetica delle microalghe al fine dell’incremento della sintesi lipidica non ha ancora fornito risposte univoche quindi non è possibile definire le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi mediante questi metodi.
E’ stata però effettuata una review della letteratura per capire quali sono le tecniche usate e quelle più promettenti. Essenzialmente queste tecniche si dividono in due macro- categorie.
Tecniche di ingegnerizzazione dei ceppi
Mutagenesi Randomizzata:
Chemicals
Radiazioni UV, g, X, fasci di ioni
Trasformazione nucleare per mutagenesi
inserzionale e /o espressione di transgeni
Editing genomico CRISPR
(poco usato per microalghe)
WP.2.4-c Potenzialità di ottimizzazione con mutagenesi.
WP.2.4-c Potenzialità di ottimizzazione con metodi molecolari.
WP.2.4-c Individuare le potenzialità di ottimizzazione dei ceppi..
WP.3 Ottimizzazione dei terreni di coltura
Ottimizzazione dei terreni di coltura
O.3.1
Individuazione di specifiche composizioni del terreno di coltura in
grado di indirizzare il metabolismo algale verso la produzione di composti ad alto valore
aggiunto.
O.3.2
Individuazione di nuovi mezzi di coltura che
consentano la limitazione dei costi
operativi della coltivazione.
O.3.3
Verificare l’uso di CO2 da gas di scarico per arricchire in carbonio il
mezzo di coltura necessario alle alghe
per la fotosintesi.
WP.3.1 Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
Dalla letteratura emerge che i terreni principalmente utilizzati per coltivare alghe sono tre:
WARIS-H Bold’s Basal Medium (BBM)
BG-11
Components and Final Concentration in Culture
Medium
Stock Solution
Addition Per Litre of Culture Medium 1. HEPES (1.00 mM) 238.10 g / l dH2O 1.ml 2. KNO3 (1.00 mM) 100.00 g / l dH2O 1 ml 3. MgSO4 x 7 H2O (81.1 µM) 20.00 g / l dH2O 1 ml 4. (NH4)2HPO4 (0.15 mM) 20.00 g / l dH2O 1 ml 5. Ca(NO3)2 x 4 H2O (0.42 mM) 100.00 g / l dH2O 1 ml
6. Vitamin Solution 1 ml
Vitamin B12 (0.15 nM) 0.20 mg / l dH2O Biotin (4.10 nM) 1.00 mg / l dH2O Thiamine-HCl (0.30 µM) 100.00 mg / l dH2O Niacinamide (0.80 nM) 0.10 mg / l dH2O
7. P-II Metals 1 ml
EDTA (Titriplex III) (8.06 µM) 3.00 g / l dH2O H3BO3 (18.43 µM) 1.14 g / l dH2O MnCl2 x 4 H2O (0.73 µM) 144.00 mg / l dH2O ZnSO4 x 7 H2O (73.00 nM) 21.00 mg / l dH2O CoCl2 x 6 H2O (16.80 nM) 4.00 mg / l dH2O
8. Fe-EDTA 1 ml
EDTA (Titriplex II) (17.86 µM) 5.22 g / l dH2O FeSO4 x 7 H2O (17.90 µM) 4.98 g / l dH2O
1 N KOH 54.00 ml / l dH2O
9. Soil extract 10 ml
EDTA (Titriplex II) and FeSO4 x 7 H2O is heated for 30 min (100oC);
KOH is added to the cooled mixture.
pH of the Vitamin Solution should be around pH 7
Dissolve EDTA and boric acid in dH2O, then add metals one after the other.
WP.3.1-a Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
• In virtù delle concentrazioni di N molto basse il BBM era il mezzo che avrebbe garantito la massima produzione di lipidi e acidi grassi, ossia dei prodotti utili scelti.
• Infatti la carenza di N in soluzione è in grado di innescare la sintesi lipidica a causa di uno sbilanciamento tra i ratei di assimilazione di C e N portando ad un accumulo del primo che viene quindi stoccato dalla cellula in forma di lipide (cfr. Figura).
Concas et al., 2016
WP.3.1-b Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
Dalla letteratura emerge inoltre che per le alghe filogeneticamente vicine a quelle di interesse il mezzo più utilizzato è il BBM.
Pertanto è stato individuato nel Bold’s Basal Medium (BBM) il mezzo che massimizzava i prodotti utili.
WP.3.1-c Terreni di coltura che massimizzano prodotti utili
Dopo individuazione del mezzo sono state effettuate prove sperimentali in foto-bioreattori batch con mezzi di tipo BBM nei quali veniva variata la concentrazione d’azoto per verificare le risposte dell’alga sarda C. melkonianii in termini di concentrazione lipidica totale.
1/5N BBM 5N
10 20 30 40
50 Contenuto lipidico
q L , (% wt)
1/5N BBM 5N
0.0 0.5 1.0 1.5
Concentrazione biomassa
C x, (g L-1 )
1/5N BBM 5N
15 20 25
Concentrazione lipidi
C L , (g L-1 )
Risultati ottimali con BBM
WP.3.2 Terreni di coltura che minimizzano i costi
Il confronto tra le stime dei costi per la realizzazione, inclusi costi dei reagenti e del personale per la preparazione, per i tre mezzi di coltura tipicamente utilizzati ha fatto cadere la scelta sul BBM.
Qualora l’obiettivo della produzione fosse costituito da biocarburanti o bioplastiche la minimizzazione potrebbe essere ottenuta su larga scala attingendo a macro- nutrienti presenti in acque di rifiuto.
Tuttavia le aziende coinvolte nel progetto sono risultate maggiormente interessate al settore nutraceutico/alimentare nell’ambito del quale la legge impedisce il ricorso ad acque reflue come mezzi di coltura. Tale ipotesi pertanto non è stata perseguita in COMISAR
Primary clarifier
Secondary clarifier Aeration Tank
WW
Anaerobic digester
Photobioreactors / Open raceways
Lipid extraction Recycled sludge
Sludge Sludge
Algae Exausted
algae
Algae harvesting Methane
Compost
Lipids Water discharge
N, P, S removal Oxygen
Carbon dioxide
Biofuels Lubricants Other chemicals
Seawater
WP.3.3 Verifica potenzialità di utilizzo di CO
2da gas di scarico
Da sperimentazioni effettuate con altri ceppi, nonché dalla letteratura, si è verificato che l’utilizzo di alte concentrazioni di CO2 non determina l’incremento della produzioni di lipidi o acidi grassi e al contrario può inibire la crescita algale.
E’ necessario inoltre precisare che nel settore nutraceutico – alimentare la legge non consente il ricorso a gas di rifiuto e pertanto essendo questa la vocazione principale all’utilizzo delle alghe da parte delle aziende, la sperimentazione non avrebbe avuto senso nell’ambito del progetto.
Pertanto le verifica non è avvenuta a livello sperimentale ma solo in termini di analisi di dati di letteratura.
WP.4 Analisi delle cinetiche di crescita
Analisi delle cinetiche di crescita in fotobioreattori e/o open ponds.
WP.4.1
Stabilire velocità di crescita e produttività
dei ceppi scelti e individuare gli
accorgimenti per la sua massimizzazione.
WP.4.2 Individuare configurazioni reattoristiche che
massimizzano il compromesso tra produttività e costi di
gestione.
WP.4.3
Definire protocolli per la coltivazione in diverse
tipologie di
fotobioreattore che consentano di ottimizzare
l’utilizzo del flusso luminoso, massimizzare
la captazione di CO2 e minimizzare l’utilizzo di
nutrienti.
O.4.1 Stabilire velocità di crescita e produttività dei ceppi scelti
Attraverso l’integrazione di attività sperimentale condotta in multiwells e interpretazione modellistica, è’ stata analizzata sulla la velocità di crescita di Coccomyxa Melkonianii al variare di diversi parametri di processo.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05
0.06 Experimental data
Fitting of Michaelis Menten kinetics
m(h-1 )
CNO-
3, (mg L-1)
(a)
2 4 6 8 10 12
0.01 0.02 0.03 0.04
0.05 Experimental data
Fitting kinetics model by Tan et al., 1998
m (h-1 )
pH
(b)
Effetto pH su velocità di crescita
Effetto concentrazione azoto su velocità di crescita
WP.4.1-a Crescita di C. melknonianii in PBRs batch con BBM
• L’analisi cinetica in fotobioreattori batch ha poi consentito di valutare anche le produttività di biomassa e lipidiche a diverse quando si utilizzava il BBM.
• Come si vede allo stato stazionario si otteneva una concentrazione di biomassa di ca 1,4 g L-1 e un contenuto lipidico di circa 25 %wt.
• L’interruzione della crescita è ascrivibile all’esaurimento dell’azoto.
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 6.5
7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
Experimental data (BBM)
pH, (-)
Time (h)
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
Exerimental data (BBM)
Biomass concentration, (g L-1 )
Time (h)
(b)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0
5 10 15 20 25 30
35 Experimental data BBM
Lipid content, (wt%)
Time (h)
(d)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0.00
0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
Experimental data BBM
[NO- 3 ], (g L-1 )
Time (h)
(c)
WP.4.1-b Crescita d C. melkonianii in PBRs batch con BBM modificato
• E’ stato valutato l’effetto della variazione della concentrazione di azoto e si sulle cinetiche di crescita e di sintesi lipidica.
• Si osserva che indicendo fenomeni di starving da azoto il contenuto lipidico
aumenta ma la
concentrazione di biomassa si riduce.
• La produttività lipidica pertanto non aumenta al diminuire dell’azoto
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
1.8 Experimental data 5N Experimental data 1/5N
Biomass concentration, (g L-1 )
Time (h)
(b)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0
Experimental data 5N (BBM) Experimental data 1/5N (BBM)
pH, (-)
Time h
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0
10 20 30 40 50
60 Experimental data 5N Experimental data 1/5N
Lipid content, (wt%)
Time (h)
(d)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0.00
0.05 0.10 0.15 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
1.6 Experimental data 5N Experimental data 1/5N
[NO- 3 ], (g L-1 )
Time (h)
(c)
WP.4.1-c Qualità del prodotto utile e produttività
• Il prodotto utile è stato caratterizzato in termini di composizione in FAMEs (fatty acids methyl esters) dei lipidi estratti
• A seconda del tipo di coltivazione (con più o meno azoto) l’olio estratto presenta diverse composizioni.
BBM 5N 1/5N
0 20 40 60 80
100 NFA
(C20:1) (C20:0) (C18:3) (C18:2) (C18:1) (C18:0) (C17:0) (C16:1) (C16:0) (C8:0)
Fatty acid composition of lipids, (% wt)
L'acido palmitico ha proprietà emollienti e lipogelificanti. Viene anche utilizzato come
ingrediente intermedio per l'ottenimento di numerose materie prime cosmetiche ➔ USO IN COMSESI
Acido gamma linolenico. Della famiglia omega 6, possiede importanti proprietà antinfiammatorie
➔ USO IN NUTRACEUTICA E SETTORE FOOD
L'acido stearico viene utilizzato principalmente come fattore di consistenza nelle formulazioni cosmetiche ➔
USO IN COMSESI
Prodotto ‘aggiustabile’ cambiando il tipo di coltivazione
WP.4.1-d Effetto del pH sulla velocità di crescita in batch
Oltre alle prove in cui veniva variato il contenuto di azoto sono state effettuate delle prove in cui il pH veniva stabilizzato a diversi valori.
Confermando le prove in multiwell, la velocità di crescita migliore si è osservata ad un valore di pH vicino alla neutralità. Si osserva però che anche a pH molto bassi non si ha significativa riduzione della velocità di crescita.
WP.4.1-e Produttività in biomassa e lipidiche a differenti pH
Anche le analisi di produttività in biomassa e lipidiche sono massime a valori di pH circa neutrali.
E’ importante sottolineare però che valori di pH molto bassi non influenzano molto la produttività e pertanto il ceppo si adatta a coltivazioni in open ponds utilizzando strategie di coltivazione selettiva (pH bassi) che consentono di abbattere competitori, batteri, predatori, rodofiti etc.
WP.4.1-f Produttività in biomassa e lipidiche a differenti pH
In questo caso oltre ai FAMEs precedentemente discussi, in alcune condizioni si è osservata una buona concentrazione di oleico e linoleico utili anche nella prevenzione del colesterolo.
Coltivando a pH 4 si possono ottenere anche importanti quantità di acido eptadecenoico.
Oltre alle applicazioni sono possibili utilizzi nel settore
bioenergetico e delle
mangimistica.
WP.4.2 Individuare configurazioni reattoristiche ottimali
Sono state testate diverse tipologie reattoristiche su diversa scala
Multiwell 2 mL
Batch 2 L
Flasks 250 mL Sacchi PET 20 L
BIOCOIL 10 L
Raceway chiuso fino a 50 L
WP.4.2-a Individuare configurazioni reattoristiche ottimali
• Le prime due configurazioni considerate sono utilizzabili solo su scala di laboratorio mentre la altre si prestano anche all’utilizzo su scala industriale
• La configurazione batch trova un equivalente industriale nella cosiddetta configurazione
«bubble column» abbastanza nota.
• La configurazione BIOCOIL si è rivelata poco adatta al ceppo sardo che tendeva ad aderire sulle pareti del COIL e a formare aggregati algali mucillaginosi limitando la penetrazione della luce.
• La configurazione a sacchi sarebbe sicuramente la più vantaggiosa in termini di costi di investimento e processo ma non consente un controllo adeguato della coltura e quindi l’ottenimento di adeguate produttività.
• La configurazione ritenuta più vantaggiosa è quella del cosiddetto raceways chiuso che unisce i bassi costi realizzativi dei gestione degli open ponds alle possibilità di controllo e limitazione della contaminazione che caratterizzano i PBR chiusi
WP.4.2-b Individuare configurazioni reattoristiche ottimali
• La configurazione ‘closed raceway’ è stata pertanto considerato quella col migliore bilancio costi-benefici essendo il beneficio quantificato in termini di produttività lipidica.
• Il ‘closed raceway’ è stata pertanto la configurazione scelta per la realizzazione dell’impiantino pilota.
• Esperimenti preliminari su configurazioni non ancora ottimizzate di ‘closed raceway’ chiuso hanno mostrato che i risultati ottenuti su scala di laboratorio sono opportunamente riprodotti in questo tipo di reattore
WP.4.3 Definire protocolli per la coltivazione ottimale
Sulla base delle evidenze sperimentali è stato individuato un set di valori ottimali delle variabili operative comune a tutte le tipologie reattoristiche investigate che pertanto costituisce il protocollo comune per la coltivazione di Coccomyxa Melkonianii al fine dell’ottenimento delle migliori produttività dei prodotti utili.
Perametro operativo Valore Unità di misura
Mezzo di coltura Bold Basal Medium -
Concentrazione iniziale NaNO3 0,25 g L-1
pH 6,8 -
Flusso luminoso* 80-100 mE m-2 s-1
Temperatura 25-28 °C
Flusso d'aria*° 20 mL min-1 L-1
Concentrazione CO2 nel flusso 0,04 %vol
Tempo di scarico per batch 1 mese
Dilution rate per fed-batch*** 0,01 hr-1
Dilution rate per fed-batch**** 0,005 hr-1
* Da garantire su tutta la superficie del PBR
** Riferito all'unità di volume di reattore
*** Per massimizzazione produzione biomassa
**** Per massimizzazione produzione lipidi
WP.5 Sviluppo e ottimizzazione di tecnologie di estrazione dei composti
Sviluppo e ottimizzazione di tecnologie di estrazione dei composti intracellulari ad elevato valore aggiunto.
WP.5.1
Sviluppare tecniche di estrazione dei
composti utili dalle alghe che consentano
di perseguire il
compromesso ottimale tra resa di estrazione,
purezza finale del composto e costi del processo di estrattivo
WP.5.2
Massimizzare la purezza del prodotto
estratto in modo da incrementare il prezzo
di vendita
WP.5.3
Individuare solventi e/o miscele “environmental friendly” per limitare gli impatti ambientali di tale
fase operativa.
WP.5.1 Tecniche di estrazione
• E’ stata sviluppata una tecnica di estrazione
innovativa in cui
l’operazione di ‘cell disruption’ consisteva in una fase di congelamento seguita da un reazione con reattivo di Fenton.
• Questo consente sia di rompere la parte cellulare facilitando le fasi successive di diffusione del solvente e contro-diffusione del complesso lipide-solvente
WP.5.1-a La tecnica di estrazione
WP.5.1-b La tecnica di estrazione – ottimizzazione e risultati
Effetto del congelamento
Effetto del peso di solido (rapporto S/L)
Biomassa fresca Dopo trattamento termico 0
2 4 6 8 10 12 14 16
Lipidi estratti, % wt
1/1 1/2 1/4
0 5 10 15 20 25
Lipidi estratti, % wt
Peso
WP.5.1-c La tecnica di estrazione – vantaggi
• La tecnica, facilitando le fasi di estrazione con solvente grazie all’azione di rottura delle cellule promossa dal ciclo di congelamento/scongelamento e dalle reazioni radicaliche del reattivo di Fenton consente di limitare il ricorso a solventi (esano ed etanolo).
• Questo riduce sia i costi del processo e limita i potenziali effetti dannosi sulla salute e sull’ambiente.
• Una possibile trasposizione industriale della sola fase estrattiva (escluso ciclo termico e disruption) della tecnica è quella riportato in Figura.
Centrifuge
PURIFIED CRUDE OIL Ethanol ( polar)
n-hexane (non-polar)
Microalgae
• disrupted concentrate
• dried powder
Contact time > 18 h
Supernatant
Residual biomass
n-hexane
water
Bi-phasic solution
Phase separation
Acqueous/alcoholic
phase(chlorphylls, proteins etc.) Organic phase
(with lipids)
WP.5.2 Massimizzare la purezza del prodotto estratto
La tecnica finora esposta consentiva di ottenere lipidi caratterizzati da elevata purezza,
infatti dalle analisi
cromatografiche le percentuali di estratto non ascrivibile alla classe dei FAMEs risultava compresa tra il 20 e lo 0.1 %wt con purezze quindi variabili tra 80 % e 99 % se si ragiona in termini di lipidi totali.
Non risultava pertanto necessario
purificare oltre il prodotto BBM 5N 1/5N
0 20 40 60 80
100 NFA
(C20:1) (C20:0) (C18:3) (C18:2) (C18:1) (C18:0) (C17:0) (C16:1) (C16:0) (C8:0)
Fatty acid composition of lipids, (% wt)
NFA (not fatty acids) = Aliquota di olio estratto non ascrivibile ad acidi grassi e quindi considerabili impurità
WP.5.2-a Eventuale frazionamento del prodotto
Qualora si puntasse alla vendita non dell’olio algale ma di un acido grasso specifico sarebbe necessario il frazionamento cromatografico.
Questo è stato fatto nell’ambito del progetto a scopo analitico ed era caratterizzato dalla seguente procedura.
Parametro/ condizione operativa Valore/descrizione
Gascromatografo: Trace (Thermo Finnigan, Rodano, Milano, Italia) dotato di un rilevatore FID
Autocampionatore: AS 800 e un iniettore split-splitless
Colonna Capillare:
CP-WAX 57CB di Varian (60 m di lunghezza, 0,25 mm di diametro e 0,25 mm di spessore del film, Varian Inc., Palo Alto, CA) operante da 50 a 220 ° C (13 min) a 3 ° C / min
Temperatura iniettore : 200 °C Temperatura rivelatore: 280°C
Fluido di trasporto: Elio a 120 kPa Fluido di trasporto per replica: Azoto a 180 kPa
Metodo di analisi dei FAMES:
I composti standard in olio estratto sono stati identificati confrontando i loro tempi di ritenzione relativi con quelli della miscela FAME MIX C4-C24 CRM47885 utilizzata come riferimento.
Procedura analitica per l’analisi cromatografica dei FAMEs
WP.5.3 Individuare solventi e/o miscele “environmental friendly”
A tal proposito, in collaborazione col Dipartimento di Chimica dell’Università di Cagliari, è stata effettuata una sperimentazione spot di estrazione con CO2 supercritica da un campione di biomassa algale di Chlorella.
Schema dell'impianto di estrazione da laboratorio con fluidi supercritici: B bombola di CO2 con tubo pescante; M1 - M5 manometri; BT crio-termostato; H pre-riscaldatore; P pompa per liquidi; RD disco di scoppio; D, polmone; Tc1 - Tc3 termocoppie; E estrattore; Vm1, Vm2 valvole micrometriche; S1, S2 separatori;
FM flussimetro; CdF misuratore di portata.
Pmax= 350 bar
WP.5.3-a Risultati ottenuti con estrazione supercirtica
Le condizioni operative sono state:
• 300 bar e 40 °C nella sezione di estrazione;
• 20 bar e 40 °C nella sezione di separazione;
• portata del CO2 pari a 1.2 kg h-1 per una durata di 4 h.
A 300 bar e 40 °C il CO2 possiede un’elevata densità e potere solvente mentre a 20 bar e 40 °C il CO2 ritorna allo stato di gas sub-critico, perde il suo potere solubilizzante e rilascia l’estratto all’interno del separatore. Aprendo la valvola inferiore del separatore è possibile raccogliere l’estratto finale da cui, a pressione e temperatura ambiente il CO2 gassoso si allontana spontaneamente.
Nella prova effettuata, nell’estrattore sono stati caricati 278 g di biomassa algale. L’estratto ottenuto, 3.4 g (resa 1.2 %, w/w) era costituito da una fase semisolida di colore verde scuro. Il campione è stato trasferito in una boccetta e conservato in frigorifero a +4 °C.
WP.6 Modelli matematici, tools e software…
Modelli matematici, tools e software, per la progettazione, il controllo e l’ottimizzazione dei
fotobioreattori.
WP.6.1
Interpretazione quantitativa dei dati sperimentali
per l’inferenza di informazioni utili al miglioramento della tecnologia.
WP.6.2 Simulazione
delle
performances del processo in
condizioni differenti da
quelle investigate
WP.6.3
Individuazione delle condizioni
operative ottimali.
WP.6.4
Ingegnerizz. e ottimizzazione
tecno-
economica delle unità
impiantistiche coinvolte nel
processo.
WP.6.5
Sviluppare tools informatici per la simulazione, l’ottimizzazione e il controllo dei
fotobioreattori investigati
WP.6.1 Interpretazione modellistica dei dati sperimentali
Equation Significance
Bilancio biomassa algale in PBR batch
Dipendenza della velocità di crescita dalla concentrazione di nitrati
Dipendenza della velocità di crescita dal flusso luminoso
Dipendenza della velocità di crescita dal pH.
Densità media del flusso fotonico all’interno della coltura in fotobioreattori cilindrici di raggio R investiti da un flusso incidente I0.
Bilancio di massa sui nitrati in fase bluk
Bilancio di massa sulla concentrazione lipidica
WP.6.1-a Interpretazione modellistica dei dati sperimentali
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5 11,0
Experimental data (BBM) Interpolation for model input
pH, (-)
Time (h)
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0,0
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
Exerimental data (BBM) Model fitting
Biomass concentration, (g L-1 )
Time (h)
(b)
1
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 0,00
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
0,50 Experimental data BBM Model fitting
C NO- 3, (g L-1 )
Time (h)
(c)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 5 10 15 20 25 30
35 Experimental data BBM Model fitting
Lipid content, qL (wt%)
Time (h)
(d)
2
Interpretazione dei dati sperimentali mediante ‘tuning ‘ dei parametri modellistici (Fitting)
Parameter Value Units Reference
𝑲𝑪 5.76 × 101 𝐿 𝑔−1𝑚−1 Jeffryes et al. 2013
𝑰𝟎 1.00 × 102 𝜇𝐸 𝑚−2𝑠−1 Experimentally measured
𝑰𝑲 2.70 × 102 𝜇𝐸 𝑚−2𝑠−1 This work
𝒏 1.70 × 100 - Grima et al., 1994
𝒒𝑳,𝒎𝒂𝒙 4.80 × 101 𝑤𝑡% Evaluated as reported by Concas et al., 2016
𝑹 4.00 × 10−2 𝑚 Experimentally measured
𝒀𝑵𝑶𝟑− 1.95 × 10−1 - This work
𝜶 1.50 × 10−2 - This work
𝝍 5.00 × 10−2 𝑔 𝐿−1 This work
1
WP.6.1-b Interpretazione modellistica dei dati sperimentali
Valutazione della capacità predittiva del modello mediante simulazione di nuovi dati sperimentali, ottenuti in condizioni operative differenti, senza aggiustare alcun parametro del modello rispetto a quelli riportati precedentemente.
Il modello predice bene i risultati sperimentali e può essere utilizzato per valutare ex-ante diverse condizioni operative
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10,0 10,5
11,0 Experimental data, 5N Experimental data, 1/5N Interpolation for model input
pH, (/)
Time h
(a)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
1,8 Experimental data 5N Experimental data 1/5N Model Prediction
Biomass concentration, (g L-1 )
Time (h)
(b)
1
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0,00 0,05 0,10 0,15 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
1,6 Experimental data 5N
Experimental data 1/5N Model prediction
C NO- 3, (g L-1 )
Time (h)
(c)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0 10 20 30 40 50
60 Experimental data 5N
Experimental data 1/5N Model prediction
Lipid content, q L (wt%)
Time (h)
(d)
2
WP.6.1-c Utilizzo del modello per valutare produttività
L’utilizzo del modello insieme ai dati sperimentali sulla composizione degli oli permette anche di valutare le potenziali produttività dei diversi acidi grassi (ossia del prodotto da commercializzare) ottenibili lavorando in batch
C8:0 C16:0 C16:1 C17:0 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10 0.11
Lipid productivity (mg L-1 h-1 ) BBM
5N 1/5N
WP.6.2 Simulazione performances del processo in condizioni differenti
Il modello in questo caso tiene conto della dilution ratio = rapporto tra portata estratta in continuo e volume del reattore
Sono state simulate condizioni di funzionamento del PBR in modalità fed-batch (non utilizzata nelle prove sperimentali) in modo da avere informazioni sulle produttività
massime ottenibili a livello industriale. La modalità operativa fed-batch è infatti più adatta all’utilizzo su scala industriale
WP.6.3 Individuazione delle condizioni operative ottimali.
Grazie al modello sono state quindi ottenute opportune mappe di ottimizzazione che forniscono le coppie di valori di concentrazione iniziale d’azoto e il «dilution rate» che massimizzano le produttività sia in termini di biomassa sia in termini di lipidi
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,00
0,05 0,10 0,15 0,20
Dilution rate, D (h-1) Initial nitrogen concentration, C0 NO3
0 2,500E-5 5,000E-5 7,500E-5 1,000E-4
Lipid productivity (mg L-1 h-1)
0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,00
0,05 0,10 0,15 0,20
Biomass productivity (g L-1 h-1)
Dilution rate, D (h-1) Intial NO 3 concentration, C0 NO3 (g L-1 )
0 0,001750 0,003500 0,005250 0,007000
Le zone in rosso individuano le condizioni operative ottimali per quanto concerne ‘dilution rate’ e concentrazione d’azoto nel mezzo di coltura
WP.6.4 Ottimizzazione tecno-economica
• E’ stato sviluppato un tool, in excel, che consente di valutare le rese dei fotobioreattori e dei sistemi di estrazione al variare di diversi parametri di processo, comprese le caratteristiche meteo climatiche del sito di ubicazione.
• A tali valutazioni si affiancano quelle economiche di valutazione dei costi di investimento e di gestione per gli impianti, sia quelli di coltivazioni che quelli di estrazione.
• Lo stesso tool poi consente di avere un prima valutazione dei prezzi unitari a cui si deve vendere il prodotto (biomassa o olio) al fine di avere un tempo di ritorno dell’investimento pre-stabilito.
• Facendo diverse valutazioni attraverso questo tool si può ovviamente pervenire alle configurazioni ottimali
WP.6.4-a Ottimizzazione tecno-economica sezione di coltivazione
Riassunti annuali (valori per anno)
Input Valore Unità Consumi specifici Valore Unità
Energia radiante 28974 GJ Biomassa/kWh 0.008 kg/kWh
Acqua integrazione 14965 m3 Biomassa/m3 water 0.924 kg/m3
Pioggia 2825 m3 Biomassa/kg N 9.30 kg/kg
Digestato 0 m3 Biomassa/kWhe 0.051 kg/kWh
Azoto 1488 kg Biomassa/kWhh 0.0093 kg/kWh
Elettricità 270946 kWh
CO2 (flue gas) 54783 kg
Calore 1492913 kWh
Personale (LQ) 2191 hr
Personale (HQ) 93 hr Rese specifiche Valore Unità
Ingombro 0.55 ha Biomassa algale secca 25.0 ton/ha
Carboidrati 5.1 ton/ha
Output Valore Unità Proteine 14.0 ton/ha
Biomassa 13834 kg dw Lipidi 2.5 ton/ha
Acque da integrare 14965 m3 Residuo secco 2.1 ton/ha
CO2 (rest flue gas) 27391 kg Anioni organici e ceneri 1.3 ton/ha
00 500 1'000 1'500 2'000 2'500
Gen Feb Mar Apr Mag Giu Lug Ago Set Ott Nov Dic
Biomnassa (kg/mese)
Produzione mensile di biomassa algale
0,2 m/s
10 x
1 x
WP.6.4-b Ottimizzazione tecno-economica sezione di coltivazione
Numero Ponds utilizzati 5
Costi d'investimento sezione coltivazione Superficie totale impianto (m2) 6000 Costi variabili unitari (per anno)
Costo Valore Costo €/kg/anno
Costruzione pond € 13'133 Fertilizzanti (N) 0.12
Miscelatore € 23'639 Fertilizzanti (P) 0.01
Scambiatori calore € 73'543 Acqua 0.95
Sparging € 70'916 Elettricità 2.10
Illuminazione € 0 Personale LQ 1.83
Controllo processo 1 € 39'398 Personale HQ 0.17
Infrastruttura 1 € 196'990 Acque di rifiuto 0.07
Totale coltivazione € 417'618 Ammortam/manutenz/Assic/inter 8.23
Terra 0.04
Costi d'investimento sezione raccolta Totale 14
Costo Valore
Centrifuga € 151'572
Controllo processo 2 € 26'265 Risultati economici
Infrastruttura 2 € 43'505 Dati Economici Valore
Essicatore € 26'265 Ricavi totali € 261'277
Totale raccolta € 247'607 Costi totali € 186'948
Guadagni totali € 74'329
Investimento totale € 665'225 Ricavo / 100€ costi 140
Prezzo unitario di vendita (€/kg) € 18.89
Costo unitario di produzione € 13.51
Investimento totale € 776'306
Ritorno sugli investimenti (ROI) 20%
Tempo di ritorno (anni) 5.0
Inserire Tempo di ritorno desiderato (anni) 5.00
Check valore di mercato
€ 18.9
€ '0
€ 50'000
€ 100'000
€ 150'000
€ 200'000
€ 250'000
€ 300'000
€ 350'000
€ 400'000
€ 450'000
Totale coltivazione Totale raccolta
Costruzione pond
2%
Miscelatore
3% Scambiatori calore
11%
Sparging
11%Illuminazion e 0%
Controllo processo 1
6%
Infrastruttur a coltivaz
30%
Centrifuga 23%
Infrastruttur a 2 6%
Essicatore 4%
Incidenze sui costi di investimento
Fertilizzanti (N) 0.01
Acqua 7%
Elettricità 15%
Personale LQ 14%
Personale HQ 1%
Acque di rifiuto
1%
Ammortam /manutenz/
Assic/inter 61%
Incidenze sui costi variabili
Calcola prezzo di vendita
WP.6.4-c Ottimizzazione tecno-economica sezione di estrazione
Biomassa algale (20 %H20) CO2+ Olio
Umida 93143 kg/y Tempo di resid. 1 h
Secca 74514 kg/y 10 L Reattore/miscelatore Capacità 20 L
Olio 25% Operation: Semi-Batch T 40 - 80 °C Sedimentatore Elettricità (tot) 547 KWh/y
8 kg/batch P 30 - 35 MPa Tempo batch 8 h
11643 batches/y Energia 74514 kWh/y
Raffreddamento H2O 708 kg/y
Capacità Compressore /condensazione
11.643 kg/h Residuo estrazione H3PO4 1.8 kg/y
56817 kg/y
Consumo energetico NaOH 5.4 kg/y
139342 kWh/y Biomassa trattata
Secca 74514.3 kg/y Separazione C6H8O7 1.0 kg/y
Efficienza di rottura CO2 olio grezzo
95% Recuperata
80% Olio raffinato
Funzionamento: Batch 18442 L/y
Olio grezzo
Integrazione CO2 17697 kg/y Acqua di rifiuto
46592 kg/y Riscaldamento 0.90 m3/y
CO2
Capacità 1 colonna
CO2+ Olio algale
Ball mill
Estrattore CO2
Evidenziati nei rettangolo rossi i flussi valorizzabili. Si tenga conto che anche la biomassa residua, in quanto ricca di proteine, è valorizzabile nel settore della mangimistica per zootecnia o per acqua coltura.
In seguito si ipotizzerà di venderla a 0.35 €/kg
