PARTE SPERIMENTALE

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CAPITOLO 3

PARTE SPERIMENTALE

Materiale vegetale

Le radici di Scorzonera judaica Eig. sono state raccolte presso Dab’A, Giordania, nell’aprile 2009.

Un campione di materiale vegetale (voucher n. Jo-It 2009/1) è stato depositato presso l’Al-Zaytoonah, University of Jordan, Amman, Giordania.

Estrazione

Il materiale vegetale (700 g) è stato sottoposto ad essiccazione all’aria, macinazione e successiva estrazione a temperatura ambiente con solventi a polarità crescente: n-esano, cloroformio, cloroformio– metanolo (9:1) e metanolo (Fig. 3.1).

La droga è stata estratta attraverso macerazione statica con ciascun solvente ogni 48 h per circa 3 settimane, durante le quali il solvente stesso è stato rinnovato di frequente (3 × 2 L).

Gli estratti ottenuti ad ogni cambio di solvente sono stati evaporati a pressione ridotta e a temperatura inferiore a 40 °C; ad estrazione finita si sono ottenute le seguenti rese: • RE • R estratto n-esanico (34.40 g) C • R estratto cloroformico (15.77 g) CM • R

estratto cloroformio – metanolo (14.42 g) M estratto metanolico (73.71 g)

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Fig. 3.1 Diagramma della procedura di estrazione di Scorzonera judaica Eig.

Dagli studi fitochimici condotti sul genere presenti in letteratura e da un’analisi preliminare degli estratti attraverso cromatografia su strato sottile (TLC), sono stati scelti come obiettivo di studio nell’ordine, l’estratto cloroformio–metanolo, l’estratto cloroformico e l’estratto metanolico.

Studio dell’estratto cloroformio – metanolo (9:1)

L’estratto cloroformio–metanolo (10.54 g di 14.42 g) è stato sciolto in circa 30 ml di metanolo e sottoposto a centrifugazione. Il sovranatante è stato caricato su colonna Sephadex LH-20 (i.d.= 5 cm, V = 19.6 ml/cm) eluendo con metanolo con un flusso di 0.8 ml/min. Le 174 frazioni raccolte, di circa 15 ml ciascuna, oltre a due di lavaggio da 200 ml, sono state sottoposte a TLC (Thin Layer Chromatography) su gel di silice 60 F254, usando come eluenti BAW (n-butanolo–acido acetico–acqua, 60:15:25) e CMW (cloroformio–metanolo– acqua, 80:18:2), e identificate utilizzando il solfato di cerio come reattivo spray.

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Le 176 frazioni sono state successivamente riunite in 25 frazioni principali (1-25) in base alle somiglianze cromatografiche evidenziate attraverso TLC (Fig. 3.2). Alcune frazioni prive di evidenti macchie cromatografiche sono state eliminate.

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Analisi della frazione R

CM

La frazione 11 (1.491g) è stata ripartita per mezzo di un imbuto separatore in una porzione n-butanolica, R

11:

BuOH, e in una acquosa, RH2O

• Attenuazione = 16x

, in modo tale da eliminare la componente zuccherina disciolta in quest’ultima fase. Il residuo butanolico così ottenuto (89.2 mg) è stato sciolto in circa 900 μl di metanolo puro per HPLC e centrifugato. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (2:3), utilizzando le seguenti condizioni:

• Eluente = MeOH:H₂ • Iniettata = 100 μl

O (2:3)

• Numero di iniettate = 7

• Velocità di flusso = 2.0 ml/min

Le 27 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela CMW (cloroformio–metanolo–acqua 80:18:2) e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in 6 frazioni principali (1-6) (Fig. 3.3).

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La frazione 115 sottoposta a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si è presentata come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto è stata studiata ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione del composto 1 come 4β-[(β-D

-glucopiranosil)-idrossi]-pinoresinolo (4.3 mg; tR=12 min).

I dati chimico-fisici del composto 1 sono i seguenti:

Composto 1: solido amorfo brunastro; [α]25d = +26° (c 0.1, MeOH); ¹H- e ¹³C-NMR vedi tab. 2.9, capitolo 2; ESI-MS m/z 559 [M+Na]+, 379 [M+Na−180]+, 580 [M−H+HCOOH]−.

Analisi della frazione R

CM

La frazione 13+14 (314.9 mg) è stata sciolta in circa 3 ml di metanolo puro per HPLC e centrifugata. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (2:3), utilizzando le seguenti condizioni:

13+14:

• Attenuazione = 16x • Eluente = MeOH:H2 • Iniettata = 100 μl O (2:3) • Numero di iniettate = 13

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Fig. 3.4 HPLC della frazione RCM 13+14

Le frazioni 13+143, 13+145, 13+147 e 13+149 sottoposte a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione rispettivamente del composto 1 come 4β-[(β-D-glucopiranosil)-idrossi]-pinoresinolo (2.7 mg; tR=12 min), precedentemente isolato dalla frazione RCM 11, del composto 2 come idrangenolo-8-O-β-D-glucopiranoside (1.4 mg; tR=15 min), del composto 3 come idrangenolo 4’-O-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucopiranoside (3.2 mg;

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tR=23 min) e del composto 4 come idrangenolo-4’-O- α-L-rhamnopiranosil-(1→3)-β-D-glucopiranoside (5.4 mg, tR=30 min).

I dati chimico-fisici dei composti 2-4 sono i seguenti:

Composto 2: solido amorfo bruno; ¹H- e ¹³C-NMR vedi tab. 2.1, capitolo 2;

ESI-MS m/z 441 [M+Na]+, 423 [M+Na−18]+, 279 [M+Na−162]+, 417 [M−H]−, 255 [M−H−162]−

ESI-MS m/z 573 [M+Na] .

+

, 555 [M+Na−18]+, 423 [M+Na−18−132]+, 261 [M+Na−18−132−162]+

Composto 4: solido amorfo brunastro; [α]

.

25

d = −46° (c 0.1 MeOH); ¹H- e ¹³C-NMR vedi tab. 2.3, capitolo 2; ESI-MS m/z 563 [M−H]−, 587 [M+Na]+, 569 [M+Na−18]+, 441 [M+Na−146]+.

Analisi della frazione R

CM

La frazione 16 (123 mg) è stata sciolta in circa 1.2 ml di metanolo puro per HPLC e centrifugata. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (3.5:6.5), utilizzando le seguenti condizioni:

16:

• Attenuazione = 16x • Eluente = MeOH:H2 • Iniettata = 100 μl O (3.5:6.5) • Numero di iniettate = 10

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Le frazioni 167, 1615 e 1616 sottoposte a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione del composto 6 (1616) come acido caffeico metil estere (9.3 mg; tR=35 min) e del composto 9 (1615) come 4α-idrossipinoresinolo o 9α-idrossipinoresinolo (0.8 mg; tR=30 min), mentre la frazione 167 contiene il composto a (3 mg; tR=13 min) ancora in fase di caratterizzazione.

I dati chimico-fisici dei composti 6 e 9 sono i seguenti:

Composto 6: solido amorfo bruno; ¹H- e ¹³C-NMR vedi tab. 2.8, capitolo 2.

ESI-MS m/z 193 [M−H]−

Composto 9: solido amorfo brunastro; ¹H- e ¹³C-NMR vedi tab. 2.10, capitolo 2.

ESI-MS m/z 373 [M−H] .

−_.

Analisi della frazione R

CM

La frazione 17 (71.8 mg) è stata sciolta in circa 720 μl di metanolo puro per HPLC e centrifugata. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (2:3), utilizzando le seguenti condizioni:

17:

• Attenuazione = 16x • Eluente = MeOH:H₂ • Iniettata = 100 μl O (2:3) • Numero di iniettate = 7

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Le frazioni 171, 177 e 1713 sottoposte a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione rispettivamente del composto 5 come acido 3,4-didrossi-benzoico o acido protocatecuico (1.2 mg; tR=5 min), del composto 6 come acido caffeico metil estere (1.3 mg; tR=23 min), precedentemente isolato dalla frazione RCM 16, mentre la frazione 1713 contiene il composto b ancora in fase di caratterizzazione (1.4 mg, tR=23 min).

ESI-MS m/z 153 [M−H]−.

Analisi della frazione R

CM

La frazione 18 (82.9 mg) è stata sciolta in circa 900 μl di metanolo puro per HPLC e centrifugata. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (1:1), utilizzando le seguenti condizioni:

18:

• Attenuazione = 16x • Eluente = MeOH:H2 • Iniettata = 100 μl O (1:1) • Numero di iniettate = 5

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Fig. 3.7 HPLC della frazione RCM 18

Le frazioni 184 e 185 sottoposte a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione del composto 7 come idrangenolo (9.1 mg; tR=24 min), mentre la frazione 185 è il composto b precedentemente isolato dalla frazione RCM 17 (2.7 mg; tR=14 min).

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ESI-MS m/z 257 [M+H]+, 239 [M+H−18 ]+, 211 [M+H−18−28 ]+, 255 [M−H ]−, 211 [M−H−44]−.

Studio dell’estratto cloroformico

Una parte di estratto cloroformico RC (10.26 g), dopo essere stato disciolto nella minima quantità di una miscela esano:cloroformio 7:3, è stato centrifugato. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia flash, realizzata attraverso una colonna di silice (9 x 25 cm) con flusso approssimativo di 25 ml/min. Sono state raccolte frazioni di circa 70 ml, utilizzando come fase mobile eluenti a polarità crescente, come indicato nella Tab 3.1:

Eluente Frazioni raccolte

Esano : CHCl3 7 : 3 1-188 Esano : CHCl3 1 : 1 189-240 CHCl3 241-377 CHCl3 : MeOH 99 : 1 378-429 CHCl3 : MeOH 98 : 2 430-457 CHCl3 : MeOH 97 : 3 458-498 CHCl3 : MeOH 95 : 5 499-543 CHCl3 : MeOH 9 : 1 544-613 MeOH Lavaggio

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Le 616 frazioni ottenute sono state successivamente riunite in 31 frazioni principali (Fig. 3.8) sulla base delle caratteristiche cromatografiche evidenziate attraverso TLC (Thin Layer Chromatography) su gel di silice 60 F254 , utilizzando come fase mobile CHCl3 e miscele esano:CHCl3 3:2 e 2:3, CHCl3:MeOH 98:2 , 95:5 e 9:1 e come reattivo spray il solfato di cerio. Alcune frazioni prive di evidenti macchie cromatografiche sono state eliminate.

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Analisi della frazione R

C

La frazione 21 (338.2 mg) è stata sciolta in circa 4 ml di una miscela MeOH:H

21:

2O 4:1 e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco, pesato (65.1 mg) e disciolto in 700 μl di una miscela MeOH:H2O 6.5:3.5 e nuovamente centrifugato. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC

μ-Bondapak RP-18 eluendo con MeOH:H2

• Attenuazione = 16x O 6.5:3.5, utilizzando le seguenti condizioni: • Eluente = MeOH:H2 • Iniettata = 100 μl O (6.5:3.5) • Numero di iniettate = 7

Le 18 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela cloroformio–metanolo 98:2 e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in 7 frazioni principali (1-7) (Fig. 3.9).

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Fig. 3.9 HPLC della frazione RC 21

Le frazioni 213 e 215+6 sottoposte a TLC utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione del composto 7 come idrangenolo (12.7 mg; tR=11 min), precedentemente isolato anche dall’estratto cloroformio-metanolo (RCM 18), mentre la frazione 213 è il composto c (2.2 mg; tR=7 min) ancora in fase di caratterizzazione.

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Analisi della frazione R

C

La frazione 24 (273.3 mg) è stata sciolta in circa 4 ml di una miscela MeOH:H

24:

2O 4:1 e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco, pesato (72.9 mg) e disciolto in 750 μl di una miscela MeOH:H2O 5.5:4.5 e nuovamente centrifugato. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con MeOH:H2O 5.5:4.5, utilizzando le seguenti condizioni: • Attenuazione = 16x • Eluente = MeOH:H₂ • Iniettata = 100 μl O (5.5:4.5) • Numero di iniettate = 7

Le 25 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela cloroformio–metanolo 98:2 e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in 6 frazioni principali (1-6) (Fig. 3.10).

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La frazione 245 sottoposta a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si è presentata come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto è stata sottoposta ad analisi spettroscopiche che hanno portato all’identificazione del composto 7 come idrangenolo (5.7 mg; tR=20 min), precedentemente isolato anche dall’estratto RCM (RCM 18) e dalla frazione RC 21.

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Analisi della frazione R

C

La frazione 26 (210.7 mg) è stata sciolta in circa 4 ml di MeOH puro e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco, pesato (49.6 mg) e disciolto in 500 μl di una miscela MeOH:H

26:

2O 5.5:4.5 e nuovamente centrifugato. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con MeOH:H2

O 5.5:4.5, utilizzando le seguenti condizioni:

• Eluente = MeOH:H2

• Iniettata = 100 μl

O (5.5:4.5)

Le 26 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela cloroformio–metanolo 98:2 e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in un’unica frazione (Fig. 3.11).

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La frazione 265 sottoposta a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si è presentata come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto è stata studiata ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati

all’identificazione del composto 8 come 8-metossi-idrangenolo o

scorzotomentosin (1 mg; tR

I dati chimico-fisici del composto 8 sono i seguenti: =13 min).

Composto 8: solido amorfo biancastro; ¹H- e ¹³C-NMR vedi tab. 2.5, capitolo 2.

ESI-MS m/z 269 [M−H]−.

Analisi della frazione R

C

La frazione 28 (316.8 mg) è stata sciolta in circa 4 ml di MeOH puro e centrifugata. Il sovranatante è stato portato a secco, pesato (41.6 mg) e disciolto in 500 μl di una miscela MeOH:H

28:

2O 4:1 e nuovamente centrifugato. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con MeOH:H2O 1:1, utilizzando le seguenti condizioni:

O (1:1)

Le 22 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela cloroformio–metanolo 95:5 e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in 6 frazioni principali (Fig. 3.12).

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La frazione 282 sottoposta a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si è presentata come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto è stata studiata ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione del composto 9 come 4α-idrossipinoresinolo o 9α-idrossipinoresinolo (3.4 mg; tR=10 min), precedentemente isolato anche dall’estratto RCM (RCM 16).

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Studio dell’estratto metanolico

L’estratto metanolico (73.71 g) è stato ripartito, per mezzo di un imbuto separatore, in una porzione n-butanolica (4.53 g), e in una acquosa (69.18 g), in modo da eliminare la porzione zuccherina che si trova disciolta in quest’ultima fase.

Il residuo butanolico (4.53 g), ottenuto dopo evaporazione completa del solvente a temperatura ambiente, è stato sciolto in circa 10 ml di metanolo e centrifugato. Il sovranatante è stato caricato su colonna Sephadex LH-20 (i.d. = 3 cm) eluendo con metanolo con un flusso di 0.8 ml/min. Le 126 frazioni raccolte, di circa 15 ml ciascuna, sono state sottoposte a TLC (Thin Layer Chromatography) su gel di silice 60 F254

Alcune frazioni prive di evidenti macchie cromatografiche sono state eliminate. , usando come eluenti BAW (n-butanolo–acido acetico– acqua, 60:15:25) e CMW (cloroformio–metanolo–acqua, 80:18:2), e identificate utilizzando il solfato di cerio come reattivo spray. Le 126 frazioni sono state successivamente riunite in 20 frazioni principali (1-20) in base alle somiglianze cromatografiche (Fig. 3.13).

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Analisi della frazione R

BuOH

La frazione 10 (99.2 mg) è stata sciolta in circa 1 ml di una miscela MeOH:H

10:

2O 2:3 e centrifugata. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (2:3), utilizzando le seguenti condizioni: • Attenuazione = 16x • Eluente = MeOH:H2 • Iniettata = 100 μl O (2:3) • Numero di iniettate = 9

Le 39 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela BAW (n-butanolo–acido acetico–acqua, 60:15:25) e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in 5 frazioni principali (1- 5) (Fig. 3.14).

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Fig. 3.14 HPLC della frazione RBuOH 10

Le frazioni 102, 103 e 104 sottoposte a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati all’identificazione del composto 3 (frazione 102) come idrangenolo 4’-O-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D-glucopiranoside (10.5 mg; t_R= 26 min), del

composto 4 (frazione 104) come idrangenolo-4’-O- α-L-ramnopiranosil-(1→3)-β-D-glucopiranoside (17.8 mg; tR= 32 min), entrambi precedentemente isolati anche dall’estratto RCM (RCM 13+14), mentre la frazione 103 contiene il composto d (0.8 mg; tR= 30 min) ancora in fase di caratterizzazione.

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Analisi della frazione R

BuOH

La frazione 11 (136.6 mg) è stata sciolta in circa 1.4 ml una miscela MeOH:H

11:

2O 4:6 e centrifugata. Il sovranatante è stato sottoposto a cromatografia su colonna HPLC μ-Bondapak RP-18 eluendo con metanolo–acqua (2:3), utilizzando le seguenti condizioni:

O (2:3)

Le 39 frazioni raccolte sono state sottoposte a TLC su lastra di silice usando come eluente una miscela BAW (n-butanolo–acido acetico–acqua, 60:15:25) e solfato di cerio come reattivo spray. Le frazioni, in base alle uguaglianze cromatografiche, sono state successivamente riunite in 23 frazioni principali (1- 23) (Fig. 3.15).

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Le frazioni 1116, 1117+18 e 1121 sottoposte a TLC, utilizzando solfato di cerio come reattivo spray, si sono presentate come un’unica macchia di colore brunastro e pertanto sono state studiate ulteriormente; attraverso analisi spettroscopiche si è arrivati rispettivamente all’identificazione del composto 2 come hydrangenolo-8-O-β-D-glucopiranoside (1.9 mg; tR= 17 min), del composto 3 come idrangenolo 4’-O-β-D-apiofuranosil-(1→6)-β-D

-glucopiranoside (8.7 mg; tR= 26 min), entrambi precedentemente isolati dalla frazione RCM13+14, e del composto 10 come idrangenolo 4’-O-β-D -glucopiranoside (3.5 mg; tR= 30 min).

ESI-MS m/z 441 [M+Na]+, 423 [M+Na−18]+, 279 [M+Na−162]+ , 417 [M−H]−, 255 [M−H−162]− .