3. Materiali e Metodi

3. Materiali e Metodi

3.1 Colture cellulari

Sono state utilizzate linee cellulari Me665/2/60 (clone 60) e Me665/2/21 (clone 21), messe a disposizione dal Dr. Parmiani dell’Istituto Nazionale Tumori di Milano e derivate da una stessa metastasi subcutanea di melanoma umano, caratterizzate dal possedere un’attività di GGT di 26 mU/mg e 0,2 mU/mg di proteina, rispettivamente. Si tratta in entrambi i casi di cellule che crescono adese alla plastica, molto simili tra loro, ma diversificate per alcuni aspetti sia morfologici che funzionali. Il clone 60 si caratterizza per l’alta invasività, il basso contenuto in melanina, una minor differenziazione e l’insensibilità all’induzione della differenziazione. Al contrario il clone 21 mostra bassa invasività, alto contenuto in melanina, è più differenziato ed è sensibile all’induzione della differenziazione (Supino et al., 1992; Supino et al., 1994).

Sono state utilizzate inoltre:

-La linea cellulare U937 (Sigma-Aldrich S.r.l., Milano, Italia) derivante da cellule maligne dell’effusione pleurale di un maschio caucasico con linfoma istocitico diffuso. La modalità di crescita di questa linea cellulare è in sospensione;

-la linea cellulare HeLa (Sigma-Aldrich S.r.l., Milano, Italia) derivante da cellule epiteliali provenienti da carcinoma alla cervice;

-la linea cellulare Jurkat (messa a disposizione dal Dr.Antonelli, Università degli Studi di Pisa), derivante da leucemia linfatica umana a cellule T;

-la linea cellulare Kg1A (messa a disposizione dal Dr.Petrini Università degli Studi di Pisa), derivante da leucemia mieloide acuta umana.

Condizioni di coltura

I materiali utilizzati per le colture cellulari, se non diversamente indicato, sono stati forniti dalla ditta Sigma (USA) e dalla ditta Sarstedt (Germany).

I cloni Me665/2/60 e Me665/2/21 e le cellule U937 sono state coltivate nel mezzo di coltura RPMI 1640 integrato con L-glutammina (2 mM) e con siero bovino fetale inattivato al calore (FCSI) alla concentrazione del 5 % (v/v).

Le HeLa sono state coltivate nel mezzo di coltura DMEM addizionato con L-glutammina 2mM e integrati con siero fetale bovino al 5% (v/v).

Le cellule Jurkat sono state coltivate in sospensione in terreno RPMI 1640 addizionato con L-glutammina 2mM e integrato con siero fetale bovino al 10%. Le cellule Kg1A sono state coltivate in sospensione in terreno DMEM addizionato con L-glutammina 2mM e integrato con siero fetale bovino al 10%.

Tutte le linee erano mantenute in coltura a 37°C in atmosfera satura di umidità e con CO2 al 5%. L'inattivazione del siero veniva effettuata mediante incubazione a 56°C per 30 minuti.

Le linee cellulari in adesione venivano mantenute in coltura fino all'80% della confluenza, quindi distaccate mediante incubazione per 2-3 minuti in una soluzione contenente tripsina 5 g/l ed EDTA sodico 0,2 g/l e diluite alla densità opportuna. Il numero delle cellule veniva determinato con l'ausilio di un contaglobuli; le cellule, distaccate per tripsinizzazione e non, venivano risospese in un opportuno volume di terreno completo, quindi un'aliquota della sospensione cellulare era diluita 1:10 in tampone fosfato di Dulbecco (PBS) ed utilizzata per il conteggio. Ciascun conteggio era ripetuto tre volte e ne veniva calcolata la media.

3.2 Ruolo della GGT nell’uptake cellulare dell’acido ascorbico

3.2.1 Esperimenti di ossidazione dell’AA mediata dall’attività di GGT

Ossidazione dell’AA in sistemi acellulari contenenti GGT purificata

Le incubazioni venivano effettuate in TRIS-HCl 0,1 M, pH 7,4 a 37°C per 60 minuti, in un volume finale di 2 ml. Le miscele di incubazione contenevano AA (0,5 mM), GSH (0,5 mM) e l’accettore della reazione di transpeptidazione glicil-glicina (Gly-Gly; 20 mM) (Huseby and Strömme, 1974). L’ossidazione non enzimatica dell’AA veniva fatta partire aggiungendo alla miscela di incubazione ADP-FeCl3 (concentrazione finale 200 µM e 20 µM, rispettivamente), mentre l’ossidazione enzimatica veniva fatta partire aggiungendo ADP-FeCl3 e GGT purificata (100 mU/ml). Tutti i componenti erano preparati in TRIS-HCl 0,1 M, pH 7,4 immediatamente prima delle incubazioni; l’ADP ed il FeCl3-6H2O (Fluka) erano preparati separatamente in acqua bidistillata, quindi erano mescolati e lasciati ad

incubare per almeno 15 minuti a temperatura ambiente prima dell’aggiunta nelle miscele di incubazione. Ai tempi prestabiliti aliquote di 50 µl delle miscele di incubazione erano acidificate con acido tricloroacetico (TCA) 5% (v/v) o con acido 5-sulfosalicilico (SSA) 1% (p/v) (concentrazioni finali) e conservate a –20°C fino alla determinazione del contenuto in AA o in GSH, rispettivamente.

In alcuni esperimenti gli enzimi CuZn/SOD eritrocitaria (500 U/ml), catalasi senza timolo (400 U/ml), l’antiossidante mannitolo (10 mM) ed il chelante del ferro deferossamina mesilato (3 mM) sono stati aggiunti alle miscele di incubazione. L’inibizione dell’attività di GGT veniva ottenuta aggiungendo alle miscele di incubazione il complesso L-serina/acido borico (concentrazione finale 20/20 mM, rispettivamente), un inibitore competitivo della GGT. L-serina ed acido borico venivano preparati separatamente in TRIS-HCl 0,1 M, pH 7,4, quindi venivano mescolati ed il pH era aggiustato a 7,4 con l’aggiunta di NaOH 1 M, prima dell’aggiunta nelle miscele di incubazione.

In alcuni esperimenti la GGT è stata sostituita nelle miscele di incubazione con la cisteinil-glicina (Cys-Gly; 0,5 mM), il prodotto derivato dall’idrolisi del GSH catalizzata dalla GGT.

Altri dettagli sperimentali sono forniti nelle legende delle figure.

Preparazione di olo-transferrina e di ferritina

In alcuni esperimenti, l’ossidazione dell’AA mediata dalla GGT è stata studiata in presenza di olo-transferrina e di ferritina. Soluzioni di olo-transferrina umana e di ferritina equina venivano preparate direttamente in TRIS-HCl 0,1 M, pH 7,4, quindi

erano purificate mediante tre passaggi attraverso una colonna contenente una resina di Chelex-100 allo scopo di rimuovere il Fe3+ legato debolmente o in maniera aspecifica alle due proteine (Baldwin et al., 1984). La olo-transferrina o la ferritina erano quindi aggiunte alle miscele di incubazione alla concentrazione di 5 µM e 1 µM, rispettivamente.

Ossidazione dell’AA in sistemi cellulari

Le cellule di melanoma venivano seminate 48 ore prima del trattamento alla densità di 8x105 cellule/ml. Il giorno dell’esperimento, rimosso il terreno di coltura, i monostrati venivano lavati due volte con Hank’s buffer, pH 7,4 (HBSS), quindi venivano incubati per 120 minuti a 37°C, 5% CO2 in HBSS contenente AA (0,5 mM), GSH (0,5 mM), ADP-FeCl3 (concentrazione finale 200 µM e 20 µM, rispettivamente) in presenza o meno di Gly-Gly (20 mM). L’ossidazione non enzimatica dell’AA veniva fatta partire aggiungendo alla miscela di incubazione ADP-FeCl3, mentre l’ossidazione enzimatica veniva fatta partire aggiungendo ADP-FeCl3 e Gly-Gly. La Gly-Gly, utilizzata come accettore della reazione di transpeptidazione, era aggiunta per stimolare l’attività di GGT delle cellule. In alcuni esperimenti l’attività di GGT è stata inibita trattando le cellule con acivicina (AT125; 1 mM), un inibitore non competitivo della GGT, per 60 minuti a 37°C, 5% CO2, prima di aggiungere le miscele di incubazione.

Ai tempi prestabiliti aliquote di 50 µl delle miscele di incubazione erano acidificate con TCA 5% o con SSA 1% (concentrazioni finali) e conservate a –20°C fino alla determinazione del contenuto in AA o in GSH, rispettivamente. Alla fine del tempo

di incubazione, i monostrati cellulari venivano lavati per due volte con PBS ed erano quindi incubati in TCA 5% (v/v) per 20 minuti a 4°C. Successivamente, recuperato l’estratto acido, le proteine venivano raccolte meccanicamente in NaOH 0,1 M: i campioni ottenuti erano quindi conservati a –20°C fino al momento dell’analisi del contenuto di AA e della concentrazione proteica, rispettivamente.

Altri dettagli sperimentali sono forniti nelle legende delle figure.

Meccanismi di trasporto dell’AA

Per valutare il coinvolgimento dei trasportatori Na-dipendenti dell’AA nella captazione dell’AA mediata dalla GGT, sono stati condotti esperimenti in tampone iposodico, come descritto da Welch et al., (1995). Le miscele di incubazione, contenenti AA (0,5 mM), GSH (0,5 mM) e ADP-FeCl3 (concentrazione finale 200 µM e 20 µM, rispettivamente) in presenza o meno Gly-Gly (20 mM), erano preparate in un tampone Hepes/fosfato 10 mM, pH 7,4, contenente NaCl 147 mM, KCl 5 mM, KH2PO4 1,9 mM, Na2HPO4 1,1 mM, MgSO4-7H2O 0,3 mM, MgCl2-6H2O 1 mM, CaCl2-2H2O 0,3 mM e glucosio 5,5 mM, come controllo. Per il tampone iposodico le miscele erano preparate nello stesso tampone Hepes/fosfato in cui, però, NaCl e Na2HPO4 erano sostituiti con colina cloruro e K2HPO4, rispettivamente.

Il coinvolgimento dei trasportatori GLUT nella captazione GGT-mediata dell’AA, è stata studiata in esprimenti condotti preparando le miscele di incubazione in HBSS contenente elevate concentrazioni di glucosio (5 g/l), oppure in presenza dell’inibitore non competitivo dei GLUT citocalasina B (20 µM).

In entrambi i casi le incubazioni sono state effettuate a 37°C, 5% CO2 ed i campioni sono stati raccolti come precedentemente descritto.

3.2.2 Determinazione HPLC delle concentrazioni di AA e di DHA

La determinazione delle concentrazioni di acido ascorbico ridotto e di acido ascorbico totale, veniva effettuata mediante HPLC secondo il metodo descritto da Rose e Bode (1995).

Preparazione dei campioni per la determinazione del contenuto in AA totale La riduzione dei campioni era effettuata incubando 45 µl di estratto acido in TCA 5%, appena scongelato, con 225 µl di K2HPO4 0,2 M, pH 9, 15 µl di EDTA 1 mM (concentrazione finale 50 µM) e 15 µl di DTT 10 mM (concentrazione finale 0,5 mM). Dopo aver agitato, la miscela era lasciata ad incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, al buio. Alla fine del tempo di incubazione 375 µl di H3PO4 100 mM venivano aggiunti alla miscela per riacidificare il pH ed il prodotto finale era subito utilizzato per l’analisi all’HPLC.

Cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC)

Le determinazioni venivano effettuate analizzando i campioni con un sistema per HPLC a fase inversa equipaggiato con una colonna C18 (Synergi; Phenomenex, USA) e con un detector elettrochimico (Coulochem III – ESA) collegato ad una cella analitica (Modello 5011 – ESA). I potenziali utilizzati erano di –0,35 Volt al primo

elettrodo e +0,2 Volt al secondo elettrodo. La fase mobile era un tampone H3PO4/KH2PO4 0,2 M, pH 3 con un flusso di 1 ml/min.

Il software che correda lo strumento restituisce i tracciati della separazione del campione e l'integrazione dell'area dei picchi presenti in tali tracciati. Prima di ogni serie di misurazioni, standard di AA a diverse concentrazioni, preparati in fase mobile, venivano analizzati in modo da poter allestire una retta di taratura che correlasse l'area del picco con la relativa concentrazione: venivano quindi determinati i parametri della regressione lineare e la concentrazione di ciascun campione veniva calcolata per interpolazione sulla base di tale curva. Infine, i valori ottenuti per gli estratti intracellulari venivano normalizzati per la concentrazione proteica del campione.

3.2.3 Transfezione transiente

Il clone di melanoma Me665/2/21 è stato transfettato transientemente con un vettore (pcDNA3 – Invitrogen) contenente il cDNA della GGT pancreatica umana (pcDNA3-GGT). Come mezzo per veicolare i vettori all'interno delle cellule sono stati utilizzati i liposomi (Lipotaxi – Stratagene).

Le cellule sono state seminate 24 ore prima della transfezione in piastre da 60 mm di diametro alla densità di 4x105 cellule per piastra. Prima della transfezione, per ciascuna piastra veniva allestito, in un tubo di polistirene, un campione in cui 7 µg di DNA plasmidico, 60 µl di liposomi e 900 µl di terreno DMEM privo di siero venivano incubati per 30 minuti a temperatura ambiente in modo tale da permettere la formazione di complessi liposomi-DNA (soluzione attivata). Nei controlli era

utilizzato il vettore senza il cDNA della GGT (pcDNA3). Allo scadere del tempo di incubazione, il terreno delle piastre veniva aspirato, il volume della soluzione attivata era portato a 2,5 ml con terreno privo di siero ed il tutto era aggiunto, rapidamente, goccia a goccia, sulle cellule. Dopo 5 ore di incubazione a 37°C in atmosfera satura di umidità, 5% di CO2, ciascuna piastra veniva addizionata con 2,5 ml di terreno DMEM contenente FCSI al 10 % (v/v) e posta in incubatore. Le cellule venivano quindi utilizzate dopo 48 ore di incubazione, dopo aver effettuato un cambio di terreno a 24 ore dalla transfezione.

3.2.4 Saggio della γ-glutamiltransferasi (GGT)

Le cellule venivano seminate 48 ore prima della determinazione alla densità di 3x105 cellule/ml, quindi venivano lavate due volte con PBS, raccolte in tampone di lisi TRIS-HCl 10 mM, pH 7,8 e conservate in ghiaccio fino al momento del saggio. L’attività della GGT veniva saggiata secondo il metodo ottimizzato da Huseby e Strömme (1974). Il saggio, condotto a 37°C in presenza di γ-glutamil-p-nitroanilide come substrato e di glicil-glicina (Gly-Gly) come accettore della reazione di transpeptidazione, si basa sulla reazione catalizzata dall’enzima:

γ-glutamil-p-nitroanilide + glicil-glicina → γ-glutamil-glicil-glicina + p-nitroanilina

L’attività dell’enzima veniva valutata determinando l’incremento di assorbanza a 405 nm dovuto alla formazione di p-nitroanilina. La miscela di reazione, contenente 1 ml di L-γ-glutamil-p-nitroanilide 4,6 mM, preparata in TRIS-HCl 100 mM pH 7,8 e

contenete MgCl2-6H2O 10 mM, 100 µl di glicil-glicina 575 mM, pH 7,5 e 50 µl di campione, veniva preparata in provetta, agitata e lasciata ad incubare in vivace agitazione a 37°C fino al momento della lettura allo spettrofotometro. Come riferimento (bianco) veniva usata una miscela di reazione completa nella quale il campione veniva aggiunto solo immediatamente prima della lettura. La media dei valori ottenuti, sottratta del bianco, veniva utilizzata per determinare l’attività della GGT, calcolata utilizzando il coefficiente di estinzione molare della p-nitroanilina 9,2x103 _M-1_cm-1_{. L’attività così ottenuta veniva infine normalizzata per la} concentrazione proteica del campione ed espressa come mU/mg di proteina.

3.2.5 Determinazione della concentrazione proteica

Il metodo utilizzato fa riferimento a quello di Bradford (1976), basato sull’osservazione che il massimo di assorbimento per una soluzione acida di Coomassie Brilliant Blue G-250 varia da 465 nm a 595 nm quando si ha il legame alle proteine (Reisner et al., 1975; Sedmark and Grossberg, 1977). Il reagente è commercializzato dalla Bio-Rad e contiene una soluzione del colorante in acido fosforico e metanolo: questo viene aggiunto direttamente nei campioni da analizzare diluendolo 5 volte.

In ogni determinazione veniva allestita una curva di calibrazione, in triplo, utilizzando standard di 2, 4, 8, 12, 16 μg di albumina di siero bovino. Il saggio era allestito secondo le indicazioni del fornitore. Allo scadere del tempo di incubazione, l’assorbanza dei campioni e degli standard veniva letta ad una lunghezza d’onda di 595 nm, quindi, al valore medio di ogni misurazione veniva sottratto quello relativo

alla media del bianco. La concentrazione del campione era quindi determinata interpolando la retta passante per i due valori di standard tra i quali era compreso il valore di assorbanza del campione.

3.3 La traslocazione nucleare della GSTO1 nell’Esofago di Barrett

3.3.1 Soggetti utilizzati per lo studio

I pazienti con diagnosi di esofago di Barrett sono stati scelti dal database dell’UO di Gastroenterologia (periodo 2004-2005).

Sono stati esaminati 46 pazienti, 33 uomini e 12 donne, con un’età media di 62,8 (+/-14). Di questi 44 presentavano Esofago di Barrett (EB), mentre 2 mostravano un adenocarcinoma conclamato. Tra i pazienti con EB, 22/44 non mostravano displasia, 7/44 mostravano diplasia di basso grado (DBG), 9/44 displasia di alto grado (DAG). Su 6/44 non é stato possibile fare diagnosi certa di displasia e pertanto sono stati classificati come "indeterminati per la displasia".

Tutti i pazienti sono stati scelti tra pazienti di prima diagnosi e sono stati esclusi tutti quei soggetti precedentemente sottoposti a terapia farmacologica.

Per questo studio sono state utilizzate le biopsie esofagee a suo tempo effettuate.

3.3.2 Produzione anticorpo anti-GSTO1

Clonaggio e Sequenziamento della GSTO1 umana

5µg di RNA totale umano sono stati sottoposti a retrotrascrizione utilizzando l’”Advantage RT-for-PCR kit” (Clontech) con oligodTprimer.

Il cDNA ottenuto è stato utilizzato come template per la reazione di PCR effettuata con l’Elongase Enzyme Mix (Invitrogen) con la seguente coppia di primers (Primm) hGDARfw1: 5’ TGCGCCACGATGTCCGGGGAGTCA 3’

hGDARrw1: 5’CAGACATAGCTTTATTGCTGACTCCTG 3’

corrispondente alla sequenza 5’ 3’ della GSTO1 umana (accession number U90313).

Dopo uno step di 94°C per 30 secondi per una denaturazione iniziale, la reazione di amplificazione di 35 cicli è stata effettuata con il seguente ciclo: 94°C per 30 secondi, 55°C per 30 secondi, e 68°C per 3 minuti e l’estensione finale a 68°C per 7 minuti. L’amplificato è stato controllato su gel d’agarosio al 1.2 % contenente bromuro di etidio.

Il prodotto dell’RT-PCR è stato inserito nel plasmide pCRII secondo le istruzioni del “TA cloning Kit” (Invitrogen).

I presunti cloni contenenti l’inserto intero sono stati controllati tramite PCR (Colony PCR). Gli amplificati sono stati controllati su gel d’agarosio e, tra tutti i cloni contenenti l’inserto intero,è stato scelto un singolo clone per ciascun diverso gene, che è stato sottoposto a sequenziamento tramite ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit e ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Espressione e purificazione della GSTO1 ricombinante

Sono state utilizzate tecniche di DNA ricombinante secondo protocolli convenzionali (Sambrook et al., 1989).

La GSTO1 ricombinante è stata espressa con una coda N-terminale di 6 isitidine. Per produrre la proteina di fusione batterica, il cDNA clonato viene sottoclonato nel vettore di espressione batterico pRSETB (Invitrogen). Il cDNA della GSTO1 contenente le estremità KpnI e BamHI è stata clonata nel vettore pRSETB contenente le stesse estremità. Il vettore risultante pRSEThGSTO1 è stato usato per trasformare il ceppo batterico E.coli JM109 (Invitrogen). Tali batteri sono stati piastrati e amplificati su LB agar medium con 50µg/mL di ampicillina e 5gr/ml di glucosio.

Ogni colonia cresciuta è stata moltiplicata fino a raggiungere un’assorbanza di 0,4-0,6 a 600nm; è stata successivamente indotta con isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG) 1mM, e lasciata crescere per 4 ore. La proteina espressa è stata purificata tramite cromatografia su una resina ad affinità (Ni-NTA , Quiagen) come successivamente descritto.

Dopo 4 ore dall’induzione, i batteri sono stati centrifugati a 1000g per 15minuti e il pellet è stato risospeso in tampone di lisi (10 mM K-phosphate buffer pH 7.2, 1mM EDTA, 50ug/ml di aprotinina e leupeptina and 1mg/ml of lisozima (Sigma Chemical Co) in ghiaccio per 30 minuti.

Il lisato è stato poi centrifugato a 10000xg per 30 min a 4 °C.

Alla frazione del sovranatante è stato aggiunto imidazolo a una concentrazione finale di 5mM e 1ml di resina Ni-NTA .

Questa miscela è stata incubata a 4°C in un agitatore rotante in modo da permettere il legame della proteina alla resina ad affinità (Ni-NTA, Quiagen).

La proteina è stata eluita con 50mM NaH2PO3, 300mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8.0.

Le frazioni sono state recuperate e l’imidazolo è stato rimosso usando colonnine PD10 (Pharmacia) pre-equilibrate con 10mM potassium phosphate buffer pH 7.2.

Preparazione antisiero policlonale

Per la produzione dell’antisiero, un coniglio New Zealand è stato immunizzato con 300µg di GSTO1 ricombinante purificata.

L’iniezione intradermica iniziale è stata di 200 µg di antigene nell’adiuvante completo di Freund (Sigma); la seconda iniezione di 40 µg nell’adiuvante incompleto è stata effettuata dopo 5 settimane. La terza e la quarta iniezione sono state effettuate per via intravenosa con rispettivamente 40 µg, 20 µg , a 10 e 14 settimane di distanza dalla prima iniezione.

3.3.3 Immunoistochimica

Le sezioni provenienti da biopsie sono state fissate in un tampone neutro al 10 % di formalina.

Dopo la fissazione i campioni sono stati sottoposti a disidratazione con trattamenti successivi con etanolo al 70 %, al 95 %, al 100 % e infine con un solvente (istolene o ultraclear).

Quindi i tessuti sono stati inclusi sottovuoto in paraffina ad una temperatura di fusione di 58 °C ; sezioni di 5-7 µm sono state successivamente montate su vetrini trattati con collagene e carichi positivamente e fatte asciugare per 48 h a 37 °C.

I vetrini sono stati lavati tre volte per 15 minuti con istolene, per allontanare la paraffina, quindi sono stati reidratati in seguito a trattamento in successione con etanolo al 100 %, al 95 %, al 70 % e infine con acqua milliQ.

Seguono due lavaggi con PBS e successivo trattamento con H2O2 al 3 % per 5 minuti, per rimuovere l’attività perossidasica endogena.

Dopo tre lavaggi con PBS, le sezioni sono state prebloccate con siero di capra, opportunamente diluito (al 10%) in PBS per 20 minuti, per saturare i siti di legame aspecifici.

Successivamente i preparati sono stati incubati per 24 ore a 4°C con il siero immune anti-GSTO1 umana ricombinante, prodotto nel nostro laboratorio, diluito in siero di capra all’1 % (1:1000).

Il giorno successivo, dopo 4 lavaggi in PBS, le sezioni sono state trattate con l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi (IgG anti-IgG di coniglio). Alcune sezioni sono state controcolorate con ematossilina per consentire una visione istologica più chiara. Tutti i vetrini sono stati montati con coprioggetti utilizzando balsamo del Canadà.

3.3.4 Estrazione dell’RNA

L’estrazione dell’RNA è stata effettuata utilizzando il “ NucleoSpin RNA II Kits” (CLONTECH Laboratories, Inc. USA). Tale Kit permette l’isolamento dell’RNA totale da campioni biologici. A tal fine dopo l’aggiunta del buffer di lisi, il campione è stato inserito in una colonna di propilene per centrifuga nella quale è contenuta una membrana di silice attivata sulla quale si adsorbe il materiale genetico. La

composizione del buffer di lisi permette l’immediata inattivazione delle Rnasi e crea le condizioni necessarie affinché l’RNA venga adsorbito sulla membrana di silice. La possibilità di contaminazione da parte del DNA, in grado anch’esso di legarsi a tale membrana, è evitata aggiungendo direttamente una soluzione di Dnasi durante la preparazione dei campioni. Dopo una serie di lavaggi, l’RNA purificato è stato infine eluito in condizioni di bassa forza ionica, con acqua “Rnasi free”.

La quantificazione dell’RNA è stata effettuata utilizzando un lettore di piastre ELISA, VICTOR ³ (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Finland).

La lettura è stata effettuata a 260 nm. La curva di taratura è stata allestita diluendo un campione di RNA a concentrazione nota.

L’integrità dell’RNA è stata verificata tramite elettroforesi su gel di agarosio all’1,2% contenente lo 0,8% di bromuro di etidio, con un voltaggio costante di 100 V utilizzando TBE (Tris 0,178M, ac.Borico 0,178M, EDTA 4mM, pH 8,3) come tampone di corsa. Dopo la corsa il gel è stato visualizzato su transilluminatore UV Chemi Doc (Biorad Laboratories, Inc. USA).

3.3.5 Reverse Trascriptase – Polymerase Chain reaction (RT-PCR)

L’RT-PCR è stata effettuata utilizzando il “ TITANIUM™ One –Step RT-PCR Kit” (CLONTECH Laboratoties, Inc. USA).

¾ Master Mix :

- 5µl di One-Step Buffer 10X (400 mM Tricina, 200 mM Kcl, 30 mM MgCl2, 37,5µg/ml BSA)

- 1µl di dNTP Mix 50X (10 mM di dATP, dCTP, dGTP e dTTP; con concentrazione finale per ciascuno uguale a 0,2 mM),

- 0,5µl di Recombinant Rnase Inhibitor (40 units/µl, clonato da placenta umana), - 25 µl di Thermostabilizing Reagent,

- 10µl di GC-Melt,

- 1 µl di Oligo(dt) primer (20µM; dt [18]),

- 1µl di RT-TITANIUM Taq Enzyme Mix 50X (MMLV-reverse transcriptase, TITANIUM Taq DNA polymerase, e TaqStart Antibody)

¾ 40µM di primers ¾ 0,5 µg di RNA estratto

¾ il volume totale è stato portato a 50µl con acqua Rnasi free.

Le sequenze dei primer sono state scelte in porzioni di cDNA non omologhe tra la GSTO1 e la GSTO2 al fine di permettere l’amplificazione selettiva delle due forme.: hGSTO1:

FWD 5’ GAAGCTTTATTAGAAGCCAAAATAAAGA 3’ REV 5’ ATATCAGACATAGCTTTATTGCTGACT 3’

L’amplificato ottenuto è di 381 pb. hGSTO2:

FWD 5’ CCAGAGCCCAGTAGTTCAAAAATTAA 3’ REV 5’ AGAAAAGAAAGAGAGACGGATTGGTT 3’ L’amplificato ottenuto è di 973 pb.

La gliceraldeide tre fosfato deidrogenasi (GAPDH) è stata scelta come standard interno di amplificazione.

GAPDH

FWD 5’ CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT 3’ REV 5’ AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC 3’ L’amplificato ottenuto è di 405 pb.

La fase di retrotrascrizione è stata effettuata a 54ºC per 1 ora; al fine di distruggere qualsiasi attività DNAsica, la miscela di reazione è stata quindi incubata a 94ºC per 5 min.

La reazione di amplificazione è stata effettuata con il seguente ciclo: 94ºC/30”+59ºC/30”+68ºC/1min

ripetuto per 31 volte.

Al fine di verificare che la reazione di amplificazione fosse in fase esponenziale sia per la GSTO1 che per la GSTO2 e per il controllo interno (GAPDH), sono state prelevate dalla miscela di reazione aliquote di 5 µl a 28, 31, 34, 40 cicli. L’aliquota

prelevata a 31 cicli è risultata la migliore in quanto l’amplificazione era ottimale ed ancora in fase esponenziale per tutti e tre gli amplificati. Al termine dei cicli di amplificazione la miscela è stata incubata a 68°C per 2 minuti.

Per visualizzare i prodotti dell’amplificazione si è proceduto con una corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1,2% contenente Bromuro di Etidio allo 0,8%. Il gel è stato visualizzato dopo la corsa su transilluminatore UV Chemi Doc (Biorad Laboratories,Inc.USA).

3.3.6 Preparazione del citosol di testicolo e di utero

Un frammento di testicolo e uno di utero umano sono stati omogenizzati al 33% (p/v) in tampone K-fosfato 100 mM, pH 7,2 a 4°C utilizzando un omogeneizzatore Potter-Elvehjen. L’omogenato è stato centrifugato a 20000g per 15 min e il sopranatante è stato ulteriormente centrifugato a 100000g per 60 min; il sopranatante è stato quindi utilizzato come frazione citosolica. Si è proceduto successivamente alla

determinazione della concentrazione proteica (vedi paragrafo 3.2.5).

3.3.7 Elettroforesi SDS-PAGE

La SDS/PAGE è stata effettuata su cella per elettroforesi "Mini-Protean III” (Biorad Laboratories, U.S.A.) secondo il metodo di Laemmli (1970) usando poliacrilamide al 5% per lo "stacking gel" e al 12% per il "separating gel".

I campioni sono stati denaturati a 100°C per 10 min in SDS allo 0,1% e 2mercaptoetanolo al 5% prima della deposizione nei pozzetti.

SEPARATING GEL 12% (quantità per due gel di 1,5 mm di spessore): ™ Acqua distillata 6,70 ml ™ Tris HCl 1,5 M pH 8,8 5,00 ml ™ SDS 10% (W/V) 100 µl ™ Acrilammide bis (30%) 8,00 ml ™ Ammonio persolfato 10% 50 µl ™ TEMED 10 µl

STACKING GEL 4% (quantità per due gel):

™ Acqua distillata 3,05 ml ™ Tris HCL 0,5M pH 6,8 1,25 ml ™ SDS 10% (W/V) 50 µl ™ Acrilamide/Bis acrilammide (30%) 0,65 ml ™ Ammonio persolfato 10% 50 µl ™ TEMED 10 µl

Come standard di peso molecolare è stata utilizzata una miscela di proteine note (Biorad Laboratories, Inc. USA), inoltre come controllo positivo in ogni corsa è stata

utilizzata la proteina GSTO1 ricombinante precedentemente purificata in questo laboratorio.

L’elettroforesi è stata eseguita a voltaggio costante (150 V) per circa 90 min a temperatura ambiente utilizzando il tampone di corsa costituito da: Tris HCl 25 mM pH di 8,3, glicina 192 mM, SDS 0,1%.

Immunoblotting

Trasferimento e incubazione con l’anticorpo primario e secondario

Il gel al termine dell’elettroforesi è stato equilibrato nel tampone di trasferimento (Trizma base 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM e metanolo 20% v/v) per 15 min. Il trasferimento delle proteine su membrana di nitrocellulosa (0.45 μm) è stato effettuato con il sistema BioRad tramite "Mini Trans-Blot" (Biorad Laboratories, Inc. USA), con amperaggio costante (200 mA) per 150 min in vasca raffreddata. Quindi è stata effettuata la colorazione della membrana con rosso Ponceau (rosso Ponceau 0,2% w/v in acido tricloro acetico al 3% v/v) per 5 min a temperatura ambiente in modo da verificare l’avvenuto trasferimento delle proteine. Dopo la decolorazione, effettuata con 2 lavaggi di 5 min in H2O, la membrana è stata incubata per 30minuti a temperatura ambiente su piastra oscillante con latte scremato in polvere al 5% in PBS-T 0,01% (Tween 0,01% in PBS) per saturare i siti attivi residui della nitrocellulosa. Successivamente, la membrana di nitrocellulosa é stata incubata overnight a 4C° con una miscela di anticorpi primari di coniglio costituita da siero anti-GSTO1 (precedentemente prodotto nel nostro laboratorio,vedi sezione 3.3.2) diluito 1:4000 e IgG anti-βactina diluite 1:8000 (Santa Cruz Biotechnology Inc.,

California) in latte al 2,5% in PBS-T 0,01%. La βactina (43KDa) è stata utilizzata come standard interno essendo una proteina costitutivamente espressa dalle cellule. Il giorno seguente sono stai effettuati due lavaggi di 10 minuti ciascuno in PBS-T 0,01% ed è stato aggiunto l’anticorpo secondario coniugato con la perossidasi (Sigma-Aldrich S.r.l., Milano, Italia), diluito 1:10000 in latte scremato in polvere al 2,5% in PBS-T 0,01%. Tale anticorpo è stato lasciato ad incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Al termine dell’incubazione con il secondario, sono stati eseguiti 3 lavaggi con PBS-T 0,01% Tutte le incubazioni sono state eseguite in agitazione leggera.

Rivelazione della reazione antigene anticorpo tramite chemioluminescenza

La tecnica di rivelazione della reazione tra antigene e anticorpo si basa sull’ossidazione del luminolo in presenza di perossidasi e di perossido di idrogeno; tale reazione porta alla generazione di luce. Per questo tipo di rivelazione è stato utilizzato il kit Roche (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA). Dopo aver drenato l’eccesso di tampone di lavaggio, la membrana è stata incubata al buio per 1 min con la soluzione di substrato. Allo scadere del tempo è stato rimosso l’eccesso di substrato dalla membrana e l’emissione luminosa è stata registrata tramite l'apparecchio per acquisizione di immagini Chemi Doc (Biorad Laboratories, Inc. USA).

Le bande ottenute sono state sottoposte ad analisi densitometrica (DO/mm2) mediante il software “Quantity One” Chemi Doc (Biorad Laboratories, Inc. USA).

3.3.8 Analisi Statistica

Le variabili corrispondenti alla prevalente localizzazione cellulare della colorazione (nucleare, citoplasmatica o diffusa) sono state analizzate tramite il test del χ2 ( GraphPad Prizm Softwar).

3.4 Meccanismi d’espressione delle GSTO in linee cellulari umane

3.4.1 Trattamenti sperimentali

Trattamento con TNF- α

Il trattamento con il TNF-α è stato effettuato sul clone 21. Le cellule venivano seminate alla opportuna densità 24 ore prima del trattamento.

Come riportato nei “Risultati”, dopo aver effettuato dei test preliminari, le condizioni standard adottate sono state: semina di 4,8x103 cellule/cm2 e trattamento con TNF-α alla concentrazione di 10 ng/ml. Nei controlli il TNF-α è stato sostituito con un ugual volume di PBS sterile. In alcuni esperimenti è stato effettuato un pretrattamento con partenolide 5μM per 2 ore, seguito dal trattamento con TNF-α per 1 ora alla concentrazione di 10 ng/ml.

Effetto dell’ aumento della densità cellulare

Le cellule di melanoma clone 21 e clone 60, le U937, le Kg1A e le Jurkat sono state seminate ad una densità pari a 4,8x103 cellule/cm2, incubate in atmosfera umidificata a 37°C e al 5% di CO2 , e raccolte a 24, 48, 72 e 96 ore dalla semina.

In alcuni esperimenti le cellule sono state seminate a due diverse densità 4,8x103 e 38,4x103 cellule/cm2 e raccolte dopo 24 ore.

Trattamento con CoCl2

Le cellule di melanoma clone 21 sono state seminate ad una densità “bassa”, pari a circa 4,8x103 cellule/cm2 24 ore prima del trattamento con CoCl2 alla concentrazione di 100 µM, 200µM e 400µM per 24h. Nei controlli il CoCl2 è stato sostituito con un volume corrispondente di DMSO.

Valutazione di un possibile fattore diffusibile in piastre da co-coltura

Le cellule del clone di melanoma Me665/2/21 sono state seminate in piastre da co-colture (Corning – USA) in due diverse densità. All’interno delle piastre sono presenti degli inserti contenenti membrane di policarbonato, con pori delle dimensioni di 0,4 µm, sulle quali è possibile coltivare cellule a stretto contatto con altre seminate sul fondo delle piastra. In particolare sul fondo della piastra sono state seminate cellule ad una “bassa” densità pari a 4,8 103cellule/cm2 , mentre sulla membrana sono state seminate cellule ad “alta” densità pari a 38,4x103 cellule/cm2 . L’incubazione è stata protratta per 24 ore a 37°C, 5% CO2.

Trattamento con Superossido- Dismutasi (SOD)

Le cellule di melanoma clone 21 sono state seminate ad una densità “alta”, pari a circa 38,4x103 _cellule/cm2 _{24 ore prima del trattamento con SOD alla} concentrazione di 0,3µM per 24 ore. Nei controlli la SODè stata sostituita con un volume corrispondente di PBS.

3.4.2 Preparazione degli estratti cellulari per Immunoblotting

Al termine di ciascun trattamento i monostrati di clone 21,clone 60 e HeLa sono stati lavati 2 volte con PBS, e raccolti in tampone di lisi (Tris HCL 10 mM pH7,8 e Triton X-100 1% v/v) e sottoposti a sonicazione.

Per le cellule U937, Jurkat e Kg1A, terminato il periodo di incubazione, la sospensione cellulare è stata centrifugata a 1000 g per 5 min, il terreno è stato eliminato e il pellet cellulare è stato lavato 2 volte con PBS. Infine le cellule sono state risospese in tampone di lisi (Tris HCL 10 mM ph7,8 e Triton X-100 1% v/v) e sottoposte a sonicazione. Successivamente si è proceduto alla determinazione della concentrazione proteica (vedi paragrafo 3.2.5) e alla elettroforesi SDS e Immunoblotting (vedi paragrafo 3.3.6).

3.4.3 Preparazione degli estratti cellulari per estrazione dell’RNA

Al termine di ciascun trattamento i monostrati di clone 21,clone 60 e HeLa sono stati lavati 2 volte con PBS, e raccolti in 1ml di PBS sterile.

Per le cellule U937, Jurkat e Kg1A, terminato il periodo di incubazione, la sospensione cellulare è stata centrifugata a 1000 g per 5 min, il terreno è stato eliminato e il pellet cellulare è stato lavato 2 volte con PBS. Infine le cellule sono state risospese in 1ml di PBS sterile.

A questo punto si procede all’estrazione dell’RNA e successivamente all’RT-PCR (vedi paragrafo 3.3.3 e 3.3.4).

3.4.4 Preparazione degli estratti nucleari per EMSA(Electroforesis Mobility Shift Assay)

La preparazione degli estratti nucleari (nucleosol) è stata eseguita essenzialmente secondo il protocollo di Andrews and Faller (Andrews and Faller, 1991), come di seguito riportato.

L’intero protocollo è stato effettuato a 4°C. Alla fine dei trattamenti le cellule sono state lavate con PBS, quindi raschiate e recuperate con 1 ml di PBS. I campioni sono stati centrifugati 2 min a 1000 g, risospesi in 500 μl di soluzione di lavaggio (HEPES 10 mM pH 7,9, MgCl2 2 mM e EDTA 200 μM) e quindi centrifugati per 2 min a 1000 g.

I pellet sono stati risospesi in 300 μl di tampone B (HEPES 10 mM pH 7,9, KCl 10 mM, MgCl2 2 mM e EDTA 200 μM, TRITON X-100 1%, Leupeptina 4μ g/ml e Aprotinina 1 μg/ml). I campioni sono stati lasciati per 30 min in ghiaccio e centrifugati successivamente per 5 min a 5000 g. I pellet sono stati lavati per 2 volte con 500 μl di soluzione di lavaggio e centrifugati per 2 min a 1000 g. E’ stato quindi pesato il pellet di ciascun campione e sono stati aggiunti 2 volumi di tampone di estrazione (HEPES 10 mM pH 7,9, NaCl 600 mM, MgCl2 2 mM e EDTA 200 μM, Glicerolo al 25%, Leupeptina 4μ g/ml e Aprotinina 1 μg/ml) che serve a lisare la membrana nucleare. I campioni sono stati incubati in agitazione a 4°C per 20-30

min, al termine dei quali sono stati centrifugati a 20000 g per 30 min. Il sovranatante costituisce il nucleosol, che viene utilizzato per il test dell’EMSA. Si procede successivamente alla determinazione della concentrazione proteica (vedi paragrafo 3.2.5).

3.4.5 EMSA (Electroforesis Mobility Shift Assay)

Ibridazione della sonda

Per il test dell’EMSA è stata utilizzata una sonda biotinilata (Primm.srl, Milano, Italia) la cui sequenza viene riconosciuta in modo specifico dal fattore di trascrizione NFkB.

senso 5’ GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT 3’ antisenso 5’ AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3’

I filamenti senso ed antisenso sono stati sciolti in TE (Tris-HCl 10mM pH 0,8, EDTA1mM) sterile, diluiti in NaCl 10 mM ad una concentrazione di 100 ng/ml e messi ad incubare a 65°C per 5 min in un becker d’acqua calda da 200 ml. Al termine dei 5 min, il campione è stato lasciato a bagnomaria a raffreddare. La sonda così ottenuta è stata conservata a -20°C.

Il competitore, ovvero la sonda non biotinilata, è stato preparato con la stessa procedura, ma ad una concentrazione 50 volte superiore.

Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni non denaturanti

20 µg del sovranatante nucleare di ciascun campione sono stati aggiunti a 6μl di Binding Buffer 5X sterile (glicerolo al 20%, MgCl2 5mM, EDTA 2,5 mM, DTT 2,5 mM, NaCl 250 mM, Tris-HCl, pH 7,5 e poly(dI-dC) · poly(dI-dC) 0,25 mg/ml). A tale miscela di reazione è stato quindi aggiunto il probe (1μl), quando necessario è stata aggiunta acqua sterile per portare ad un volume finale di 30 μl. I campioni sono stati quindi incubati a 37°C per 30 min. Al termine di tale incubazione sono stati aggiunti 2µl di loading buffer 10X (Tris HCl 250 mM pH 7,5, blu di bromofenolo 0,2%, glicerolo 40%) e i campioni sono stati caricati su gel di poliacrilammide al 6%. Nei test che prevedevano la competizione con la sonda non biotinilata la miscela di reazione è stata preincubata a 37°C per 10 min con un eccesso di competitore (100 volte più concentrato della sonda biotinilata).

Il gel di poliacrilammide utilizzato è al 6%, ed è costituito da:

H2O distillata 24 ml Acrilammide bis (30%) 9 ml TBE 0,25 X (Tris 0,045M, Ac Borico 0,045M, EDTA 1mM) 11,4 ml Ammonio persolfato 10% 450 μl TEMED 150 μl

L’elettroforesi è stata eseguita a voltaggio costante ( 350 V) per 90 min circa ad una temperatura di 16°C utilizzando il TBE 0,25X come tampone di corsa.

Southern blot

Il trasferimento su membrana di nylon (Hybond N, Amersham Biosciences Europe GmbH, Milano Italia) a 200mA per 1 ora in TBE 0,25X è stato effettuato utilizzando il sistema semy-dry (Amersham Biosciences Europe GmbH, Milano Italia).

La membrana è stata quindi lavata con SSC 2X filtrata ( NaCl 0,3M e Na citrato 0,03 M ) per 5 min e poi lasciata asciugare all’aria.

La membrana è stata successivamente esposta ai raggi U.V. per 45 secondi su trans-illuminatore UV ChemiDoc (Biorad Laboratories, Inc. USA) al fine di fissare il DNA alla membrana stessa.

I siti di legame aspecifici sono stati bloccati incubando la membrana “overnight” a temperatura ambiente con 50 ml di una soluzione composta da: Dendhart’s 10X (BSA 0,25%, Ficoll 400 0,25%, polivinilpirolidone 0,25%), SSC 6X, SDS 0,1% e H2O distillata per portare a volume (Dominici et al., 2003).

Rivelazione della sequenza biotinilata tramite chemioluminescenza

Per questo tipo di rivelazione è stato utilizzato il “Phototope – Star Detection kit” (New England BioLabs,Inc. USA)

Questa tecnica di rivelazione si basa sul legame della streptavidina alla sequenza biotinilata della sonda. Successivamente si aggiunge la fosfatasi alcalina biotinilata che, legandosi alla streptavidina, porta alla formazione di un coniugato tra la fosfatasi alcalina e il DNA fissato alla membrana. Infine si aggiunge il reagente CDP – Star™ (fenilfosfato substituted 1,2 dioxetane), a cui viene rimosso un fosfato

tramite la fosfatasi alcalina con produzione di un intermedio moderatamente stabile che decade con emissione di luce alla lunghezza d’onda di a 461 nm.

Il protocollo prevede i seguenti passaggi:

- nel primo step sono stati aggiunti 0,1 ml per cm² di membrana di Blocking Solution (5% SDS in 125mM NaCl, 25mM di fosfato sodico, pH 7,2) per 5 minuti in agitazione.

- in seguito è stata aggiunta la streptavidina diluita 1:1000 nella Blocking Solution (concentrazione finale di 1 μg/ml) utilizzandone 0,05 ml per cm² di membrana per 5 minuti in agitazione.

- sono stati quindi eseguiti 2 lavaggi usando 0,5 ml per cm² di membrana di Wash Solution I ( 0,5% SDS in 12,5 mM NaCl, 2,5 mM di fosfato sodico, pH 7,2).

- al termine dei lavaggi è stata aggiunta la fosfatasi alcalina diluita 1:1000 nella Blocking Solution (concentrazione finale di 0,5 μg/ml) utilizzandone 0,05 ml per cm² di membrana per 5 minuti, seguita da un lavaggio con 0,5 ml per cm² di membrana di Wash Solution I e 2 lavaggi con 0,5 ml per cm² di membrana di Wash Solution II (10 mM Tris-Hcl,10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, pH 9,5).

- la rivelazione delle bande è stata effettuata aggiungendo il reagente CDP-Star diluito 1:100.

Le acquisizioni delle immagini sono state effettuate tramite Chemi Doc (Biorad Laboratories, Inc. USA).

3.4.6 Preparazione degli estratti cellulari per analisi FACS

La procedura di allestimento dei campioni da sottoporre a tale analisi prevede una fase di fissaggio in etanolo al 70% freddo di circa 106 cellule.

La rivelazione prevede l’uso di una soluzione di Ioduro Propidio (50μg/ml) e RNasi (10μg/ml).

Successivamente gli estratti cellulari vengono incubate a 37°C 30min.

L’indagine tramite FACS é stata poi effettuata presso il Centro Emotrasfusionale dell’AOUP.