X100 Fig.3 Linfoma B della Zona Marginale, tipo umano

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106 LEGENDA FOTO LAVORO N°2

Fig.1 Linfoma B della Zona Marginale. Linfonodo. Ematossilina eosina. X4 Fig.2 Linfoma B della Zona Marginale con cellule medie macronucleolate.

Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.3 Linfoma B della Zona Marginale, tipo umano. Linfonodo. Ematossilina eosina. X4

Fig.4 Linfoma B della Zona Marginale, tipo umano. Linfonodo. CD79a. X4 Fig.5 Linfoma B della Zona Marginale, tipo umano. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.6 Linfoma B della Zona Marginale, tipo monocitoide. Linfonodo.

Ematossilina eosina. X100

Fig.7 Linfoma B follicolare. Linfonodo. Ematossilina eosina. X4 Fig.8 Linfoma B follicolare. Linfonodo. CD79a. X4

Fig.9 Linfoma B follicolare. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.10 Linfoma B centroblastico monomorfo. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.11 Linfoma B centroblastico polimorfo. Linfonodo. Ematossilina eosina.

X100

Fig.12 Linfoma B immunoblastico. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100 Fig.13 Linfoma B da massa mediastinica. Ematossilina eosina. X40

Fig.14 Linfoma B da massa mediastinica. Ematossilina eosina. X100

Fig.15 Linfoma B da massa mediastinica. Citologia. May Grünwald Giemsa.

X100

Fig.16 Linfoma B tipo Burkitt. Linfonodo. Ki-67. X40

Fig.17 Linfoma B tipo Burkitt. Linfonodo. Ematossilina eosina. X4 Fig.18 Linfoma B tipo Burkitt. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100 Fig.19 Linfoma B plasmocitoide. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

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107 Fig.20 Linfoma B a piccole cellule trasformato. Linfonodo. Ematossilina eosina. X4

Fig.21 Linfoma B a piccole cellule trasformato. Linfonodo. Ematossilina eosina. X4

Fig.24 Linfoma B a piccole cellule trasformato. Linfonodo. Ki-67. X40

Fig.25 Linfoma T a piccole cellule chiare. Linfonodo. Ematossilina eosina.

X4

Fig.26 Linfoma T a piccole cellule chiare. Linfonodo. CD3. X4

Fig.27 Linfoma T a piccole cellule chiare. Linfonodo. Ematossilina eosina.

X100

Fig.28 Linfoma T prolinfocitico. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100 Fig.29 Linfoma T immunoblastico. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100 Fig.30 Linfoma T immunoblastico. Cute. Ematossilina eosina. X100 Fig.31 Linfoma T plasmocitoide. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100 Fig.32 Linfoma T plasmocitoide. Linfonodo. Giemsa. X100

Fig.33 Linfoma T pleomorfo a piccole cellule. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.34 Linfoma T plasmocitoide. Linfonodo. Citologia. May Grünwald Giemsa. X100

Fig.35 Linfoma T pleomorfo misto. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100 Fig.36 Linfoma T pleomorfo a grandi cellule. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.37 Linfoma T linfoblastico. Linfonodo. Ematossilina eosina. X100

Fig.38 Linfoma T linfoblastico. Linfonodo. Citologia. May Grünwald Giemsa. X100

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108 Fig.39 Linfoma T a grandi linfociti granulati. Massa intestinale. Ematossilina eosina. X100

Fig.40 Linfoma T a grandi linfociti granulati. Massa intestinale. Citologia.

May Grünwald Giemsa. X100

Fig.41 Linfoma T cutaneo, Micosi Fungoide. Cute. Ematossilina eosina.

X100

Fig.42 Linfoma T cutaneo, tipo monocitoide. Cute. Ematossilina eosina.

X100

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116 LAVORO N°3

PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF MORPHOLOGICAL SUBTYPES IN CANINE MALIGNANT LYMPHOMAS DURING CHEMOTHERAPY

(3,7,9,10,24,26,34,35,37,40,42,53,54,56,59,60,61,66,69,73,76,82,83,84,85,87,88,94,95,96,97,103,105,107,11 6,118,120,121,124,125,126,127,128,133,135,141).

SIGNIFICATO PROGNOSTICO DEI SOTTOTIPI MORFOLOGICI DI LINFOMA MALIGNO CANINO DURANTE LA CHEMIOTERAPIA

Ponce F., Magnol JP., Ledieu D., Marchal T., Turinelli V., Chalvet-Monfray C. and Fournel-Fleury C.

The Veterinary Journal (2004) 167:158-166

Introduzione

I primi studi sui linfomi non-Hodgkin (NHL) dell’uomo hanno mostrato che la sopravvivenza dei pazienti varia da pochi mesi a diversi anni. Inoltre l’efficacia delle terapie varia in relazione all’aspetto istologico del linfoma.

Per questo motivo i clinici hanno incominciato a richiedere diagnosi istologiche sempre più precise e clinicamente rilevanti. In risposta a questo, le ultime classificazioni dei NHL umani, la nuova classificazione REAL (Revised European American classification of lymphoid neoplasms) e la classificazione WHO (World Health Organization classification of tumours) prendono in considerazione gli aspetti epidemiologici, clinici, morfologici, immunofenotipici e genetici, e definiscono precise entità con i loro particolari schemi terapeutici e prognostici. Quindi, attualmente, è disponibile un ampio spettro di opzioni terapeutiche per queste differenti malattie.

Le classificazioni morfologiche dei NHL del cane si sono basate in parallelo alle diverse classificazioni umane, ma la maggior parte degli studi più recenti,

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117 riguardanti le risposte ai diversi protocolli terapeutici e la valutazione della prognosi dei NHL, sono stati effettuati senza una precisa caratterizzazione morfologica e immunofenotipica della malattia, considerando il NHL del cane come un’unica entità. Anche se in alcuni di questi studi terapeutici è stato determinato l’immunofenotipo, i sottotipi cito-istologici non sono stati mai correlati al tempo di sopravvivenza. Soltanto tre studi hanno distinti vari sottotipi cito-istologici di NHL in B e in T. Il più recente ha preso in considerazione le differenti presentazioni cliniche contemporaneamente ai differenti sottotipi morfologici, seguendo le orme delle ultime classificazioni umane dei NHL; tuttavia non ha riportato alcun dato terapeutico utile.

Lo scopo del presente studio è stato quello di determinare la risposta di differenti sottotipi morfologici di NHL del cane a un protocollo terapeutico standard e di valutare se esiste una differenza tra i vari sottotipi morfologici che sia clinicamente giustificata nel cane (in accordo con le ultime classificazioni), così come lo è in medicina umana.

Selezione dei cani

Centoquaranta cani ammalati di NHL sono stati presentati al dipartimento di oncologia della Facoltà di Veterinaria di Lione tra il gennaio del 1999 e il gennaio del 2001. Solo i cani che non avevano subito alcun trattamento prima della diagnosi e che avevano ricevuto un follow-up completo durante la chemioterapia sono stati inclusi nello studio, per assicurare in tal modo, la presenza di una popolazione con un protocollo uniforme e rigoroso. Alla fine, solo 57 cani sono stati inclusi in questo studio retrospettivo.

Risultati

In questa serie di 57 casi sono stati inclusi 24 NHL a cellule B e 33 NHL a cellule T. In questo studio sono entrati 6 sottotipi morfologici di NHL canini, di cui 2 sottotipi a cellule B e 4 a cellule T (tabella VII e VIII).

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118 I principali dati epidemiologici, clinici e di sopravvivenza per ciascun sottotipo morfologico sono riassunti nelle tabelle IX e X.

All’interno dei NHL a cellule B, 20 casi erano centroblastici polimorfi e 4 casi erano tipo-Burkitt. Il sottotipo centroblastico polimorfo è stato associato ad una linfoadenopatia generalizzata che si sviluppava nell’arco di 1-4 settimane (media di 2 settimane) senza nessun altro segno clinico. I cani si trovavano nello stadio clinico IIIa-Va. Solo 2 cani hanno sviluppato sintomi gastrointestinali (vomito, diarrea) durante la fase di induzione e cioè dopo la somministrazione di ciclofosfamide, ma hanno risposto bene ai farmaci antiemetici e ai protettori intestinali (smectite, Smecta®, IPSEN, Paris, France). Solo un cane è divenuto neutropenico durante il ciclo di induzione ed ha avuto una riduzione del 10% della dose di ciclofosfamide.

Riguardo al sottotipo simil-Burkitt, tutti i cani presentavano, oltre ad una linfoadenopatia generalizzata, infiltrazione del tratto digerente, valutata attraverso l’esame citologico, e manifestavano segni clinici gravi quali anoressia, debolezza e diarrea e un cane presentava poliuria, polidipsia con ipercalcemia. I segni clinici si erano sviluppati in meno di una settimana. Tutti i cani si trovavano nello stadio clinico IVb o superiore; il prelievo del midollo osseo non è stato effettuato a causa del grave stato di salute. Solo un cane ha presentato una risposta parziale alla chemioterapia mentre gli altri 3 sono rimasti stabili. In tutti i casi la morte si è presentata con sintomi intestinali acuti (diarrea emorragica).

Tra i 33 NHL a cellule T, 5 erano a piccole cellule chiare, 10 erano pleomorfi misti, 8 erano plasmocitoidi inclassificabili di alto grado di malignità e 10 erano linfoblastici. Tra i 5 casi di linfoma a piccole cellule chiare, 3 cani presentavano linfoadenopatia generalizzata e superficiale e 2 cani presentavano linfoadenopatia localizzata (ai linfonodi mandibolari e/o ai linfonodi cervicali superficiali di un solo lato), sviluppatesi tutte nell’arco di

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119 diversi mesi, senza nessun altro segno clinico. I cani sono stati classificati nello stadio clinico IIa-IIIa.

Tutti i 10 casi del sottotipo pleomorfo misto presentavano una linfoadenopatia generalizzata con vari segni clinici, quali letargia, debolezza e perdita di peso, sviluppatesi in circa 15 giorni. I cani sono stati classificati nello stadio clinico IIIb-IVb.

I segni clinici degli 8 casi di NHL plasmocitoide, inclassificabile di alto grado di malignità si sono sviluppati in circa una settimana. I dati clinici più significativi sono stati linfoadenopatia, più spesso generalizzata (7/8 casi) e localizzata in un solo caso (linfonodi mediastinico e cervicale superficiale), presenza di una massa mediastinica in 4 casi, coinvolgimento midollare in 6 casi e ipercalcemia in 4 casi con presenza di un decorso clinico aggressivo e segni sistemici severi, quali marcata debolezza e anoressia. I cani sono stati classificati nello stadio clinico III-V e principalmente nel sottostadio b.

Nei 10 casi di NHL linfoblastico, i segni clinici si sono sviluppati nell’arco di tempo da 1 a 4 settimane. I principali dati clinici erano una costante linfoadenopatia, generalizzata (6 casi) o localizzata (4 casi con linfoadenopatia mandibolare, cervicale superficiale o mesenterica), una massa mediastinica in 8 casi, coinvolgimento midollare in 7 casi e ipercalcemia in 3 casi. Si sono osservati segni clinici gravi quali debolezza, anoressia, dimagrimento, dispnea e vomito. I cani sono stati classificati nello stadio clinico IVb-Vb.

Le discrepanze osservate tra la durata media di prima remissione (MFR) e il tempo di sopravvivenza totale (OST) dei diversi sottotipi, basati sulle curva di sopravvivenza (Fig. 1 e Fig. 2) erano significative (p<0,05).

Discussione

In medicina umana, l’obiettivo degli oncologi è stato quello di trovare una classificazione dei linfomi che potesse predire l’esito finale e la risposta alla

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120 chemioterapia. Per questo, nel gruppo dei NHL umani esistono numerose malattie distinte alle quali corrisponde una prognosi rilevante, una diversa risposta alla terapia e per le quali è a disposizione un unico trattamento appropriato. Il linfoma gastrico, ad esempio, risponde all’eradicazione dell’Helicobacter Pilory, il linfoma di Burkitt è trattato con alte dosi di protocolli terapeutici, mentre i linfomi indolenti che non manifestano fattori prognostici peggiorativi non sono trattati fino a quando non si trasformano in linfomi di grado elevato di malignità.

Al contrario, molte terapie del linfoma nel cane sono state testate negli ultimi 30 anni senza alcuna distinzione tra i vari sottotipi morfologici, eccetto in uno studio recente effettuato su 49 casi. Tuttavia in questo ultimo studio, l’assenza di tumori di basso grado di malignità, la bassa percentuale di linfomi a cellule T (13%), il raggruppamento indefinito dei linfomi tipo Burkitt e linfoblastici possono essere responsabili della mancanza di differenze prognostiche significative tra i vari sottotipi morfologici identificati.

Nel presente studio la media di sopravvivenza totale (OST) è stata di 14 mesi, risultato questo molto simile ai dati veterinari riportati precedentemente.

Riguardo all’immunofenotipo, i linfomi a cellule T, sia nell’uomo che nel cane, sono associati ad una prognosi peggiore. Nel nostro studio la comparazione tra i sottotipi di linfomi a cellule B e T più frequentemente diagnosticati (linfoma a cellule B centroblastico polimorfo e linfoma a cellule T pleomorfo misto) ha dimostrato che la durata media di prima remissione (MFR) e la sopravvivenza totale (OST) era significativamente più brevi per i linfomi a cellule T. Di conseguenza, il paragone tra questi sottotipi più frequenti ha confermato che il fenotipo T può essere un fattore prognostico associato ad un esito negativo.

Tuttavia, all’interno di ciascun gruppo di linfomi a cellule B e T, i vari sottotipi mostravano discrepanze significative e, in particolare, il sottotipo a

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121 cellule B tipo Burkitt presentava una OST molto breve e il sottotipo a piccole cellule chiare T presentava la MFR e la OST più lunghe.

Inoltre, i risultati di questo studio forniscono ulteriori dati riguardo alla presentazione clinica e alla sopravvivenza. Questi dati possono contribuire alla caratterizzazione di entità clinico morfologiche al fine di determinare una classificazione di linfoma canino, alla luce delle nuove classificazioni umane REAL e WHO.

Tra i linfomi a cellule B, l’aspetto del linfoma centroblastico polimorfo può essere paragonato con quello dei linfomi in generale, così come sono descritti in letteratura, proprio per il fatto che il linfoma centroblastico polimorfo rappresenta il sottotipo più frequente nella maggior parte degli studi. Nella nostra serie, tuttavia, sia la MFR che la OST erano più lunghe di quelle pubblicate precedentemente per tutti i tipi di NHL del cane. All’interno della categoria dei linfomi a cellule B, il linfoma canino tipo Burkitt è molto simile al suo equivalente umano, molto aggressivo, si presenta spesso con localizzazione nodale e/o extranodale, con frequente coinvolgimento intestinale e con il 70% dei pazienti che si presentano in uno stadio già avanzato della malattia (III e IV). In passato si avevano ricadute dopo meno di un anno dall’inizio della chemioterapia; attualmente questo tipo di linfoma è potenzialmente curabile con un programma chemioterapico a dosi elevate.

Questo fa riflettere sul fatto che, nel cane, è necessario cercare un nuovo schema terapeutico per questo sottotipo di linfoma che non risponde al protocollo VELCAP.

Tra i linfomi a cellule T, il sottotipo pleomorfo misto può essere paragonato al linfoma a cellule T periferico così come è definito dalle classificazioni REAL e WHO, ed era caratterizzato da ingrossamento linfonodale, da un decorso clinico spesso avanzato e da un esito più infausto rispetto al linfoma diffuso a grandi cellule B. Il linfoma linfoblastico a cellule T del cane presentava una durata di MFR e di OST leggermente inferiore rispetto a quella del sottotipo

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122 pleomorfo misto. Nell’uomo il linfoma linfoblastico è trattato generalmente come una malattia ad alto rischio e, prima dell’avvento degli attuali protocolli terapeutici, la prognosi era infausta, così come è, al momento, per il cane.

I linfomi plasmocitoidi di alto grado di malignità inclassificabili avevano una MFR e una OST più brevi rispetto agli altri sottotipi a cellule T. Al momento non esiste nell’uomo nessun equivalente chiaramente stabilito, sebbene questo mostri alcune similitudini con casi sporadici classificati nel grande gruppo dei linfomi a cellule T periferici non altrimenti specificabili e per i quali si utilizza un unico protocollo terapeutico. Questo sottotipo quindi, solleva la questione se si tratti di una particolare entità per la quale potrebbe essere necessario un tipo di trattamento specifico.

Infine il linfoma a piccole cellule chiare non presenta un equivalente ben definito tra i linfomi a piccole cellule T umani, ma può essere paragonato, per alcuni aspetti, al linfoma delle zone T umano che appartiene al gruppo dei linfomi periferici a cellule T non altrimenti specificabili. Il suo decorso clinico sembra molto simile a quello dei linfomi umani indolenti, per i quali la sopravvivenza è misurata in anni.

Ogni sottotipo sembra essere associato ad una particolare presentazione clinica al momento della diagnosi, come avviene in medicina umana. Lo stadio clinico potrebbe avere un ruolo importante nelle discrepanze tra i vari tempi di sopravvivenza, specialmente per il sottotipo a piccole cellule chiare, in cui una OST più lunga potrebbe essere correlata ad uno stadio clinico basso e per il sottotipo simil Burkitt in cui una OST più breve potrebbe essere correlata ad uno stadio clinico più avanzato. Tuttavia lo stadio clinico e la modalità di presentazione al momento della diagnosi potrebbero essere criteri aggiuntivi per distinguere i linfomi che presentano diverse velocità di risposta, come avviene in medicina umana.

Il nostro studio ha mostrato differenze prognostiche significative tra i vari sottotipi clinico-morfologici di NHL del cane. Queste osservazioni hanno

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123 suggerito la presenza di aspetti biologici e di manifestazioni cliniche implicite per queste entità linfomatose. Il raggruppamento di questi sottotipi di linfoma in un unica categoria di NHL, o in due categorie, (per esempio, linfomi a cellule B e T) farà perdere l’eterogeneicità della prognosi all’interno del gruppo e quindi verrà a mancare l’identificazioni di quei cani che potrebbero richiedere un trattamento diverso da quello standard.

Numerosi studi si sono impegnati nell’identificare fattori prognostici correlati alla risposta dei linfomi alla terapia e alla durata del tempo di remissione e di sopravvivenza. I fattori indagati includevano: età, sesso, razza, peso, presenza di ipercalcemia, stadio clinico e immunofenotipo. I risultati di questi studi sono stati variabili e contraddittori. Per questo motivo, il prossimo passo dovrebbe essere quello di studiare i diversi fattori prognostici e, in particolare, lo stadio clinico e la modalità di presentazione alla diagnosi, all’interno di ciascuna entità clinico-morfologica e non all’interno dell’intera gamma di NHL del cane, proprio come avviene in medicina umana.

Infine si dovrebbero provare differenti protocolli terapeutici e nuove molecole in accordo con le specifiche entità patologiche di NHL del cane.

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124 TABELLA VII

Criteri morfologici per i sottotipi di NHL canini, in accordo con le pubblicazioni di Fournel-Fleury et al., 1997 e 2002

NHL cellule B N° di casi

Aspetto istologico

Criteri citologici Indice mitotico Centroblastico

polimorfo

20 Diffuso Miscuglio di

MMC*(<20%), piccoli blasti (fino a 80%), centroblasti (20-0%), immunoblasti (<20%)

Alto

Tipo Burkitt# 4 Diffuso +

“starry sky”

Taglia media, nucleo rotondo, cromatina addensata, nucleoli multipli, citoplasma scarso, intensamente basofilo, talvolta vacuolizzato

Alto

NHL cellule T Piccole cell.

chiare

5 Paracorticale (delle zone T)

Taglia piccola, nucleo rotondo o leggermente irregolare, citoplasma esteso unipolare e chiaro

Basso

Pleomorfo misto

10 Diffuso Taglia piccola, media e

grande, nucleo

irregolare, citoplasma chiaro

Medio- Alto

Plasmocitoide (inclassificabile)

8 Diffuso Taglia piccola, media e grande, nucleo rotondo

o leggermente

irregolare, citoplasma esteso, basofilo, plasmocitoide

Alto

Linfoblastico 10 Diffuso Taglia media, nucleo rotondo o spiraliforme, cromatina polverosa, nuceoli poco visibili, citoplasma poco esteso e basofilo

Alto

Totale 57

MMC*: cellule medie macronucleolate

Tipo Burkitt#: sulla base delle similitudini morfologiche con il linfoma di Burkitt umano

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125 TABELLA VIII

Classificazione di Kiel attualizzata dei linfomi canini (Fournel-Fleury et al., 1997 e 2002): possibile correlazione con la classificazione WHO (Jaffe et al., 2001) e la classificazione WHO degli animali domestici (Valli et al., 2002).

Kiel attualizzata WHO umana WHO animale Neoplasie a cell.

B

Centroblastico polimorfo

Linfoma diffuso a grandi cell. B

Tipo Burkitt Linfoma di Burkitt Linfoma tipo Burkitt Neoplasie a cell.

T

Basso grado di malignità

Piccole cellule chiare

Linfoma periferico a cell. T non specificabile

Non descritto Alto grado di

malignità

Pleomorfo misto Linfoma periferico a cell. T non specificabile

Non descritto Plasmocitoide Linfoma periferico a cell. T

non specificabile

Non descritto Linfoblastico Linfoma/leucemia dei

precursori T linfoblastici

Linfoma/leucemia delle cell. T linfoblastiche