Fig.1.1.1 Struttura molecolare dell’adenosina

1

2

1.1 L’Adenosina

L’adenosina è un nucleoside endogeno costituito dalla base purinica Adenina e dallo zucchero pentoso D (-) ribosio, legati tra loro da un legame di tipo glicosidico tra l’atomo di azoto in posizione 9 della base e il carbonio in posizione 1 dello zucchero.

Fig.1.1.1 Struttura molecolare dell’adenosina

L’adenosina è una sostanza ubiquitaria nelle cellule dei mammiferi, ed è metabolicamente e strutturalmente correlata a nucleotidi biologicamente attivi (AMP, AMP ciclico, ADP, ATP), coenzimi (NAD, FAD, coenzima A) ed agenti metilanti (S- adenosil-L-metionina).

In quanto componente delle suddette molecole, l’adenosina svolge un ruolo chiave in numerosi processi, quali l’utilizzazione dell’energia cellulare, la trasduzione del segnale (tramite l’attivazione di sistemi a cascata coinvolgenti secondi messaggeri) ed in alcuni dei meccanismi enzimatici redox fondamentali per il metabolismo cellulare.

Tra le reazioni più significative nelle quali l’adenosina è coinvolta ci sono le

degradazioni enzimatiche dei nucleotidi ATP, ADP, AMP, e AMP ciclico ad adenosina,

3 la deaminazione ossidativa della stessa ad inosina da parte dell’adenosina deaminasi (ADA) e le trasformazioni in ipoxantina, xantina o acido urico, fondamentali nella regolazione della concentrazione del nucleoside endogeno.

L’adenosina è coinvolta nella costituzione degli acidi nucleici (RNA) e nel metabolismo purinico, inoltre viene generalmente annoverata tra i neuromodulatori del sistema nervoso centrale e periferico (Bridge set al., 1998) perché, a differenza dei neurotrasmettitori classici, non invia segnali tra neuroni o cellule ma è in grado di potenziare o inibire il rilascio a livello presinaptico di altri neurotrasmettitori tra cui aspartato, glutammato, e acido γ-amminobutirrico (GABA). A livello post sinaptico, inoltre, regola la depolarizzazione e la iperpolarizzazione neuronale.

Come modulatore omeostatico, l’adenosina svolge un ruolo regolatore in condizioni fisiologiche ed uno protettivo in condizioni di emergenza, come l’ischemia e l’infarto spostata qui (Cunha et al., 2000) . L’azione protettiva viene esplicata dalla riduzione dell’ipereccitabilità neuronale, dall’aumento del rifornimento di sangue locale, dalla riduzione dell’afflusso di Ca

nelle cellule e dalla prevenzione della morte cellulare.

La biosintesi dell’ adenosina avviene:

o a livello sia intracellulare che extracellulare, per degradazione enzimatica dell’ ATP a ADP e AMP, e per l’ azione successiva della 5’nucleotidasi;

o per conversione intracellulare o extracellulare del cAMP a AMP attraverso la fosfodiesterasi e per la successiva degradazione dell’ AMP ad adenosina;

o a livello intracellulare per conversione enzimatica della S- adenosilomocisteina (SAH) ad adenosina per mezzo dell’enzima adenosilomocisteinasi.

La concentrazione di adenosina viene mantenuta nell’ordine di grandezza di 10

M, sia a livello intracellulare che extracellulare, grazie a trasportatori bidirezionali specifici, dipendenti dal gradiente di concentrazione, o attraverso la riutilizzazione di substrati biologici (Fredholm et al., 2003).

In figura 1.1.1 sono rappresentati schematicamente i principali meccanismi

fisiologici di sintesi, metabolismo ed eliminazione dell’adenosina.

4

ATP ADP AMP Adenosina

Ecto -5’- Nucleotidasi Trasportatore bidirezionale

Fig. 1.1.1 Principali reazioni coinvolgenti l’adenosina

ATP<>ADP<> AMP<> Adenosina Inosina

Endo5’Nucleotidasi

Adenosil- SAH- omocisteinasi idrolasi S-adenosil

omocisteina

5

1.2 I recettori dell’adenosina

Le funzioni fisiologiche dell’adenosina sono dovute alla sua interazione con specifici recettori, classificati e caratterizzati in base alla loro struttura molecolare e alle loro azioni farmacologiche.

Tutti i recettori per l’adenosina finora identificati sono recettori accoppiati a proteine G.

La prima evidenza farmacologica dell’esistenza di recettori adenosinici si è avuta solo nel 1965, quando Gubareff e Seator provarono che le azioni dell’adenosina nel tessuto miocardico potevano essere contrastate da specifici antagonisti, quali le metil-xantine.

Nel 1978 Burnstock propose l’esistenza di almeno due tipi di recettori per le purine, denominati P1 e P2. Questa distinzione era basata sull’ordine di potenza con cui i vari nucleotidi e nucleosidi sono attivi: P1 identifica la famiglia di recettori maggiormente sensibili all’adenosina, mentre i recettori P2 sono preferenzialmente attivati da ATP e ADP.

Un’ulteriore differenziazione tra recettori P1 e P2 è basata sulla diversa sensibilità agli antagonisti di tipo xantinico: i recettori P1 sono, infatti, inibiti competitivamente da sostanze xantiniche quali caffeina, teofillina e teobromina, totalmente inattive sui recettori P2.

Ciascuna delle due famiglie comprende diversi sottotipi recettoriali identificabili in base

al profilo farmacologico, al meccanismo di trasduzione del segnale e alla struttura

molecolare. I P2 si suddividono in P2X e P2Y (Abbracchio e Burnstock, 1994) ; ne

sono stati clonati 15 sottotipi molti dei quali hanno una distribuzione tissutale

caratteristica.

6

1.2.1 Classificazione e localizzazione dei recettori P1

Sono recettori di membrana accoppiati a proteine G, il cui principale agonista è l’adenosina; essi vengono ulteriormente suddivisi in A

, A

, A

e A

(Abbracchio e Burnstock, 1994).

Ognuno di questi tre sottotipi recettoriali è stato clonato in numerosi mammiferi, incluso l’uomo (Zhou et al., 1992).

I recettori adenosinici A

sono ubiquitari nel SNC, nel quale sono espressi a livello della corteccia cerebrale, del cervelletto, dell’ippocampo, del talamo e delle corna dorsali del midollo spinale

A livello periferico l’RNA messaggero che codifica per tali recettori si ritrova principalmente nel fegato, nel cuore, nella vescica, nell’occhio e nei testicoli, e, in misura notevolmente inferiore, nel polmone, nel tratto gastrointestinale, nel pancreas e nel rene

I recettori del sottotipo A

, sono localizzati nel SNC a livello del corpo striato, nel nucleo caudato, nel nucleus accumbes, nel globo pallido e nei tubercoli olfattivi. A livello periferico si trovano nel cuore, nei polmoni, nella milza e nel tessuto adiposo bianco

Il sottotipo A

è prevalentemente localizzato a livello cerebrale nella pars puberali e perifericamente nell’intestino e nella vescica

I recettori A

, espressi in quantità inferiori rispetto agli altri sottotipi, presentano

concentrazioni maggiori nei polmoni, nel cuore, nel fegato, nel rene e più limitate nel

SNC e nei testicoli. Nel ratto, quest’ultima localizzazione, assume una proporzione ben

più ampia rispetto all’uomo; pertanto si suppone che il recettore A

svolga una

importante azione sul sistema riproduttivo (Zhou et al., 1992).

7

Fig.1.2.1.1 Distribuzione dei recettori adenosinici nel SNC

1.2.2 Struttura molecolare e meccanismo di trasduzione dei recettori adenosinici

I recettori adenosinici (Fig. 1.2.2.1) appartengono alla superfamiglia dei recettori 7- TMS: si tratta di proteine integrali di membrana caratterizzate da sette segmenti transmembranali, da un sito extracellulare (porzione N-terminale) che riconosce il ligando e da un sito intracellulare (porzione C-terminale) che riconosce una proteina legante il GTP o proteina G. Le proteine G comprendono un’ampia famiglia di proteine costituite da tre subunità (α, β, γ) che si differenziano per la tipologia di subunità α (Gs, Gi, Gq, ect), in grado di attivare una particolare via di trasduzione del segnale intracellulare. I sette domini transmembrana, organizzati in strutture ad α-elica, sono costituiti ciascuno da circa 25 amminoacidi idrofobici e sono connessi tra loro da tre loop citoplasmatici e tre extracellulari. Questi ultimi contengono residui cisteinici

A ₁ A ₁

A 2A A 1

A _2A A ₁ A _2A A ₁

A 1 A 3

A 2A

A 1

A _2A A ₁ A ₃

8 capaci di formare ponti disolfuro, in grado di modificare notevolmente la conformazione del recettore.

I recettori A

sono solitamente accoppiati a una proteina G

con conseguente inibizione dell’ enzima adenilato ciclasi e diminuzione dell’AMPc intracellulare; in alcuni casi l’

accoppiamento avviene anche con la G

e la G

, che modulano diversi effetti a livello dei canali del potassio, del calcio e della fosfolipasi C.

I recettori A

e A

sono prevalentemente accoppiati a una proteina G

che in ultimo, porta ad un aumento della concentrazione intracellulare dell’ AMPc.

I recettori A

sono accoppiati alle proteine G

e G

che mediano l’ inibizione dell’

adenilato ciclasi e la stimolazione della fosfolipasi C e dei canali del calcio.

Il sito di legame per il ligando è costituito da una tasca formata dal riarrangiamento tridimensionale delle sette α-eliche transmembranarie. In particolare, si è scoperto che le porzioni recettoriali maggiormente coinvolte nel legame con il ligando sono i primi quattro segmenti transmembranali, mentre la porzione deputata a mantenere l’accoppiamento con la proteina G è quella N-terminale del terzo loop intracellulare. I primi quattro segmenti contengono numerosi siti di fosforilazione, a livello di residui treoninici e serinici, coinvolti in fenomeni di desensitizzazione del recettore (Olah et al., 1990).

Il segmento intracellulare del recettore è deputato all’interazione con una proteina G diversa a seconda del sottotipo recettoriale, che consente l’attivazione di un meccanismo di trasduzione del segnale mediato da secondi messaggeri che porta ad una serie di

effetti intracellulari, tra cui la sintesi di nuove proteine.

9

Fig. 1.2.2.1 Struttura molecolare di un recettore 7-TMS

1.2.3 Modelli molecolari dei recettori adenosinici

Gli studi svolti negli ultimi anni, atti a determinare i modelli molecolari dei recettori adenosinici, hanno permesso di chiarire i rapporti struttura attività che intercorrono tra tali recettori ed una serie di composti loro agonisti o antagonisti.

Al fine di rendere massima la complementarietà molecolare tra ligandi e recettori adenosinici sono state svolte ulteriori analisi, riguardanti la natura dei legami coinvolti.

agonista

Esterno della membrana

Interno della membrana

Proteina G

10 Attraverso la clonazione di tali sottotipi recettoriali si è arrivati alla determinazione delle caratteristiche molecolari dei loro siti di legame e alla elaborazione di modelli molecolari che razionalizzassero il profilo farmacologico dei composti presi in esame.

Per riconoscere e distinguere l’azione agonista da quella antagonista di un dato ligando a tali recettori, si sono svolte indagini finalizzate a determinare l’esatta localizzazione molecolare dei siti di binding, fino ad arrivare all’identificazione dei singoli residui amminoacidi coinvolti nel legame ligando-recettore.

Il modello base di un recettore adenosinico (Fig. 1.2.3.1) prevede l’esistenza di:

- tre aree lipofile, denominate L

, L

, L

- una zona planare, che accoglie l’anello purinico

- quattro siti idrofili, probabilmente quattro residui di istidina, capaci di accettare i protoni del ligando.

L’interazione di un ligando con la sola area lipofila L

sembra esplicare un’attività sul sottotipo recettoriale A

; l’occupazione contemporanea di L

e L

, invece, conferisce al composto in esame un’attività di tipo A

; infine, il legame alle aree L

e L

rende il ligando più affine al recettore di tipo A

.

Fig. 1.2.3.1 Modello molecolare generale dei recettori adenosinici

11 E’ stata ipotizzata l’esistenza di sottotipi recettoriali A

dalla differente stimolazione indotta dai derivati adenosinici su diverse parti del cervello (Fredholm at al., 2003).

Basandosi sulle capacità stimolatorie dell’adenosina su tali recettori, essi sono stati suddivisi in due sottospecie, definitivamente confermate tramite clonazione e sequenziamento :

• A

verso il quale l’adenosina ha un’alta affinità (0.1-1.0µM)

• A

verso il quale l’adenosina ha un’affinità minore ( >10µM)

Similmente al recettore A

,il modello per il recettore A

presenta una tasca idrofobica capace di accogliere composti sostituiti in posizione N

con sostituenti non troppo ingombranti, in quanto a livello di questa tasca sono stati situati amminoacidi stericamente voluminosi.

Nel modello recettoriale analizzato si ha una seconda tasca, anch’essa di natura idrofobica, capace di formare legami con composti sostituiti a livello del carbonio 2, grazie alla presenza di un residuo tirosinico.

Il recettore A

contiene, oltre al sito di N-glicosilazione sul II loop extracellulare, altri potenziali siti di glicosilazione nella zona N-terminale e tre siti soggetti a fosforilazione da parte della PKC (Zhou et al., 1992).

Affinché un composto ad azione agonista o antagonista si leghi a tale sottotipo recettoriale è necessario che interagiscano con His95 e Asn250 (Olah et al., 2000).

Le zone recettoriali ed i residui amminoacidi deputati al legame di ligandi a funzione agonista sono situate a livello delle eliche III (HIS95), V, VI (Asp272) e VII; in particolare, tramite studi di mutagenesi, si è scoperta l’importanza fondamentale di His 272 nella VII elica nella formazione del legame di agonisti attraverso il residuo ribosidico. Sempre utilizzando studi di mutagenesi si è arrivati alla conclusione che Trp243 nella VI elica è basilare per l’attivazione del recettore e la trasduzione del segnale. Infatti, mutando tale residuo, si evidenzia una inattivazione del recettore.

Per il legame di composti ad attività antagonista, si sono rivelati strategici il Trp243 (VI

elica) e la Lys152 appartenente al II loop extracellulare.

12 Il recettore A

, a differenza degli altri due sottotipi recettoriali adenosinici, presenta sulla VI elica in posizione 249 un residuo serinico invece di uno istidinico, determinando così una diversa affinità per gli antagonisti.

Difatti, il diverso residuo presente a tale livello, causa un orientamento della porzione purinica assai differente, rendendo l’interazione idrofobica dell’antagonista col recettore A

più difficoltosa.

Inoltre, il recettore A

presenta ulteriori differenze amminoacidiche a livello della tasca accettrice del legame con il ligando, che la rendono meno ampia, e quindi difficilmente accessibile a molecole agoniste molto voluminose, ingombrate stericamente dalla presenza contemporanea dell’anello purinico e del ribosio. Il ribosio è infatti indispensabile affinchè un composto esplichi su un recettore adenosinico una attività di tipo agonista.

1.3 Ligandi dei recettori adenosinici: relazioni struttura- attivita’

Data l’elevata espressione dei recettori adenosinici a livello centrale e periferico, e le loro implicazioni in molteplici processi fisiologici e patologici, la ricerca si è particolarmente interessata a determinare le loro caratteristiche ed a sintetizzare nuovi ligandi da utilizzare come potenziali agenti terapeutici.

Importanti relazioni struttura-attività dei ligandi di nuova sintesi sono state dedotte andando a valutare l’affinità e la selettività di tali composti per i diversi sottotipi recettoriali dell’adenosina attraverso studi di binding con radioligandi e di modeling molecolare.

Nella tabella vengono riassunti al classificazione dei recettori adenosinici nei vari

sottotipi, la distribuzione degli stessi nei vari tessuti umani e le caratteristiche principali,

quali affinità e meccanismi di trasduzione verso specifici ligandi.

13

14

1.3.1 Agonisti dei recettori adenosinici

Un sostanza è definita agonista se, una volta legatosi al recettore, è in grado di mimare gli effetti biologici del ligando endogeno. I parametri utilizzati per caratterizzare a livello quantitativo la funzione agonista di un dato ligando sono l’affinità (ε), che ne misura la potenza, e l’attività intrinseca (α), che ne misura la capacità di attivare una risposta biologica in seguito al legame con lo specifico recettore.

Gli agonisti adenosinici presentano una forte omologia strutturale con il ligando endogeno adenosina: in particolare l’attività agonista è stata correlata con la presenza dello zucchero ribosio in posizione N

. Difatti, la sostituzione di tale residuo ribosidico con altri gruppi, quali un metile, o la totale eliminazione dello zucchero, conferiscono alla molecola una debole attività antagonista .

La sostituzione degli ossidrili alcolici in posizione 2’ e 3’ a livello del ribosio porta ad una notevole diminuzione di affinità; al contrario, sembra scarsamente influente la modifica del 5’-OH.

Effettuando opportune sostituzioni a livello di tale posizione sono state sintetizzate numerose molecole con funzione agonista, quali i derivati 5’-uronamidici dell’adenosina a cui appartengono la 5’-etil-uronamide (NECA), agonista A

, e la 5’- metil-uronamide (MECA), agonista A

, entrambi utilizzati come spiazzanti negli studi competitivi di binding con radioligandi. Inoltre, rimuovendo il 5’-OH, si ottiene la deossiadenosina, avente una costante di inibizione, K

, nell’ordine di 0.1-1 µM, dati che confermano la scarsa rilevanza del 5’-ossidrile ai fini di un’attività agonista.

L’inversione di configurazione dell’ossidrile in 2’ al ribosio risulta nociva per il legame al recettore, in quanto ne diminuisce l’affinità per lo stesso

La modificazione più significativa a livello dell’anello purinico, capace di creare potenti agonisti adenosinici, in particolare sui recettori A

, risulta quella operata a livello dell’azoto in posizione 6.

La sostituzione completa della posizione 6 della purina, a dare derivati N e N-

disostituiti, porta a classi di composti di scarso interesse: almeno un H in 6 deve essere

mantenuto affinché si possa instaurare un legame di tipo idrogeno tra il ligando e un

15 qualsiasi sottotipo recettoriale adenosinico. Pertanto, il gruppo amminico presente a livello 6, deve essere primario o secondario per esplicare attività agonista.

Il sito di legame di un recettore adenosinico per i sostituenti in N

è una tasca idrofobica di grosse dimensioni, in grado di accogliere sostituenti stericamente ingombranti, quali gruppi ciclici o aromatici e sostituenti dotati di carica.

La sintesi di composti data dalla sostituzione contemporanea di N

e C

comporta un aumento della selettività verso il sottotipo recettoriale A

.

La sostituzione di N

e C

ha condotto, invece, a composti più selettivi verso il sottotipo A

, come la N

-(3-iodobenzil)-adenosina-5’-metil-uronamide o IB-MECA.

In figura possiamo vedere le posizioni fondamentali per l’ interazione con il recettore, sulla base dei quali vengono sintetizzati nuovi composti:

o il gruppo ossidrilico del ribosio

o la posizione N

che corrisponde alla tasca idrofobica del recettore

o la posizione C

che corrisponde alla seconda tasca idrofoba

O

N

OH OH

N

N N H ₂ N

HO

Fig. 1.3.1.1 Studio di agonisti su modificazioni dell’ adenosina Posizione 5’

del ribosio

Posizione 2 della purina 5’

9

6

2

Posizione N

della purina

16

1.3.2 Agonisti parziali dei recettori adenosinici

Un agonista parziale è una molecola con bassa efficacia verso il recettore (attività intrinseca compresa tra 0 e 1), non in grado di dare una risposta massimale anche occupando più del 95% dei siti recettoriali presenti.

La distribuzione ubiquitaria dei recettori adenosinici, in particolar modo del sottotipo A

, nonché l’ampio spettro di azioni fisiologiche da essi mediate, hanno reso necessario l’impiego di agonisti parziali, al fine di ottenere un’azione terapeutica mirata. Infatti, un agonista parziale, a differenza di un agonista puro, esplicherà la sua attività solo su tessuti ricchi di recettori adenosinici ed eviterà l’insorgere di effetti collaterali in altri tessuti aventi una bassa concentrazione di tali recettori.

Esempi di effetti mirati dovuti all’azione di agonisti parziali A

sono osservabili a livello cardiaco come antiaritmici e nel tessuto adiposo come antilipolitici.

Una classe importante è composta da molecole sostituite in N

e contenenti ribosio, in cui è stata operata una rimozione a livello di un ossidrile (2’ o 3’) dello zucchero. Tale modificazione strutturale trasforma potenti agonisti in agonisti parziali, a bassa affinità per i recettori adenosinici e bassa attività intrinseca.

1.3.3 Antagonisti dei recettori adenosinici

Un farmaco antagonista è una molecola che, a differenza dell’agonista, si lega al recettore, bloccandone l’innesco della risposta biologica ed impedendo ad altre molecole, come ad esempio il ligando endogeno, di instaurare un legame col recettore stesso.

I primi antagonisti studiati sui recettori adenosinici sono stati i composti xantinici

naturali, caffeina e teofillina. Essi hanno la peculiarità di legarsi a tutti i sottotipi

17 recettoriali con scarsa selettività e alta K

e costituiscono la base dei modelli sintetici per potenti e selettivi antagonisti adenosinici.

Per quanto riguarda il sottotipo recettoriale A

, sono stati sintetizzati derivati xantinici sostituiti in posizione 8, come la (1,3)-dipropil-8-ciclopentil-xantina (DPCPX), con elevata affinità per gli A

, nell’ordine del nM, maggiore nel ratto rispetto che nell’uomo.

Fig. 1.3.3.1 (1,3)-dipropil-8-ciclopentil-xantina (DPCPX)

Il sottotipo recettoriale A

presenta due principali gruppi di composti antagonisti: i derivati xantinici ed i derivati polieterociclici azotati (ad esempio le pirazolo triazolo pirimidine).

N N

N R

R ₂ O

N

R ₁

O

Fig. 1.3.3.2 Struttura del nucleo xantinico

8 1

3

18 Studi random su xantine 1-, 3-, 8-sostituite hanno portato all’identificazione del primo antagonista A

, la (1,3)-dipropil-7-metil-8-(3,4-dimentossistiril)xantina (DMPTX), molto potente e selettivo per questo recettore.

Requisiti fondamentali per un potente e selettivo antagonismo A

sono la presenza di un 5-NH

libero, di un gruppo furanico, di sostituenti aromatici con gruppi elettrofili legati all’anello pirazolico, capaci di formare legami a idrogeno con la tasca recettoriale.

Gli studi del sottotipo recettoriale A

presentano più difficoltà, in quanto le relazioni struttura-attività variano a seconda della specie trattata.

E’ un sottotipo meno sensibile all’azione antagonista xantinica, pertanto i suoi antagonisti più potenti sono da ricercarsi in composti non-xantinici, quali derivati piridinici, isochinolinici e chinazolinici (Baraldi et al., 2003).

Sostituendo i derivati 1-chetonici della 1,2,4-triazolo[4,3-α]-chinazolina con gruppo (1,4)-dichetonico si ha uno shift di selettività del sottotipo A

al sottotipo A

.

N H

O NO

O

O O

Struttura molecolare MRS 1334

19 Anche i derivati delle pirazolo triazolo pirimidine trattati in precedenza, opportunamente sostituiti, si legano selettivamente ai recettori A

(Baraldi et al., 2003).

N N

N N

O

Cl NH O

Requisiti generali fondamentali per l’antagonismo ai recettori adenosinici

Fig. 1.3.3.3 Requisiti principali per l’antagonismo

CARATTERISTICHE MOLECOLARI DI ANTAGONISTI ADENOSINICI

Presenza di strutture planari presenza di sistemi aromatici

presenza di sistemi eterociclici azotati (bicicli o tricicli) Presenza di sostituenti idrofobi

Assenza di ribosio

Struttura molecolare MRS 1220

20

1.4 Effetti farmacologici dei recettori adenosinici

L’ attivazione del recettore A

da parte di adenosina endogena o di eventuali agonisti

provoca diversi effetti a seconda del distretto in cui il mediatore agisce: nel SNC porta

ad una diminuzione del rilascio di neurotrasmettitori, a una diminuita attività

locomotoria, ad effetti sedativi ed anticonvulsivanti; provoca effetti metabolici

antilipolitici ed aumenta la sensibilità alla insulina; nel tratto gastrointestinale dà

inibizione della secrezione acida; nel sistema cardiovascolare induce effetti inotropo,

dromotropo e cronotropo negativi; nel distretto renale dà diminuita filtrazione

glomerulare, inibizione del rilascio di renina, effetto antidiuretico e vasocostrizione

delle arteriole afferenti.

21 L’attivazione del recettore A

provoca le seguenti principali azioni: regolazione dell’

integrazione senso-motoria nei gangli basali, inibizione dell’ aggregazione piastrinica e dell’ attività dei leucociti polimorfo nucleati, vasodilatazione, aggravamento del danno ischemico, stimolazione dell’ attività sensoria nervosa.

Le azioni provocate dall’ attivazione del recettore A

sembrano essere: attivazione della proteina chinasi MAPK; bronco costrizione nei pazienti asmatici, soprattutto legata all’

attivazione dei mastociti; controllo della proliferazione fibroplastica, del rimodellamento cardiaco e dell’ anormale crescita cardiaca che si ha in malattie come ipertensione e l’

infarto del miocardio; aumento del flusso coronario e della pressione; controllo della

proliferazione delle cellule muscolari lisce vascolari; inibizione della produzione del

TNF-α; regolazione della produzione della interleuchina IL-6; aumento della secrezione

acida a livello gastrointestinale; aumento della produzione epatica di glucosio.

22 Gli effetti principali dell’ attivazione dell’ A

sono: effetto antinfiammatorio in seguito ad attivazione di neutrofili, eosinofili e macrofagi; effetto pro infiammatorio dovuto all’

attivazione dei recettori A

intensamente espressi sui basofili, con conseguente

broncospasmo ed asma; citoprotezione nelle cellule nervose e cardiache; induzione della

mieloprotezione e del fattore stimolante la proliferazione coloniale dei granulociti nei

ratti trattati chemioterapeuticamente; inibizione in vivo e in vitro del fattore di crescita

tumorale con effetto citostatico.

23

1.4.1 Impiego terapeutico degli antagonisti A

come anti tumorali

L’adenosina si accumula ad alti livelli nei tessuti ipossici in seguito alla degradazione dell’ATP; pertanto questo nucleoside può essere coinvolto nella risposta cellulare dopo ipossia. È stato riconosciuto che elevati livelli di adenosina sono presenti nei fluidi extracellulari dei tumori solidi, suggerendo che essa possa avere un ruolo nella crescita tumorale.

Si ipotizza che tale influenza sulla proliferazione cellulare sia principalmente mediata dal recettore A

, che è particolarmente espresso nelle cellule tumorali. Questo suggerisce che questo sottotipo recettoriale possa essere un buon candidato come marker tumorale. Molti studi hanno riportato un ruolo fondamentale dell'adenosina sulla regolazione del ciclo cellulare, proliferazione e apoptosi in cellule di origine tumorale e non tumorale (Abbracchio et al., 1995). Questi effetti dipendono dalle concentrazioni extracellulari di adenosina, dall'espressione di diversi sottotipi recettoriali e dal meccanismo di trasduzione del segnale attivato dopo il legame degli agonisti.

La produzione di adenosina in seguito ad ipossia è stata recentemente correlata con il fattore HIF-1α (Hypoxia- inducible factor-1) in differenti linee cellulari tumorali umane, come ad esempio nei melanomi, glioblastomi e nel tumore al colon (Merighi S. et al., 2006). L’inibizione farmacologica del HIF-1α sembra essere un approccio terapeutico migliore rispetto all’inattivazione genica; pertanto gli antagonisti del recettore A

in grado di bloccare l’accumulo della proteina HIF-1α e del VEGF in seguito ad ipossia, indicano un nuovo approccio nel trattamento dei tumori, che si basa sulla cooperazione tra i segnali ipossici e adenosina mediati (Merighi S. et al., 2006).

In questo lavoro di tesi è stato possibile valutare in vitro che i composti analizzati, essendo antagonisti del recettore A

, bloccano le cellule tumorali; lavorando attraverso una specifica metodica su cellule di glioblastoma umano, cellule U87MG si è potuto evidenziare un potenziale effetto terapeutico anti tumorale.

I gliomi maligni sono i tumori più frequenti del Sistema Nervoso Centrale. La loro sopravvivenza media dopo chirurgia, radio e chemioterapia è di circa anno. La tendenza delle cellule tumorali ad invadere il tessuto circostante e migrare lungo i vasi preesistenti e gli assoni, pone la necessità di sviluppare terapie per prevenire lo sviluppo di recidive.

Le cellule U87MG originano dal tessuto gliale umano e vanno a costituire i tumori

cerebrali primari o gliomi.

24

Esistono diversi tipi di gliomi:

• Astrocitomi: originano da piccole cellule stellate chiamate astrociti. Possono crescere ovunque nel cervello e nel midollo spinale. Negli adulti, gli astrocitomi si sviluppano più frequentemente nel cervello, nei bambini, invece, nel tronco encefalico, nel cervello e nel cervelletto.

• Gliomi del tronco encefalico: originano nella parte inferiore del cervello, cioè a livello del tronco encefalico che regola molte funzioni vitali. Questi tumori generalmente non possono essere rimossi.

• Ependimomi: normalmente si sviluppano nel tessuto di rivestimento dei ventricoli, ma possono originare anche nel midollo spinale. Sebbene questi tumori possano svilupparsi a qualsiasi età, sono però più comuni nei bambini e negli adolescenti.

• Oligodendrogliomi: si sviluppano dalle cellule che producono la mielina, il

rivestimento protettivo dei nervi. Questi tumori generalmente originano nel cervello,

crescono lentamente e di solito non si diffondono nei tessuti circostanti. Gli

oligodendrogliomi sono rari e compaiono più spesso in adulti di media età.