Aminoidantoine, Aminossazoline, Aminotiazoline e Iminopirimidinoni.

Un progresso importante nella progettazione di inibitori non peptidici di BACE-1 è stata la scoperta di eterocicli 2-ammino sostituiti che coinvolgono entrambe le funzioni Asp nel sito attivo BACE-1. [73] Rispetto agli inibitori iniziali dell'acilguanidina, questi ligandi generalmente hanno migliorato il profilo fisico-chimico, la penetranza cerebrale e l’efficacia in vivo.

In questo ambito, è stata recentemente sviluppata dalla Merck l'aminoidantoina (35) (Figura 19) quale inibitore di BACE-1. Sebbene (35) fosse potente nel dosaggio enzimatico (Ki = 22 nM), quando è stato saggiato su cellule intere ha subito una drastica

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diminuzione (cellula IC₅₀ = 258 nM), a causa dell'efflusso di Pgp. Inoltre ha mostrato una modesta biodisponibilità orale e livelli di Aβ-40 plasmatici, ma non corticali, ridotti nei topi CRND8. [76]

Figura 19. Aminoidantoina 35

Cercando di identificare nuovi inibitori BACE-1, altamente solubili e permeabili, Hunt e collaboratori hanno sintetizzato una serie di piccoli nuclei, rigidi, saturi o parzialmente saturi utilizzando eterocicli 2-amino sostituiti. Ciò ha portato all'identificazione dell'amminoidantoina spirociclica 36 (BACE-1 IC₅₀ = 36,8 μM) (Figura 20), che combina una limitata flessibilità molecolare con tridimensionalità (cioè, da aromatica a alifatica), fattori chiave rispettivamente per la permeabilità e la solubilità. Il gruppo ha condotto studi di relazioni struttura-attività (SAR) su modifiche del nucleo, funzioni P3 e gruppi funzionali (WH) leganti l’Asp. In questo modo sono stati ottenuti composti con potenze inibitorie enzimatiche e cell-based Aβ1-40 nell’ordine del nanomolare ma bassa selettività rispetto alla proteasi aspartilica strettamente correlata, catepsina D (CatD)

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(IC_50CatD/IC_50BACE = 0,2-97). Gli (R)-enantiomeri erano circa due volte più potenti dei corrispondenti racemati ma non mostravano una marcata maggiore affinità per CatD. Sebbene non siano state identificate alternative modalità di legame ad Asp per eliminare l'efflusso (il sostituente WH dell'amminoidantoina contribuisce alla responsabilità dell’efflusso di Pgp in quanto aggiunge due donatori di legami a idrogeno e aumenta il PSA), sono stati osservati una buona permeazione della BBB e una riduzione di Aβ nel liquido cerebrospinale (CSF) per alcuni derivati in vivo. Ancora più importante, Hunt e colleghi hanno dimostrato una relazione farmacocinetica/farmacodinamica (PK/PD) tra le concentrazioni di farmaco libero nel cervello e l'abbassamento di Aβ nel liquido cerebrospinale nelle cavie e nei ratti di tipo selvatico. L'ottimizzazione dell'esposizione al cervello ha portato alla scoperta del composto lead (R)-37 (BACE-1 IC₅₀ = 48 nM) (Figura 20), che ha ridotto significativamente il CSF Aβ nei roditori wild-type e nella scimmia.

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Il gruppo ha anche inserito un anello 7-tetraidropiranico (7-THP) in P2’ dello scaffold del cromano, fornendo una serie di 1,3,4,4a,10,10a-esaidro-pirano[4,3-b] cromani [77] Questa modifica è stata effettuata per migliorare la selettività per BACE-1 rispetto a CatD, a causa delle differenze nei loro siti attivi. Sono state esplorate tre diversi WH (amminoidantoina, aminoossazolinee e aminotiazoline) come funzioni che legano l'Asp, nonché sostituzioni guidate da SB in P3 e P2' per modulare potenza, selettività, efflusso e permeabilità (Figura 21).

Figura 21. Aminoidantoina spirociclica 38

La funzione amminoidantoinica ha portato ad ottenere i composti più potenti ma con rapporti di efflusso più alti e permeabilità inferiori rispetto agli altri due WH. Questi derivati mostravano buone potenze enzimatiche (10-40 nM) e cellulari (5-44 nM) ed erano da 10 a 420 volte più selettivi per BACE-1 che per CatD. È importante sottolineare che, nonostante l'alto efflusso, l'amminoidantoina 38 (Figura 21) aveva il miglior rapporto di copertura (concentrazione cerebrale libera/cellula IC₅₀) dei vari cromani 7-THP nei modelli PK di topi. Inoltre, 38 ha ridotto significativamente l'Aβ1-40 del CSF in cavia, ratto e

69 macaco (rispettivamente 58%, 53% e 63%).

I derivati 2,3,4,4a,10,10a-esadropirano[3,2-b]cromano (8-THP cromano) hanno mostrato un profilo generale ancora migliore (Figura 22).

Figura 22. Aminoxazolina spirociclica 39

Come visto, la funzione amminoidantoinica che lega Asp è correlata all'efflusso elevato, nonostante sia il più potente. Le potenze enzimatiche (41-98 nM) e cellulari (37-140 nM) e la selettività CatD (da 430 a> 2200 volte) degli analoghi dell'amminoossazolina e dell'aminotiazolina sono state notevolmente migliorate dalla metilazione nella posizione β dell'8-THP del nucleo del cromano. L'ulteriore ottimizzazione della funzione P3 ha portato all'amminossazolina 39 (Figura 22), che è stata avviata in fase di studi PD sul ratto. Sebbene l'amminossazolina 39 abbia ancora mostrato una responsabilità di efflusso (rapporto di efflusso di 3,4) e abbia un rapporto di copertura 7 volte più basso rispetto all' aminoidantoina 38, ha mostrato un miglioramento significativo nella riduzione di Aβ1-40 del CSF (69%).

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BACE-1. [78] L'aminossazolina xantene 40 (Figura 23) ha una buona potenza enzimatica BACE-1 (2 nM) e cellulare (25 nM), nonché proprietà generali favorevoli. Ha mostrato una buona attività di riduzione dei livelli di Aβ nel CSF e nel cervello in un modello PD di ratto ma un prolungamento del QTc nei modelli cardiovascolari, e questo è in accordo con l'attività in vitro sul canale del potassio cardiaco hERG (hERG Ki = 0,66 μM). [78]

Figura 23. Aminoxazolines spirociclici 40-44

In realtà, l'inibizione di hERG è stata frequentemente associata agli inibitori di BACE-1. Infatti, è evidente che l'aumento del pKa e della lipofilia, che è richiesto per avere efficaci inibitori di BACE-1, aumenta la possibilità di inibizione di hERG. Quindi, la riduzione di questi due parametri è un approccio comune per ridurre l'affinità verso hERG. Tuttavia, è noto che la diminuzione del pKa del gruppo che si lega ad Asp diminuisce generalmente la potenza di BACE-1, mentre l'introduzione della polarità aumenta il PSA, che è correlato al

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riconoscimento di Pgp. Un equilibrio di efflusso Pgp basso, e la potenza verso hERG e BACE-1 è stato ottenuto introducendo gruppi polari in P2' di 40 e riducendo contemporaneamente il PSA della funzione in P3. [78]

L'introduzione di un atomo di fluoro in posizione 4 dell'anello xantenico ha migliorato sia la potenza enzimatica BACE-1 che cellulare (da 5 a 10 volte). [78] L’aumentata potenza di BACE-1 all'interno della serie è stata attribuita ad una favorevole interazione, via legame a idrogeno, tra l'atomo di fluoro in 4 e l’NH del Trp76 di BACE-1. Quindi è stata indagata l'introduzione di un atomo di azoto in posizione 3 o 4 del nucleo xantenico per coinvolgere allo stesso modo l’NH di Trp76. Questa modifica ha migliorato la potenza di BACE-1 e ridotto l'affinità di legame di hERG ma ha aumentato il rapporto di efflusso Pgp. L'ottimizzazione dei gruppi P3 e P2' ha portato ad ottenere diversi composti con profili in

vitro migliori.

È stato esplorato anche lo sviluppo di 3-aza-4-fluoroxanteni. Questi approcci di ottimizzazione del piombo hanno dato luogo a composti con riduzioni elevate nei livelli di Aβ nel CSF e nel cervello in un modello di ratto naive. In particolare, i composti 41, 42 (AMG-8718), 43 e 44 (Figura 23) avevano eccellenti profili in vitro ( rispettivamente: IC₅₀ di BACE-1 = 0,3, 0,7, 0,9, 0,3 nM e rispettivamente: IC₅₀ su cellula = 4, 4,4 , 21.1 e 4 nM,) e buone risposte PD in vivo nei ratti. Questi composti hanno mostrato una modesta attività per hERG (41 hERG Ki = 3,28 μM; 42-44 hERG Ki> 10 μM) e un potenziale significativamente ridotto per il prolungamento del QTc nei modelli di sicurezza cardiovascolare nel cane (41, 42 e 44) e scimmia (43). [79] aminooxazoline 43 e 44 hanno anche prodotto riduzioni drastiche e sostenute di Aβ nel CSF e nel cervello in un modello PD di primate non umano. Hanno mostrato una scarsa clearance in vivo e una buona biodisponibilità orale in modelli preclinici. [79]

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problemi di tossicità. Ha suscitato tossicità retinica che ha portato all'assottigliamento dello strato nucleare esterno della retina in uno studio di tossicità di un mese su ratto a supporto dei primi studi sull’uomo. Sebbene l'origine della tossicità non sia stata stabilita, è stato ipotizzato che fosse probabilmente un effetto off-target correlato all'inibizione di altre proteasi. Mandal e colleghi hanno recentemente descritto nuovi imminopirimidinoni bicicliclici per ottimizzare il profilo in vivo e affrontare le passività off-target (citocromo CYP3A4 e inibizione hERG) di una precedente serie di pirrolidine imminopirimidinone fusi rappresentata da 45 (Figura 24).

Figura 24. Iminopirimidinoni 45-46

A partire da 45, il gruppo ha migliorato il profilo iniziale e le proprietà del SNC eliminando il gruppo cianofenilico in P3 (per ridurre la lipofilia e l'inibizione hERG) e ottimizzando la funzione fluoropirimidinica che lega la regione S2'-S2'' (per modulare l'affinità di BACE-1 e indurre l'inibizione del CYP3A4). Successivamente hanno ottimizzato l'anello tiofenico in P1 per migliorare l'affinità e la selettività. Ciò ha portato

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all’ottenimento dell'analogo 2,4-difluorofenilico 46 (BACE-1 Ki = 5 nM, cellula IC₅₀ = 14 nM) (Figura 24), che ha abbassato i livelli di Aβ40 del CSF e della corteccia sia nei ratti che nelle scimmie.

È importante sottolineare che, occupando le sottotasche S1 e S2'-S2'', 46 ha una struttura molecolare innovativa rispetto agli inibitori BACE-1 che legano S1-S3 che possono potenzialmente abbassare l'Aβ centrale nelle specie di non roditori preclinici.

3.1.2 Aminotiazine

L'aminotiazina 47 FB-derivata (LY2811376, Figura 25) sviluppata da Eli Lilly ha mostrato profili PK ben bilanciati e livelli di Aβ del CSF ridotti in diverse specie animali.

[80] È stata anche la prima molecola a dimostrare una riduzione prolungata di Aβ nel cervello in volontari sani. Tuttavia, gli studi clinici sono stati interrotti a causa della tossicità preclinica della retina, potenzialmente correlata all'inibizione CatD off-target [80]. Il composto 47 ha mostrato solo una modesta attività inibitoria di BACE-1 (IC₅₀ = 0,24 μM). Pertanto, l'aumento della potenza è stato considerato come una strategia per ampliare la finestra terapeutica rispetto alla tossicità osservata. A questo proposito, prendendo di mira lo scheletro della tasca del sito attivo di BACE-1, Wu e colleghi hanno scoperto la biaril amminotiazina 6-dimetilisossazolo-sostituita 48 (Figura 25), con attività inibitoria verso BACE-1 di 34 volte maggiore (IC₅₀ = 8 nM) rispetto all'aminotiazina 47. Nonostante la sua potenza, l'amminotiazina 48 ha mostrato solo una modesta attività in vivo nei roditori, a causa della scarsa penetrazione cerebrale e dell'instabilità metabolica principalmente correlata all'ossidazione dell'anello pirimidinico.

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Entrambi gli ostacoli sono stati superati con lo sviluppo della pirazina-carbossamide 49 (Figura 25). La funzione pirimidilica dell’aminotiazina 48 è stata sostituita con una carbossamide e il sostituente 5,6-difluorofenile nella tasca S1 era ottimale in termini di attività e stabilità metabolica.

L'ottimizzazione della catena laterale ammidica nella tasca S3 ha portato a 49, che ha mostrato una potente attività inibitoria di BACE-1 (IC₅₀ = 0,7 nM) e una drastica riduzione dell'Aβ cerebrale negli studi dose-risposta su ratto. [81] Un approccio alternativo per affrontare i due problemi principali dell'aminotiazina 48 consisteva nello sviluppo di aminotiazine sostituite da eteroarile senza il gruppo S3. L’eliminazione della pirimidina ha potenziato la penetrazione cerebrale (riducendo il PM e PSA) e la stabilità metabolica (rimuovendo un gruppo metabolicamente instabile). Il composto 50 (Figura 25) ha mostrato una migliore permeabilità della BBB e, nonostante la sua moderata attività enzimatica (IC₅₀ = 0,15 μM), ha mostrato una significativa riduzione di Aβ nei roditori. 50 era relativamente stabile nei microsomi del fegato di ratto e topo ma instabile nei microsomi umani, a causa dell'ossidazione del gruppo metilico dell'anello isossazolico. La stabilità metabolica di 50 è stata affrontata sostituendo l'anello 6- dimetilisossazolo con un anello pirimidinico. Questo ha portato all’ottenimento di 51 (Figura 25) con una buona permeazione cerebrale e stabilità metabolica e una maggiore attività in vivo nei roditori. Un approccio alternativo all'allargamento della finestra terapeutica di 47 consisteva nel migliorare la selettività per BACE-1 rispetto a CatD. A questo proposito, Butler ha recentemente riportato un approccio riduzionista, lasciando in 47 solo il farmacoforo necessario, valutando poi le opportunità per migliorare la selettività CatD usando la progettazione farmacologica dell'SB, senza influire sulla penetrazione del SNC. Il gruppo ha sviluppato una serie di derivati aminotiazina-THP fusi, sostituiti con una piccola catena laterale per occupare una tasca indotta (S2') formata dal movimento dello strato proteico.

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Questi derivati erano altamente selettivi, mantenendo il profilo PK desiderato, come esemplificato da 52 (Figura 25). I composti hanno mostrato una buona efficacia nel ridurre i carichi di Aβ periferici e centrali in vivo nei modelli di topi e cani. Inoltre, il trattamento cronico in topi PS1/ PP invecchiati ha ridotto il numero e le dimensioni delle placche derivate da Aβ. In particolare, uno studio di tossicologia esplorativa di 2 settimane su 52 non ha rivelato alcuna tossicità retinica.

Nonostante le sue eccellenti proprietà generali, la scarsa potenza in vitro di 52 nei confronti di BACE-1 (IC₅₀ = 1,07 μM) ha comportato l’uso di un'elevata dose umana (> 500 mg / die), che ne ha impedito ulteriori indagini. E' stata progettata una nuova generazione di analoghi eterociclici sostituti di 52 sulla base delle informazioni strutturali disponibili. In particolare, poiché il gruppo fluorometile di 52 ha mostrato di riempire in modo subottimale la tasca di S2, è stato postulato che il posizionamento di un sostituente eteroarile in questa tasca potrebbe migliorare la potenza mantenendo al tempo stesso la lipofilia e l'aggiustamento delle proprietà ADME. Ciò ha portato a potenti inibitori BACE- 1 penetranti nel SNC, rappresentati da 53 in Figura 25 (BACE-1 IC₅₀ = 52 nM, cellula IC₅₀ = 4n M).

Tuttavia, un'ulteriore analisi in vitro con citocromi ricombinanti umani ha dimostrato che CYP2D6 (membro della famiglia citocromo P450, è uno dei più importanti enzimi coinvolti nel metabolismo di xenobiotici nel corpo e molte sostanze vengono da lui bioattivate per formare i loro principi attivi) ha contribuito in modo significativo al metabolismo di 53, causando il coinvolgimento dell’interazione farmaco-farmaco (DDI). Gli sforzi guidati dalla SB per ridurre i problemi del metabolismo del citocromo CYP2D6 di 53 hanno portato a derivati molto potenti, con minor rischio di DDI, efficacia a livello centrale e profili terapeutici hERG migliorati. In particolare, a causa dei loro promettenti profili generali, i composti 54 e 55 (Figura 25) hanno superato gli studi sulla sicurezza a

77 lungo termine, con i risultati attesi a tempo debito.

Come visto, Eli Lilly ha scoperto il composto 47 [80] e, più recentemente, la furo[3,4- d][1,3]tiazin-2-amino picolinammide LY2886721 (56 in Figura 26), un potente BACE- 1 inibitore che ha raggiunto la fase II di studi clinici per trattare l'AD allo stadio iniziale. I ricercatori di Ely Lilly hanno quindi utilizzato un approccio Fragment Based per individuare aminotiazine policicliche topologicamente complesse quali inibitori di BACE- 1. A partire da quantità millimolari del composto hit, la tiazina biciclica 57 (Figura 27), identificata in alta concentrazione in un saggio enzimatico BACE-1, hanno ottenuto i composti Fragment Based-derivati 58 e 59 (Figura 27). [82] I composti 58 e 59 hanno mostrato scarsa efficacia in vitro (IC₅₀ di BACE-1 = 1,83 e 2,25 μM, rispettivamente) e in

vivo (la mancanza di riduzione del cervello dei livelli di Aβ era in accordo con la bassa

esposizione cerebrale). Tuttavia, con questi composti potrebbero essere derivate le principali ipotesi SAR (relazioni struttura-attività). Questi test hanno rivelato che il legame ad S3 potrebbe aumentare notevolmente la potenza di questa serie, ma anche che la conformazione costretta non porterebbe a ulteriori miglioramenti.

78 Figura 27. Aminotiazine 57-59

Bristol-Myers Squibb ha recentemente sviluppato una nuova serie più facilmente accessibile di furo[2,3-d]tiazine, analoghi isosterici di 56, rappresentate da 60 e 61 in Figura 26 (rispettivamente BACE-1 IC₅₀ = 20 e 37 nM,). 60 e 61 hanno mostrato un'attività cellulare paragonabile a quella del composto di partenza 56 e una buona permeabilità in vitro. Tuttavia, hanno dimostrato una bassa esposizione e solo una modesta riduzione dei livelli di Aβ nel cervello dei topi.

79 3.1.3 Imminotiazinani diossido.

La Merck ha recentemente riportato la scoperta e la caratterizzazione di una innovativa classe di inibitori, imminotiadiazinani diossido, di BACE-1, rappresentata dal composto 34 in fase clinica avanzata (Figura 18). Partendo dall'elaborazione dello screening degli hits iniziali con frammento di isotiourea, la successiva ricerca di isosteri eterociclici dell’isotiourea e l’estensiva esplorazione delle SAR del nucleo dell’iminotiazinano diossido, Merck ha sviluppato 34 l'inibitore di BACE-1 altamente ottimizzato. Sulla base del potente inibitore in vitro e in vivo di BACE-1, l'imminopirimidinone 62 (BACE-1 Ki = 1,7 nM) e cercando di identificare nuovi nuclei che legano Asp che potrebbero offrire spazio a proprietà intellettuali inesplorate, è stato sviluppato il diossido iminotiadiazinanico 63 (BACE-1 Ki = 2,4 nM ) (Figura 28).

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Sebbene l'imminotiadiazinano diossido 63 (cellula IC₅₀ = 55 nM) mostrasse una potenza cellulare più debole dell'iminopirimidinone 62 (cellula IC₅₀ = 11 nM), è risultato significativamente più potente in vivo, probabilmente a causa della penetrazione potenziata nel SNC data dal nucleo di imminotiadiazinano. In un test farmacodinamici su ratto, il diossido di imminotiadiazinano 63 ha portato ad una forte riduzione dei livelli di Aβ40 nel fluido cerebrospinale e nella corteccia. Nonostante i profili farmacodinamici favorevoli, l’iminopirimidinone 62 e l’imminotiadiazinano diossido 63 non sono stati ulteriormente sviluppati a causa di problemi metabolici e della modesta selettività per CatD (21 e 47 volte, rispettivamente). Queste due passività sono state superate dall'ottimizzazione SB delle funzioni responsabili del legame in P3 e P1, portando alla scoperta dell'inibitore BACE-1 34 della Merck (BACE-1 Ki = 2,2 nM). Il composto 34 era altamente selettivo per BACE-1 rispetto ad altre proteasi di aspartile, con l'eccezione di BACE-2, e inibiva potentemente la formazione di Aβ nel saggio basato su cellule (cellula IC₅₀ = 2,1 nM). Inoltre 34 ha mostrato un buon profilo PK/PD in modelli preclinici, livelli di fluido cerebrospinale e Aβ cerebrale profondamente abbassati dopo somministrazione acuta e cronica in ratti e scimmie ed è stato portato in fase I di sperimentazione clinica per valutarne la sicurezza, PK, e PD in volontari sani e pazienti con AD lieve o moderata. [71]

Le dosi singole e multiple sono state generalmente ben tollerate e hanno prodotto una riduzione dei livelli di Aβ nel liquido cerebrospinale sia dei soggetti umani sani che dei pazienti con AD. Nel 2012, 34 è entrato in sperimentazione clinica di fase II/III in soggetti con AD lieve o moderata (studio EPOCH) e nel 2013 è stato avviato anche uno studio di fase III per l'AD prodromico (studio APECS). Sebbene l'EPOCH sia stato interrotto di recente per mancanza di efficacia, l'APECS continuerà ad affrontare la questione dei tempi di intervento dell'inibizione di BACE-1 nell'AD (i risultati sono attesi per il febbraio 2019).

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3.1.4 Iminoidantoine

La Merck ha recentemente descritto la progettazione di farmaci SB attraverso lo screening del composto hit, la spiropiperidina iminoidantoina 64 (BACE-1 IC₅₀ = 22 μM, cell IC₅₀ > 30 μM) (Figura 29). [83] Ciò ha portato a composti con una potenza enzimatica e cellulare maggiore rispettivamente di 200 e 90 volte. Questo notevole risultato è stato reso possibile aggiungendo un gruppo metilico in posizione strategica sull'anello piperidinico. Questo gruppo metilico ha mantenuto il pKa richiesto per l'azoto della N-piperidina, si inserisce nella piccola tasca idrofobica e stabilizza la migliore conformazione per il legame ottimale al recettore. È importante notare che il derivato 64 (BACE-1 IC₅0 = 6 nM, cellula IC₅₀ = 63 nM) (Figura 29) mostrava anche una buona selettività rispetto a CatD (IC₅₀ = 16,3 μM) e la riduzione dei livelli di Aβ nel fluido cerebrospinale nei topi e nelle scimmie.

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3.1.5 Amminossazine

Rombouts e collaboratori hanno recentemente descritto nuove 6-F-3-ammino-1,4-ossazine per lo sviluppo di inibitori BACE-1 con una migliore permeabilità del SNC (57). Gli sforzi di ottimizzazione del composto lead hanno messo a punto il pKa dell'amidina e l'attività primaria su BACE-1, ottenendo il composto 66 (IC₅₀ BACE-1 = 7,6 nM, cellula IC₅₀ = 8,1 nM) (Figura 30). 66 era oralmente biodisponibile, attivo a livello centrale ed ha diminuito notevolmente i livelli di Aβ nel cervello e nel fluido cerbrospinale rispettivamente in modelli di topo e cane. Tuttavia, la penetrazione cerebrale deve ancora essere bilanciata in relazione alla stabilità metabolica e la sicurezza cardiovascolare (cioè l'inibizione di hERG).

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3.1.6 Amminochinoline

È stato recentemente sviluppato il potente derivato dell'amino-chinolina 67 progettato-SB (BACE-1 IC₅₀ = 0.8 nM) collegando il noto inibitore BACE-1 68 (BACE-1 Kd = 140 nM) con il frammento che lega S3 69, identificato in uno studio 19_{F NMR (Figura 31). [84]}

L'amminochinolina 34 ha mostrato un aumento di 350 volte dell'affinità di BACE-1 mantenendo una ragionevole efficienza del ligando e ottenendo una selettività molto migliorata rispetto a CatD rispetto al composto di partenza 35.

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