Aprrocci SB per la ricerca di inibitori di BACE-

BACE-1 è stato ampiamente caratterizzato a livello strutturale. L'enzima presenta tre caratteristiche peculiari che dovrebbero essere prese in considerazione nella progettazione dei farmaci. Innanzitutto, il sito di binding di BACE-1 è molto esteso (circa 1000 Å3 _di dimensione) e mostra una forma allungata di oltre 20 À di lunghezza lungo l'asse principale. Di solito, questa tasca è convenzionalmente descritta come una raccolta di siti secondari, che mostrano svariati ambienti chimico-fisici. Recentemente, è stata utilizzata una combinazione di studi di docking e simulazioni di dinamica molecolare (MD) per studiare la selettività di quattro inibitori di BACE-1 rispetto alle proteasi strettamente correlate (BACE-2 e CatD).[85]

Le simulazioni hanno mostrato che questi composti erano troppo voluminosi per adattarsi alla tasca di BACE-2 relativamente stretta e, al contrario, non potevano stabilire interazioni stabili all'interno della tasca più ampia di CatD.

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inibitori di BACE-1. La tasca di legame di BACE-1 è molto flessibile, poiché la flessibilità è strumentale alla catalisi e ci si possono attendere effetti indotti. Ad oggi, su Protein Data Bank per il codice di accessione umano UniProt di BACE-1 (P56817) vengono proposti 355 hit unici. Probabilmente a causa dell'abbondanza delle strutture cristalline combinate con la sua rilevanza farmacologica, BACE-1 è considerato ideale per indagare il ruolo della flessibilità del recettore nel docking e nel virtual screening. Cosconati e colleghi hanno implementato una strategia di docking basandosi su una serie di descrittori ponderati in termini di energia sulla base delle molteplici conformazioni di BACE-1. Il loro metodo ha identificato nuovi chemotipi che mostrano l'attività inibitoria di BACE-1 in uno studio di virtual screening prospettico. Esempi selezionati di inibitori BACE-1 71-73 sono riportati in Figura 33. Il terzo elemento strutturale rilevante è il meccanismo catalitico dell'enzima: la diade aspartica formata da Asp32 e Asp228 e situata al centro del sito di legame. Poiché entrare in contatto con la diade è fondamentale per l'attività inibitoria, diversi studi hanno tentato di identificare lo stato di protonazione dei residui di acido aspartico che favoriscono interazioni più strette. [86] I ligandi che interagiscono con la diade aspartica per mezzo di gruppi chimicamente differenti interagiscono preferenzialmente con diversi stati di protonazione. Diversi stati di protonazione alterano l'ambiente elettrostatico circostante e gli atomi di idrogeno posizionati in modo diverso nelle catene laterali neutre alterano l’insieme dei legami a idrogeno. Una mancata corrispondenza tra un determinato chemotipo e lo stato di titolazione della diade può compromettere l'affidabilità delle predizioni sull’affinità del ligando. Barman e Prabhakar hanno studiato sistematicamente l'effetto di otto riarrangiamenti della diade nelle simulazioni di self-docking eseguite su otto diversi ligandi. Per ogni chemiotipo, hanno identificato uno stato di protonazione che ha fornito i migliori risultati in termini di riproduzione della posa nativa e dell'energia di legame.

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Figura 33. Esempi di inibitori di BACE-1 (71-76) scoperti che utilizzano metodi di scoperta di farmaci assistiti da computer.

Anche quando la conformazione legata è stata riprodotta da più riarrangiamenti di diade, una è spesso emersa come la più favorevole. Ciò ha confermato l'esistenza di un chiaro legame tra la protonazione della diade e la conformazione legata al ligando. Dominguez e colleghi hanno ulteriormente esteso l'idea di migliorare l'accuratezza della docking modulando la protonazione della diade, estendendo i calcoli di pKa a tutti i residui titolabili nel sito di legame di BACE-1. I loro risultati hanno mostrato un piccolo ma significativo miglioramento rispetto ai protocolli in cui alle catene laterali sono assegnati

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stati di default. Bottegoni e colleghi hanno considerato cinque stati di protonazione per la diade in un protocollo di screening virtuale, che è stato appositamente progettato per identificare frammenti multi-target dotati di attività su BACE-1 e sulla glicogeno sinteasi chinasi 3β (GSK-3β, un altro bersaglio noto per il trattamento di AD). [87] I punteggi di legame alla protonazione frammento-diade sono stati valutati sistematicamente e a ciascun composto è stato assegnato il punteggio migliore generato. È interessante notare che l'unico frammento dotato di doppia attività su entrambi i target 74 (Figura 33), interagiva preferenzialmente con la variante BACE-1 mostrando una diade dideprotonata.

Negli studi di cui sopra, la flessibilità proteica e la protonazione della diade sono state considerate questioni quasi indipendenti. Kacker e colleghi hanno combinato i calcoli di docking, quantum-mechanical (QM) e MD per indagare i ruoli svolti dalla protonazione della diade e la flessibilità delle proteine al fine di identificare nuovi inibitori di BACE-1 mediante screening del ligando virtuale. I risultati ottenuti dimostrano che le due variabili dovevano essere considerate insieme al fine di ottenere un arricchimento significativo in termini di numero di composti attivi e della loro diversità chimica.

Ciò potrebbe spiegare perché, fino a poco tempo fa, i metodi computazionali, che si concentravano su uno solo di questi due aspetti alla volta, non svolgevano un ruolo chiave nell'identificazione degli inibitori di BACE-1. Infatti, MD è una tecnica il cui ruolo nella scoperta di farmaci è cresciuto costantemente negli ultimi anni. Dal lavoro pionieristico di Park e Lee, MD è stato utilizzato, da solo o in combinazione con tecniche QM, per investigare e protonizzare. Più recentemente, le simulazioni di pH MD (CpHMD) hanno prodotto approfondimenti rilevanti nella diafonia tra stati di protonazione e conformazioni proteiche. L'implementazione CpHMD originale include il pH come termine termodinamico aggiuntivo nel classico MD. I cambiamenti nello stato di protonazione dei residui titolabili sono stati introdotti lungo la traiettoria mediante una procedura di

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Metropolis Monte Carlo (MMC). CpHMD può essere incorporato in una struttura di scambio di repliche, consentendo lo scambio di pH tra repliche adiacenti. Ciò migliora significativamente il campionamento, generando in modo molto più efficiente un insieme termodinamico convergente in spazi sia conformazionali che di protonazione. Lo scambio MD a scambio di pH costante (pH-REMD) è stato utilizzato per chiarire, a livello molecolare, il ruolo del pH nel substrato e nel legame degli inibitori. BACE-1 esiste in più stati conformazionali. Al suo pH di lavoro (tra 2,5 e 4,5), la conformazione cataliticamente attiva è la più popolata.

I valori di pH al di fuori di questo intervallo spostano l'equilibrio termodinamico verso i conformeri auto-inibiti, non cataliticamente competenti. In un altro studio, Kim e colleghi hanno utilizzato il pH-REMD costante per calcolare i profili di energia libera vincolante dipendenti dal pH associati a inibitori selezionati di BACE-1. Hanno riportato come errori di calcolo di energia libera superiori a 8 kcal / mol possono essere causati assegnando erroneamente lo stato di protonazione sia della diade catalitica che di altri residui titolabili che circondano il macchinario catalitico. Il pH-REMD costante è stato anche usato per spiegare retrospettivamente una differenza di affinità perplessa tra due inibitori strutturalmente correlati di BACE-1. Anche le strutture cristallografiche ad alta risoluzione dei complessi associati non possono spiegare la differenza di potenza, dal momento che le due molecole interagivano con l'enzima con orientamenti comparabili e contattando gli stessi residui. Le simulazioni hanno spiegato come, nel range di pH operativo di BACE-1, le differenze strutturali tra questi composti, anche se molto sottili, fossero ancora abbastanza pronunciate per stabilizzare diversi stati di protonazione nella diade, alterando il modello di legame H circostante e infine la diversa potenza .

Nelle fasi più avanzate della scoperta di farmaci, l'attenzione della ricerca si sposta dall'identificazione di nuovi composti all'ottimizzazione dei colpi identificati. Gli inibitori

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di BACE-1 sono stati studiati con successo usando protocolli che stimano la relativa variazione di energia libera vincolante associata a una modifica strutturale di una molecola. L'idea è di esplorare lo spazio chimico attorno a un'impalcatura interessante per identificare quei sostituenti che portano a affinità migliorate o, più in generale, un profilo farmacologico migliore. In questa fase, l'utilizzo di questi metodi più computazionalmente impegnativi è accettabile perché, in media, ci sono meno molecole da indagare. Ciordia e colleghi hanno utilizzato la perturbazione a energia libera (FEP) per indagare su una serie di inibitori spirociclici contenenti BACE-1 contenenti ammidina. Targeting di subpocket specifici sul sito di legame BACE-1, hanno prima calibrato la procedura FEP su dati retrospettivi per identificare il miglior trade-off tra la completezza del campionamento e la correlazione con i valori sperimentali dell'output di simulazione.

Gli autori hanno sottolineato l'importanza di eseguire tali calcoli entro un arco di tempo accettabile per una campagna di scoperta di farmaci, in particolare in un contesto industriale. Hanno quindi applicato il protocollo ottimizzato per prevedere nuovi composti. Dopo la sintesi e la valutazione biologica, le potenze previste per gli spiroaminodiidropirroli sinimetrici (esemplificate da 75 in Figura 33) erano in discreto accordo con i risultati sperimentali. Oltre al tempo di calcolo, i calcoli FEP sono anche limitati perchè previsioni affidabili non possono essere raggiunte per modifiche più radicali Per superare questo Keran̈en e colleghi hanno recentemente riportato un approccio "core hopping FEP +" che è stato applicato con successo a una serie di inibitori BACE-1 portatori di acilguanidina (esemplificato dal composto 76 nella Figura 33). Confrontando l'esito computazionale con i risultati sperimentali, la corrispondenza era molto accurata per le sostituzioni locali e, sebbene leggermente meno accurata, ancora incoraggiante quando venivano tentate modifiche più radicali all'armatura. È interessante notare che, quando si esamina l'effetto del campionamento nell'ottenere calcoli convergenti, più brevi tirature

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hanno restituito risultati più accurati di una singola traiettoria più estesa.

In sintesi, sono stati scoperti e descritti nuovi composti hit, lo studio dei farmaci relativi a BACE-1 assistito da computer rimane ancora oggi una sfida. Questo target multiforme limita fortemente l'affidabilità dei protocolli standard di individuazione e ottimizzazione di hit mediante metodi computazionali. In linea con una tendenza generale e diffusa alla scoperta di farmaci [88], metodi più complessi e dispendiosi in termini di tempo basati su MD, QM e metodi di campionamento avanzati, finora applicati in modo quasi esclusivamente retrospettivo, potranno svolgere un ruolo sempre più importante nello sviluppo futuro di nuovi inibitori di BACE-1.