Analisi del contenuto in azoto e fosforo

La determinazione del contenuto fogliare dio (N) e (P) delle piante di O. basilicum cv. Tigullio è stata effettuata al T15 e i risultati sono evidenziati in Tabella 21.

Tabella 21: Contenuto in azoto (N) e fosforo (P) al tempo 15 di O. basilicum non inculato (C), inoculato con

ceppi batterici selezionati (B), con micorrize arbuscolari (M) e con batteri e micorrize (MB). I valori rappresentano la media di 3 repliche e medie seguite da lettere uguali non sono significativamente diverse per P=0,05. N (mg g-1 DW) P (mg g-1 DW) Trattamenti C 23,46±2,46 ab 6,51±0,25 a B 29,26±1,43 a 6,57±0,13 a M 17,87±1,04 bc 5,45±,078 b MB 15,86±0,56 c 5,14±0,24 b

I risultati hanno mostrato una diminuzione di entrambi gli elementi nutritivi nelle tesi con l’inoculo micorrizico (M) e micorrizico con batteri (MB), evidenziando, invece, un aumento nel contenuto in N nella tesi trattate con batteri (B) e valori costanti, rispetto al controllo (C), del contenuto in P nella tesi con l’inoculo batterico (B). Generalmente, in letteratura (Frey-Klett et al., 2007; Toro et al., 1997; Jayasinghearachchi et al., 1997) viene riportato un incremento dei valori in P e N in seguito a duplice inoculazione con le micorrize e i batteri (MB). È comunque necessario considerare che, tale miglioramento nella nutrizione di questi due elementi avviene grazie al fungo AM che, a seguito dell’avvenuta interazione simbiontica con la pianta, è capace di apportare tali minerali, che vengono solubilizzati dai microrganismi a vita libera. Alle volte, comunque, l’azione sinergica dei due bioinoculi non porta alla manifestazione evidente di tutti i parametri di crescita (Barea et al., 2004; Miransari et al., 2010; Philippot et al., 2013).

59

3.7 Analisi molecolari

A livello della rizosfera la diversità microbica è a sua volta influenzata dall’attività e dal numero di microrganismi che vi si trova a vivere in prossimità dell’apparato radicale (Kennedy 1998). Le interazioni del microbiota batterico sono note per influenzare lo stato e la qualità delle piante (Lynch 1990), ma non tutte le interazioni hanno gli stessi effetti, suggerendo un certo livello di selettività nelle interazioni tra pianta e microbiota, presumibilmente dovuto a un lungo processo di adattamento nell’ecologia microbica della rizosfera (Azcòn 1989). Nell’ambito della presente tesi, allo scopo di analizzare l’impatto dei bioinoculi sulla diversità della comunità batterica della micorrizosfera del basilico, è stata utilizzata una tecnica molecolare, quale la PCR-DGGE.

Tale tecnica permette la separazione di amplificati aventi la stessa lunghezza, ma diversa sequenza mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con gradiente di denaturanti chimici. Il DNA estratto direttamente da campioni di suolo è utilizzato per l’amplificazione mediante PCR di una regione variabile del 16S rDNA. Per ciascun campione è così possibile ottenere un profilo della comunità microbica in cui ciascun frammento corrisponde ad una specie (Stamper et al., 2003; Hoefel et al., 2005; Miura et al., 2007), e l’intensità dei frammenti è un indice della maggiore o minore presenza delle specie all’interno della popolazione microbica (Dar et al., 2005; Connaughton et al., 2006). Tuttavia, frammenti di DNA di sequenza diversa possono avere caratteristiche di mobilità simili nel gel di poliacrilammide e co-migrare nella stessa posizione (Gelsomino et al., 1999; Sekiguchi et al., 2001; Speksnijder et al., 2001). Inoltre, una singola specie microbica può dare origine a bande multiple, dato che i microrganismi possiedono più operoni per i geni ribosomiali, le cui sequenze possono essere lievemente differenti tra di loro (Brosius et al., 1981; Nübel et al., 1997). Tale tecnica è stata impiegata per confrontare i profili delle comunità batteriche presenti nei campioni corrispondenti alle diverse tesi della prova in vaso al tempo 0 (dopo 27 gg dalla semina) e al tempo 15 (dopo 30 gg dalla semina). I profili, ottenuti dalla separazione elettroforetica su gel denaturante di poliacrilammide degli amplificati della regione V3-V5 del DNA ribosomiale estratto dai campioni analizzati, sono riportati in Figura 5.

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Figura 5: Profili DGGE dei prodotti PCR delle regioni V3-V5 del 16S rDNA al tempo 0 e al tempo 15 di Ocimum basilicum non inculato (C), inoculato con ceppi batterici selezionati (B), con micorrize arbuscolari

(M) e con batteri e micorrize (MB). Marker (lane:1, 10, 19): Sinorhizobium meliloti TSA 41, Sinorhizobium

meliloti CH 17; Nocardioides sp. N13; Arthrobacter phenanthrenivorans N17, Streptomyces sp. W43.

Dai risultati ottenuti è possibile evidenziare differenze tra i profili ottenuti dai campioni al tempo 0 e al tempo 15. Infatti quest’ultimi appaiono più complessi e intensi rispetto a quelli presenti al tempo 0, evidenziando una maggiore complessità sia quantitativa, che qualitativa della comunità batterica al tempo 15. I profili PCR-DGGE sono stati elaborati mediante analisi cluster e il dendrogramma ottenuto è riportato in Figura 6.

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Figura 6: Dendrogramma ottenuto con il metodo di clustering UPGMA sulla base dei profili DGGE della comunità

batterica associata alla micorrizosfera delle piante di Ocimun basilicum cv. Tigullio. Ognuna delle 4 tesi è stata analizzata a T0 e T15 e per ognuna sono state fatte due repliche: C01, C02, B01, B02, M01, M02, BM01, BM02, C151, C152, B151, B152, M151, M152, BM151, BM152; il Marker (M): miscela di frammenti dei geni 16S rRNA dei batteri selezionati:

Sinorhizobium meliloti, Nocardioides fulvis, Arthrobacter phenanthrenivorans, Streptomyces collinus. Le relazioni tra i

campioni sono basate sulla somiglianza valutata utilizzando il coefficiente di Dice. Bootstrap (1.000 repliche) non sono visualizzati i valori inferiori a 50.

Il dendrogramma mostra due clusters principali, che presentano una bassa percentuale di similarità (36%): il primo comprende i campioni prelevati al tempo T0 e il secondo quelli prelevati al tempo T15. In particolare, nel cluster corrispondente al T0, i campioni del controllo (C) si raggruppano in un cluster separato, che presenta un livello di similarità del 64% con il secondo cluster comprendente le tesi trattate con batteri (B), con micorrize (M) e con micorrize e batteri (MB). All’interno di quest’ultimo le tesi comprendenti i trattamenti con le micorrize (M e MB) appaiono più simili tra loro raggruppandosi ulteriormente al 79% di similarità.

62 A differenza del tempo 0, nel cluster corrispondente al T15 i campioni del controllo (C) si raggruppano (similarità del 68%) con un cluster comprendente le tesi trattate con micorrize (M) e con micorrize e batteri (MB). Mentre, i campioni trattati con i batteri singolarmente si ritrovano in un cluster separato che presenta un 63% di similarità rispetto agli altri.

Dai risultati ottenuti è possibile evidenziare che gli inoculi batterici e micorrizici hanno dato origine ad una modificazione della popolazione batterica rispetto al controllo già dopo 27 giorni dall’inizio della prova. Dopo 42 giorni la tesi in cui sono stati addizionati i batteri singolarmente risulta quella che evidenzia una maggiore modificazione della popolazione batterica rispetto al controllo.

I profili PCR-DGGE sono stati inoltre elaborati per calcolare gli indici di biodiversità, Richness (S), Shannon-Weaver (H), Simpson (D) e Evenness (E), riportati in Tabella 22. Tali indici stimano la diversità delle popolazioni microbiche basandosi sia sul numero che sull’intensità dei frammenti ottenuti nei diversi profili DGGE.

Tabella 22: Indici di Richness (S), Shannon-Weaver (H), Simpson (D) ed Evenness (E) dei profili DGGE

della comunità batterica della micorrizosfera relativi alla prova in vaso con Ocimum basilicum non inculato (C), inoculato con ceppi batterici selezionati (B), con micorrize arbuscolari (M) e con batteri e micorrize (MB) al tempo 0 (T0) e 15 (T15). I dati (Media±ES) con differenti lettere sono significativamente diversi (P < 0,05).

Indice Tempo Trattamento

C B M MB S T0 7,50±0,41 ef 13,00±0,82 c 10,00±0,00 de 6,50±0,41 f T15 20,00±0,00 a 16,50±0,41b 12,50±0,41 cd 16,00±0,00 b H T0 2,01±0,05 de 2,50±0,09 bc 2,30±0,00 cd 1,87±0,06 e T15 2,99±0,00 a 2,78±0,01 ab 2,52±0,04 bc 2,76±0,00 ab D T0 0,13±0,01 ab 0,08±0,01 cd 0,10±0,00 bc 0,15±0,01 a T15 0,05±0,00 d 0,06±0,00 d 0,08±0,00 cd 0,06±0,00 d E T0 0,99 ±0,00 a 0,97 ±0,01 a 0,99 ±0,00 a 0,99 ±0,00 a T15 0,99 ±0,00 a 0,99 ±0,00 a 0,99±0,00 a 0,99±0,00 a

63 Gli indici di biodiversità evidenziano come le tesi non inoculate e inoculate risultino diverse tra di loro sia come numero (S) che intensità dei frammenti (H). In particolare, a 27 giorni dall’inizio della prova (T0), la diversità delle popolazioni batteriche risulta maggiore nelle tesi inoculate con batteri (B); mentre a 42 giorni dall’inizio della prova (T15) si nota una riduzione della diversità della popolazione microbica nelle tesi bioinoculate, rispetto al controllo.

Ai fini di identificare le specie maggiormente rappresentative nei profili DGGE dei diversi campioni, i frammenti di interesse (Figura 7) sono stati excisi e il DNA è stato amplificato e sottoposto a sequenziamento. Le sequenze, sono state analizzate per determinare l’omologia con le sequenze depositate in banca dati e la loro elaborazione ha permesso l’ottenimento dell’albero filogenetico riportato in Figura 8.

64

Figura 7: Profili DGGE dei prodotti PCR delle regioni V3-V5 del 16S rDNA al tempo 0 e al tempo 15 di Ocimum basilicum non inculato (C), inoculato con ceppi batterici selezionati (B), con micorrize arbuscolari

(M) e con batteri e micorrize (MB). Marker (lane:1, 10, 19): Sinorhizobium meliloti TSA 41, Sinorhizobium

meliloti CH 17; Nocardioides sp. N13; Arthrobacter phenanthrenivorans N17, Streptomyces sp. W43. I

frammenti di interesse prelevati e sequenziati sono indicati con il numero ed il marcatore colorato che indica l’ordine di appartenenza risultante dall’omologia delle sequenze in banca dati.

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Figura 8: Affiliazione delle sequenze derivanti dai frammenti DGGE (numerati in Fig. 5) con le sequenze

presenti in banca dati delle regioni V3-V5 del 16S rDNA. L’albero filogenetico è stato costruito con il metodo Neighbor-Joining. I valori di Bootstrap minori di 70 non sono indicati. Le sequenze del database sono indicate con il loro numero di riferimento.

I risultati ottenuti evidenziano la presenza di specie appartenenti ai seguenti ordini: Oscillatoriales, Bacillales, Rhizobiales, Bactereolidales, Xanthomonadales, Burkholderiales, Cytophagales e Sphingobacteriales.

Dal confronto dei profili DGGE ottenuti è possibile evidenziare come le maggiori differenze rispetto al controllo siano state rilevate nelle tesi in cui sono stati addizionati i batteri singolarmente, dove sono presenti sia nuovi frammenti (10 e 11) che alcuni frammenti comuni con maggiore intensità (6, 8, 9 e 19). In particolare, tra questi ritroviamo i frammenti 10 e 11 corrispondenti rispettivamente a Bacillus firmus e B. subterraneus e i frammenti 6, 8, 9 e 19 corrispondenti rispettivamente a Nodosilinea nodulosa, Pontibacter populi, Massilia spp. e ad un batterio non coltivabile appartenente alle Chitinophagaceae. Tali risultati indicherebbero che l’impiego dell’inoculo contenente solo batteri

66 potrebbe aver indotto, da una parte, la comparsa nella porzione di suolo micorrizosferico di nuove specie o il loro passaggio dalla soglia di non rilevamento a quella di rilevamento, dall’altra, un aumento della popolazione delle specie corrispondenti alle bande che si sono intensificate.

Per quanto riguarda i campioni inoculati solo con micorrize (M0) e con micorrize e batteri (MB0), non si evidenzia la comparsa di frammenti più intensi, anche se ne compaiano alcuni nuovi, tra cui il frammento 12, presente anche nella tesi B0, la cui sequenza è risultata omologa a Massilia aurea.

67

4. CONSIDERAZIONI

CONCLUSIVE

Nell’ambito della presente tesi, piante di Ocimum basilicum L. (cv. Tigullio) sono state utilizzate in una prova in vaso, tesa a determinare il valore nutraceutico di tali piante in associazione con i funghi micorrizici arbuscolari e/o i batteri ad essi associati, come biofertilizzanti e biostimolanti. In particolare, è stato utilizzato il fungo R. intraradices IMA6 inoculato da solo e/o in combinazione con 5 diverse specie batteriche precedentemente isolate dalle stesse spore del fungo e selezionate per le loro spiccate attività PGP (Plant Growth Promoting). Le indagini biochimiche sono state incentrate sulla valutazione dell’impatto degli inoculi su: contenuto in fenoli totali, contenuto di acido ascorbico (forma ridotta e ossidata) e capacità antiossidante totale dell’estratto (saggio DPPH). L’impatto dei bioinoculi sullo stato di salute delle piante è stato valutato mediate fluorescenza della clorofilla a.

Inoltre, per costatare l’effetto dei bioinoculi utilizzati, è stato anche analizzato il contenuto in fosforo (P) e azoto (N) totale delle piante, la variazione di biomassa vegetale e l’impatto che i bioinoculi hanno avuto sull’ecologia microbica della rizosfera.

Dai risultati ottenuti è possibile trarre le seguenti considerazioni conclusive:  I 5 ceppi batterici selezionati e utilizzati nella prova sperimentale

appartengono alle specie Streptomyces spp., Arthrobacter phenanthrenivorans, Nocardioides spp. e Sinorhizobium meliloti, noti in letteratura per le loro attività PGP.

 La determinazione del peso fresco e secco ha evidenziato che non ci sono state sostanziali modificazioni della biomassa in tutte le tesi trattate se confrontate con il controllo. Anche la determinazione del contenuto in N e P non ha mostrato incrementi nelle tesi trattate.

 Risultati positivi sono stati ottenuti dall’analisi della capacità antiossidante totale (DPPH), incrementata di molto nelle piante inoculate con il consorzio batterico e micorrizico. Questo avvalora alcuni dati riportati in letteratura, in

68 cui la doppia inoculazione, batterica e fungina, incrementa i livelli di antiossidanti nelle piante testate.

 La determinazione del contenuto in fenoli totali ha evidenziato una spiccata produzione di questi metaboliti nelle tesi trattate con l’inoculo micorrizico (M) e batterico (MB).

 Risultati positivi e originali sono stati ottenuti nell’analisi del contenuto in acido ascorbico. Infatti, è stato evidenziato che questo metabolita tende ad aumentare, in misura abbastanza omogenea, in tutte le tesi trattate sia con micorrize (M) che con batteri (MB, B).

 Dai risultati ottenuti dalla fluorescenza della clorofilla a è stato possibile evidenziare che non vi sono evidenti alterazioni del processo fotosintetico nelle diverse tesi.

 Mediante la tecnica molecolare PCR-DGGE è stato evidenziato l’impatto degli inoculi sulla comunità microbica rizosferica e micorrizosferica.

Il sequenziamento dei principali frammenti dei profili DGGE ha permesso di evidenziare la presenza di specie batteriche appartenenti ai seguenti ordini: Oscillatoriales, Bacillales, Rhizobiales, Bactereolidales, Xanthomonadales, Burkholderiales, Cytophagales e Sphingobacteriales.

In conclusione, i risultati ottenuti nell’ambito del presente lavoro di tesi evidenziano la possibilità di impiego di microrganismi benefici in qualità di biofertilizzanti e biostimolanti per promuovere la produzione di sostanze di alto valore nutraceutico in piante di interesse alimentare.

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