3. RISULTATI E DISCUSSIONE
3.1 Identificazione dei ceppi batterici mediante analisi molecolari
I batteri con spiccate attività PGP rivestono un ruolo fondamentale nello stimolare la crescita dei vegetali d’interesse alimentare. Infatti, tali microrganismi, a seguito di interazioni dirette e indirette con la pianta, ne favoriscono la nutrizione e ne migliorano la salute (Compant et al., 2005; Solano et al., 2008; Teng Yang et al., 2013)
Le attività di questi batteri si esplicano anche in associazione con gli AMF. Da questa associazione la pianta può migliorare significatamene la sua crescita e influenzare la produzione di metaboliti secondari. La presenza dei PGPB non è esclusiva della rizosfera, ma questi possono anche instaurare una stretta associazione con le ife e le spore degli AMF (Barea et al., 2004; De Boer et al., 2005; Phillipot et al., 2013).
Nell’ambito della presente tesi, 5 ceppi batterici isolati da spore di R. intraradices IMA6 e selezionati per le loro spiccate attività PGP sono stati caratterizzati con metodi molecolari, allo scopo di utilizzarli come biofertilizzanti e biostimolanti in associazione con gli AMF, nell’ambito di una prova in vaso con la pianta Ocimum basilicum L. (cv. Tigullio). I risultati delle omologie delle sequenze del 16S rDNA dei 5 ceppi batterici analizzati (W 43, N 17, N 13, CH 17 e TSA 41) con quelle presenti in banca dati sono riportati in Tabella 17 e in Figura 2.
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Tabella 17: Specie batteriche isolate dalle spore di R. intraradices IMA6 identificate mediante
sequenziamento del gene 16S rRNA
Ceppi Affiliazione filogenetica (numero di accessione) % identità
W43 Streptomyces collinus (NR_041063.1) Streptomyces violaceochromogenes (NR_043373.1) Streptomyces iakyrus (NR_041231.1) 99% 99% 99% N17 Arthrobacter phenanthrenivorans (NR_074770.1) 100% N13
Nocardioides albus (AF004997.1) Nocardioides fulvus (AF005016.1)
99% 99%
CH17 Sinorhizobium meliloti (KC172024.1) 99%
TSA41 Sinorhizobium meliloti (GU129568.1) 99%
Figura 2: Affiliazione delle sequenze del 16S rDNA dei 5 ceppi batterici analizzati con le sequenze presenti
in banca dati. L’albero filogenetico è stato costruito con il metodo Neighbor-Joining. I valori di Bootstrap minori di 70 non sono indicati. Le sequenze del database sono indicate con il loro numero di riferimento.
I risultati ottenuti evidenziano come tre isolati siano stati identificati appartenenti all’ordine degli Actinomycetales. In particolare, l’isolato W 43 è stato identificato come appartenente al genere Streptomyces, l’isolato N 17 come Arthrobacter phenanthrenivorans e l’isolato N 13 come appartenente al genere Nocardioides. Gli isolati CH 17 e TSA 41 sono stati identificati come entrambi appartenenti alla specie Sinorhizobium meliloti.
50 Tra i ceppi batterici identificati come attinobatteri, il ceppo W 43 è stato isolato su Waksman, mezzo microbiologico specifico per attinobatteri, i ceppi N 17 e N 13, invece, sono stati isolati su mezzo selettivo per azotofissatori.
La capacità di fissare l'azoto è una caratteristica non diffusa tra gli attinobatteri, anche se in letteratura alcuni attinobatteri azoto fissatori sono noti. In particolare, il genere Frankia è noto fin dagli anni settanta per la sua capacità di formare simbiosi azotofissatrici con specie vegetali arboree non leguminose, quali Alnus spp., Casuarina spp., Myrica spp. (Bond, 1976). Tuttavia, la fissazione dell’azoto non avviene esclusivamente nei batteri del genere Frankia. Studi hanno evidenziato che alcune specie di Arthrobacter, Agromyces, Corynebacterium, Mycobacterium, Micromonospora, Propionibatteria e Streptomyces possono essere capaci di fissare l’azoto (Sellstedt et al., 2013).
Tra tutti gli isolati analizzati, due sono stati identificati come appartenenti alla specie Sinorhizobium meliloti. In particolare, il ceppo TSA 41 è stato isolato su Tryptic soy agar, mezzo microbiologico generico per i batteri; mentre il ceppo CH 17 è stato isolato sul mezzo selettivo per i batteri chitinolitici (Tabella 17 e Figura 2). La capacità di produrre enzimi chitinolitici non è una proprietà comune del genere Rhizobium, sebbene alcuni lavori evidenzino tale attività. In particolare, Mazen et al. (2008) hanno valutato l’attività chitinolitica di tre isolati appartenenti al genere Rhizobium: M.L, L.C4, T.S1. I risultati hanno mostrato che tutti e tre gli
isolati erano capaci di produrre enzimi chitinolitici, evidenziando il ceppo L.C4
come il maggiore produttore. Inoltre Krishnan et al., (1999) hanno studiato l’attività chitinolitica in Sinorhizobium meliloti RCR2011, reputata responsabile della limitata nodulazione radicale in Medicago sativa L.
I generi da noi identificati sono noti in letteratura per possedere caratteri PGP. In particolare varie specie di batteri appartenenti a Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Enterobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus, Methylobacterium e Serratia sono riportate migliorare la crescita delle piante (Gopal et al., 2012) mediante meccanismi diretti e indiretti, tra cui:
- produzione di regolatori della crescita come l’acido indolacetico (IAA), l’acido giberillinico, la citochinina e l’etilene;
51 - attività antagoniste contro microrganismi fitopatogeni, tramite la produzione di siderofori, β-1,3-gluconasi, chitinasi e pigmenti fluorescenti;
- solubilizzazione dei fosfati e di altri minerali.
Anche il genere Streptomyces è noto in letteratura per le sue caratteristiche PGP, in particolare per il suo ruolo nel biocontrollo, grazie alla produzione di sostanze ad attività antibiotica. Berg (2009) ha utilizzato come fungicida biologico per il controllo dei funghi patogeni del suolo un bioinoculo commerciale contenente Streptomyces griseoviridis K61. In alcuni lavori è stato inoltre evidenziato come Streptomyces spp. sia capace di attivare difese in Arabidopsis thaliana nei confronti di patogeni batterici (Compant et al., 2005).
Inoltre, specie appartenenti al genere Nocardioides sono note per stimolare la crescita delle piante. In particolare Nocardioides sp. ceppo AN4-4 è in grado di biodegradare l’atrazina (Satsuma 2009), mentre Nocardioides sp. JS614 biodegrada la nicotina (Cobzaru et al., 2011). Queste attività sono finalizzate all’ottenimento di composti biologicamente utili per la costituzione d’importanti molecole richiedenti azoto, che aiutano lo sviluppo della pianta e, contemporaneamente risanano il suolo. Lo studio di Conn e Franco (2004) ha evidenziato che Nocardioides albus EN46 induce un aumento della popolazione attinobatterica endofita indigena delle radici di grano, favorendo la colonizzazione rizosferica di tali PGPB.
Svolgendo tali attività i PGPB possono essere considerati una valida alternativa all’impiego di fertilizzanti chimici, e venire perciò impiegati nei sistemi agricoli sostenibili in qualità di biostimolanti e agenti di biocontrollo (Gray et al., 2005).