Attraverso il dispositivo microfluidico che ho costruito sono state testate diverse formulazione di sintesi di NP di PLGA. Per mettere a punto un protocollo, i singoli parametri di sintesi (Tabella 3 nel capitolo “Materiali e metodi”) sono stati analizzati uno per volta mantenendo fissi tutti gli altri. Al termine di ogni sintesi, ho analizzato le NP prodotte con il DLS per misurare il diametro, IPD e potenziale Z.
Per i primi test ho sintetizzato NP vuote. Il primo parametro che ho analizzato è il flusso totale di liquido iniettato nel chip microfluidico. Mantenendo costante la concentrazione di PLGA a 10 mg/ml e la FA costituita solo da acqua, ho confrontato le NP prodotte utilizzando un flusso totale di 15 µl/min con quelle prodotte utilizzando un flusso totale di 10 µl/min. In entrambe le condizioni ho notato che dopo circa 15 min dall’inizio della sintesi si verificava un accumulo di PLGA nel canale centrale, precisamente nel punto in cui i tre flussi laminari si congiungevano in un unico flusso e iniziava la diffusione del polimero nella FA. Continuando la sintesi, questo accumulo determinava una occlusione completa del canale centrale (Figura 18).
Figura 18. Immagine al microscopio ottico del chip microfluidico dopo 15 min di sintesi un flusso totale di 15µl/min e una concentrazione di PLGA di 10 mg/ml. Al livello dell’interfaccia che si crea nel canale centrale si forma un accumulo di PLGA che a lungo andare strozza il flusso della fase organica.
In seguito, ho analizzato il diametro idrodinamico e l’IPD delle NP con lo strumento DLS e ho riportato in Tabella 5 i valori medi tra le sintesi che ho effettuato. Le dimensioni delle NP prodotte con un flusso totale di 15 µl/min erano minori rispetto a quelle prodotte con un flusso totale più basso. Questi dati vengono confermati da molti studi che descrivono come un flusso totale maggiore determini la formazione di NP con dimensioni e IPD mediamente minori58. Un esempio è lo studio di Chiesa e colleghi
che hanno impiegato un flusso totale di 10 ml/min per sintetizzare in un chip microfluidico NP di PLGA con diametro medio di 100 nm32. Un flusso totale alto crea
nel canale centrale una piccola frazione di FO dispersa nella FA. In questo modo, quando il PLGA si aggrega in NP viene sfavorita l’ulteriore aggiunta di unimeri di polimero e le dimensioni rimangono piccole. La pompa che ho utilizzato per effettuare la sintesi di NP permette di iniettare il liquido nel chip microfluidico con un flusso totale massimo di 15 µl/min. Per questo motivo ho scelto di continuare i miei esperimenti usando un flusso totale di 15 µl/min.
Come detto precedentemente, nonostante sia stato applicato il flusso totale massimo consentito, durante la sintesi il PLGA si accumulava nel canale centrale. Per cercare di ovviare a questo problema ho proceduto confrontando diverse concentrazioni di PLGA, utilizzando anche in questo caso una FA costituita solo da acqua. Ho condotto diverse sintesi, sia con il PLGA 8 mg/ml che 10 mg/ml (Tabella 5). Le NP sintetizzate con la concentrazione di PLGA di 10 mg/ml hanno un diametro medio maggiore di 200 nm, mentre la condizione di 8 mg/ml determinava NP con diametro medio minore (186±5 nm) e con un IPD più ristretto (0.15±0.01). Inoltre, la concentrazione minore di PLGA permette di effettuare la sintesi di NP senza un eccessivo accumulo di PLGA nel canale centrale. Confrontando le condizioni sperimentali di sintesi e le caratteristiche chimico-fisiche delle NP ho scelto di continuare il mio lavoro utilizzando una concentrazione di PLGA di 8 mg/ml.
Tabella 6. Tabella riassuntiva delle caratteristiche chimico-fisiche delle NP sintetizzate analizzando il flusso totale e la concentrazione di PLGA. I valori che vengono riportati sono il diametro medio, l’IPD medio e le relative deviazioni standard (DS).
N° sintesi effettuate Flusso totale (Nl/min) Concentrazione di PLGA (mg/ml) Diametro ± DS (nm) IPD ± DS 2 10 10 274±9 0.20±0.02 2 15 10 202±9 0.18±0.01 2 15 8 186±5 0.15±0.01
Il terzo parametro che è stato analizzato è la percentuale di sodio colato presente nella FA (Tabella 7). Il tensioattivo sodio colato è una molecola anfifilica e ha la funzione di migliorare la miscibilità tra le due fasi. La coda lipofila del sodio colato si orienta verso la FO e la porzione idrofila si orienta verso l’acqua, permettendo la stabilizzazione delle NP in formazione75. Sono state testate concentrazioni crescenti di sodio colato in acqua
e per scegliere la condizione migliore ho valutato di nuovo il diametro e l’IPD delle NP prodotte. Dagli esperimenti effettuati ho notato che, aumentando la percentuale di sodio colato nella FA, le caratteristiche delle NP si allontanando dai valori ideali. La FA con l’1% e il 2% di sodio colato non sono compatibili con la condizione sperimentale che ho analizzato poiché un’alta concentrazione di tensioattivo interferisce con la formazione delle NP. Una grande percentuale di tensioattivo nella formulazione ha determinato la formazione di NP di piccole dimensioni poiché sulla loro superficie si dispone il sodio colato che ha impedito l’aggregazione di più molecole di PLGA. Analizzando le caratteristiche delle NP prodotte con il 2% di sodio colato nella FA ho notato un diametro medio di 104±2 nm e un IPD ampio (maggiore di 0.3) (Figura 19). Dal momento che il mio obiettivo è sintetizzare NP con un IPD minore di 0.2, queste
Figura 19. Immagine che rappresenta i grafici ottenuto al DLS dell’analisi delle dimensioni delle NP sintetizzate con un flusso totale del liquido di 15 µl/min, una concentrazione di PLGA di 8 mg/ml e il 2% di sodio colato nella FA. Il grafico descrive l’intensità della luce deviata dalle NP in funzione del loro diametro (size). La distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle è simile a una curva bimodale, indice del fatto che nel campione sono presenti due popolazioni di NP con diametri differenti.
La percentuale di sodio colato che si è rivelata essere la migliore è lo 0.5% poiché le NP prodotte hanno un diametro medio di 183±1nm e un IPD di 0.13±0.02, in linea con i valori ottenuti dalle sintesi precedenti senza l’impiego di tensioattivo. La presenza dello 0.5% di sodio colato nella FA ha contribuito ulteriormente a ridurre l’accumulo di PLGA nel canale centrale poiché ha consolidato la stabilità delle NP. Con l’utilizzo di questa formulazione ho potuto effettuare una sintesi in continua per oltre 1h.
Figura 20. Immagine che rappresenta i grafici ottenuto al DLS dell’analisi delle dimensioni delle NP sintetizzate con un flusso totale del liquido di 15 µl/min, una concentrazione di PLGA di 8 mg/ml e lo 0.5% di sodio colato nella FA. Il grafico descrive l’intensità della luce deviata dalle NP in funzione del loro diametro (size). Queste condizioni di sintesi hanno determinato la formazione di NP con diametro medio e IPD in linea con i valori ottenuti dalle sintesi precedenti.
L’ultimo parametro messo a punto per la sintesi di NP è il rapporto tra i flussi della FO e della FA (Tabella 7). I rapporti di flusso testati sono 1:2 e 1:3. La sintesi che si è rilevata migliore è quella condotta utilizzando un rapporto 1:3 tra il flusso di FO e flusso di FA, sia per le condizioni di sintesi poiché non si verificava nessun accumulo nel canale centrale, sia per le dimensioni (161±2 nm) e l’IPD (0.15±0.07) delle NP prodotte (Figura 20).
Tabella 7. Tabella riassuntiva delle caratteristiche chimico-fisiche delle NP sintetizzate mantenendo fisso il flusso totale a 15µl/min e la concentrazione di PLGA a 8 mg/ml. I parametri analizzati sono la percentuale di sodio colato presente nella FA e il rapporto tra il flusso della FO e della FA. I valori che vengono riportati sono il diametro medio, l’IPD medio e le relative deviazioni standard (DS).
N° sintesi effettuate
Sodio colato nella FA (%)
Rapporto tra i flussi della FO e FA Diametro ± DS (nm) IPD ± DS 3 0.5 1:2 183±1 0.13±0.02 3 0.5 1:3 161±2 0.15±0.07 2 1 - 194±2 0.22±0.01 2 2 - 104±2 0.30±0.04
Una volta selezionata la condizione migliore di sintesi che prevede l’uso di PLGA 8 mg/ml nella FO, lo 0.5% di sodio colato nella FA, un flusso totale di 15 µl/min e un rapporto tra le due fasi di 1:3 ho valutato il potenziale Z delle NP che ho prodotto. Il valore medio ottenuto è di –35±3.7 mV per la presenza dei gruppi carbossilici del PLGA sulla superficie delle NP che a pH neutro sono deprotonati. Questo valore è in linea con i valori generalmente osservati per le NP PLGA ottenute sia per nanoprecipitazione che attraverso la microfluidica76.
Una volta messo a punto il protocollo di sintesi di NP di PLGA, ho analizzato la forma e le dimensioni delle NP con il SEM per valutare i valori del diametro ottenuto con il DLS. Ho posizionato una goccia di soluzione con le NP prodotte sul silicio, ho lasciato evaporare l’acqua e infine ho analizzato le NP adsorbite sulla superficie. Le NP che ho prodotto hanno una forma sferica e un diametro medio di circa 115 nm. Le dimensioni osservate al SEM sono lievemente minori di quelle misurate con il DLS. La differenza potrebbe essere dovuta alle diverse condizioni in cui si effettuano le due analisi. Le NP analizzate con DLS sono disperse in un liquido e sulla loro superficie aderisce un sottile strato del solvente. Il DLS restituisce il diametro idrodinamico, ovvero
le dimensioni delle NP e dello strato di solvente adsorbito. Analizzando le NP con il SEM questo strato di idratazione non è presente, poiché ho fatto evaporare il solvente, quindi si osservano le NP in stato secco.
Figura 21. Immagini al SEM delle NP di PLGA sintetizzate con il chip microfluidico.
Attraverso l’utilizzo del chip microfluidico sono riuscita a condurre una sintesi di NP continua della durata di 4 ore che mi ha permesso di raccogliere circa 4 ml di una soluzione contenente le NP, che poi ho concentrato 10 volte. In seguito, attraverso la liofilizzazione ho ricavato la concentrazione delle NP sintetizzate che corrisponde a 10 mg/ml. Si è reso necessario concentrare le NP di 10 volte per portarle ad una concentrazione adeguata ad essere utilizzate nel saggio proteico.
Le analisi che ho condotto sulle diverse sintesi mi hanno permesso di trovare un range di parametri che garantissero la sintesi di NP di PLGA con una formulazione comparabile a quelle in letteratura ottenute con metodi convenzionali32.