Il mio lavoro di tesi è stato quello di progettare, fabbricare e testare un chip microfluidico in cui effettuare la sintesi di NP di PLGA incapsulanti l’enzima GALC sotto forma di aggregati chimici detti CLEAs, che potrebbero essere utilizzate per il trattamento della MK. Parametri della sintesi come flusso totale del liquido, concentrazione di PLGA, percentuale di tensioattivo nella FA, rapporto dei flussi di FO e FA e volume di CLEAs nella FO sono stati individuati per mettere a punto un protocollo che determini la sintesi di NP con caratteristiche chimico-fisiche omogenee e adatte al passaggio delle BEE. Le NP sintetizzate con il chip microfluidico che ho fabbricato presentano un’EI del 44%, ovvero un valore che è di poco inferiore a quello ottenuto incapsulando i CLEAs con il metodo della nanoprecipitazione. Il vantaggio dell’impiego della microfluidica non è solo riconducibile alla capacità di sintetizzare NP di PLGA con proprietà omogenee, ma con questo metodo si ha anche la possibilità di NP in modo automatizzabile. Infatti, il processo di sintesi che ho messo a punto con il mio chip mi ha permesso di produrre 1 ml di soluzione di NP all’ora. Il limite del setup sperimentale che ho utilizzato per la sintesi di NP incapsulanti è stata la sintesi dei CLEAs che ha causato una perdita considerevole di attività dell’enzima e ha influenzato la resa di attività delle NP caricate con questi CLEAs.
Il mio lavoro di tesi si inserisce nella ricerca da parte della nanomedicina di sviluppare NP polimeriche per veicolare una molecola terapeutica in organi specifici dell’organismo grazie alla loro biocompatibilità e alla possibilità di controllare il rilascio del farmaco nel tempo e in modo tessuto-specifico. Un farmaco incapsulato nelle NP opportunatamente funzionalizzate riesce a superare la BEE, permettendo lo sviluppo di
cure per malattie per cui la semplice somministrazione del farmaco libero non ha avuto successo, come la MK. Le caratteristiche chimico-fisiche delle NP di PLGA vengono fortemente influenzate dal metodo con il quale sono sintetizzate. Uno dei metodi di produzioni più innovativi è la microfluidica che permette di manipolare piccoli volumi e di garantire un controllo preciso del processo di sintesi. La caratterizzazione delle NP di PLGA incapsulanti i CLEAs, sintetizzate con il chip microfluidico che ho fabbricato, mi ha permesso di individuare i vantaggi di questo metodo di sintesi. Nei laboratori non industriali la variabilità delle caratteristiche delle nanoparticelle sintetizzate con metodi convenzionali può essere attribuita alla non ottimale riproducibilità della sintesi. Attraverso l’utilizzo di un chip microfluidico non è richiesta lavoro eccessivo da parte di un operatore esperto poiché, una volta messi a punto i parametri, il regime microfluidico permette la sintesi di NP con dimensioni omogenee e IPD piccolo. I dati ottenuti sono incoraggianti poiché offrono un margine di miglioramento della sintesi di NP utilizzando la microfluidica, sia per quanto riguarda le caratteristiche chimico-fisiche che per l’EI. I bassi valori di EI dei CLEAs possono essere spiegati dalla lunghezza del canale centrale che impedisce un mescolamento completo delle due fasi e permette l’incapsulamento di tutti i CLEAs. Per migliorare, quindi, la performance del chip microfluidico che ho fabbricato, aumentare la lunghezza del canale in cui avviene la sintesi potrebbe fornire un tempo maggiore per il mescolamento della FO e della FA. Per migliorare ulteriormente le condizioni di sintesi, sarebbe possibile accoppiare un sistema microfluidico con un sistema attivo di mescolamento che possa coadiuvare la diffusione delle due fasi. Negli anni, molti dispositivi microfluidici sono stati accoppiati con sistemi di micro-miscelazione del liquido che utilizzano la tecnologia delle onde acustiche di superficie (surface acoustic waves- SAW). Le SAW sono oscillazioni meccaniche che si propagano lungo una superficie. Quando le SAW arrivano a contatto con il liquido, l’energia acustica viene rifratta provocando una la formazione di un flusso
acustico in grado di miscelare velocemente il liquido. L’applicazione delle SAW in un chip microfluidico determinerebbe una maggiore miscelazione del solvente della FO con la FA, portando una formazione di NP più efficiente rispetto a quanto consente la sola diffusione. Inoltre, per poter garantire il mantenimento dell’attività enzimatica dei CLEAs sarebbe interessante condurre la sintesi delle NP impostando una temperatura minore di 25°C nel chip microfluidico che permetta di preservare l’attività dei CLEAs iniettati nei microcanali. Diminuire la temperatura però diminuisce la solubilità del PLGA in acetone e questo potrebbe limitare la formazione delle NP77. Quindi, sarebbe
interessante effettuare sintesi di NP con la stessa formulazione ma variando la temperatura per individuare l’intervallo ideale a ottenere NP con caratteristiche chimico-fisiche ideali e che possa preservare maggiormente l’attività enzimatica dell’enzima.
In conclusione, ho fabbricato un dispositivo microfluidico efficiente con il quale ho sintetizzato le NP di PLGA in modo controllato. Gli esperimenti che ho condotto mi hanno permesso di individuare un range di parametri che garantissero una formulazione di sintesi di NP paragonabile a quelle presenti in letteratura32. In futuro, la
fabbricazione di un chip microfluidico, con geometria e dimensioni ottimizzate, che sia provvisto di un sistema di micro-miscelazione porterebbe alla formazione di NP polimeriche con specifiche caratteristiche chimico-fisiche in modo automatizzabile, senza la necessità di un intervento da parte di un operatore. La possibilità, inoltre, di produrre NP in modo continuo consentirebbe un scale-up industriale del processo di sintesi, aumentando così la quantità di NP che vengono sintetizzate.
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