3.9.1 Preparazione delle reazioni per l’analisi real time PCR
Per lo studio dei profili di espressione dei geni di difesa della vite a peronospora ed oidio e dei geni MLO sono state effettuate delle reazioni di real time PCR che permettono di ottenere una quantificazione di tipo relativo dell’espressione genica. La real time PCR è una tecnica altamente sensibile che consente la quantificazione di trascritti scarsamente rappresentati e di piccole variazioni nell’espressione di un gene. La tecnica consiste nel sintetizzare prodotti di PCR in presenza del colorante fluorescente SYBR Green che si lega al DNA a doppio filamento generando un segnale di fluorescenza proporzionale al numero di molecole sintetizzate.
Le reazioni di amplificazione a partire dal cDNA diluito sono state effettuate utilizzando i primer specifici per l’amplificazione dei geni di interesse e dei geni di riferimento riportati in Tabella 3.9 e 3.10. I primer per la real time PCR sono stati disegnati con l’ausilio del programma Primer3 (http://primer3.sourceforge.net) indicando un amplicone di dimensioni ottimali pari a 80-150 bp e una temperatura di melting di 55°C o 60°C. I primer sono stati controllati con l’applicazione Oligo Analyzer V.1.0.2 (www.bio.net /bionet/mm/bio- soft/2001- September/023431.html).
Le reazioni di amplificazione sono state preparate utilizzando la miscela Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG (Invitrogen), che contiene l’enzima Platinum Taq DNA Polymerase, la molecola fluorescente SYBR Green І, MgCl2 e dNTPs. È stato inoltre aggiunto il ROX Reference Dye (Invitrogen) per normalizzare il segnale di fluorescenza tra le reazioni. Ciascuna reazione di amplificazione di ogni campione di cDNA con ogni coppia di primer è stata condotta in triplicato (repliche tecniche). Tutte le reazioni sono state realizzate in un volume finale di 10 µL nello strumento Light Cycler 480 (Roche) impostando il seguente programma: 50°C per 2 minuti, 95°C per 2 minuti, 50 cicli di 95°C per 15 secondi, 60°C per 30 secondi. Al termine dei 50 cicli avviene il protocollo di dissociazione che consiste nell’aumento graduale della temperatura da 60°C a 95°C.
La quantificazione del prodotto di amplificazione ottenuto mediante real time PCR si basa sul fatto che nella fase esponenziale l’efficienza di amplificazione è massima ed in condizioni ottimali la quantità di amplificato raddoppia ad ogni ciclo. Due campioni possono essere quindi confrontati rispetto al numero di ciclo di PCR (Ct) in corrispondenza del quale il valore della loro fluorescenza supera il valore soglia (Figura 3.10). I campioni che raggiungono prima il valore soglia hanno un Ct inferiore e sono quelli che contengono più templato di partenza.
Il graduale incremento della temperatura durante il protocollo di dissociazione finale provoca la dissociazione delle molecole di amplificato al raggiungimento della loro temperatura di melting. L’apertura della doppia elica degli amplificati provoca la liberazione della molecola di SYBR Green con conseguente riduzione della fluorescenza.
La derivata negativa della curva di abbassamento della fluorescenza in funzione della temperatura presenta un picco in corrispondenza della temperatura di dissociazione del prodotto amplificato. La presenza di un unico picco corrispondente alla temperatura di melting dell’amplicone previsto conferma la specificità dell’amplificato. Mentre la presenza di picchi multipli a temperature diverse può indicare la presenza di amplificati aspecifici oppure di dimeri dei primer che influenzano la corretta stima della quantità dell’amplificato, e quindi la quantificazione relativa dell’espressione genica del gene di interesse.
3.9.2 Analisi dei dati di real time PCR
Per l’elaborazione dei dati di real time PCR, il valore di efficienza di amplificazione per ciascuna reazione è stato calcolato utilizzando il programma LinReg PCR 11.1 (Ruijter et al. 2009), in base alla seguente equazione:
Log(R0)= Log(N0)+Log(Eff)*C
In cui, R0 e C sono rispettivamente i dati delle misure di fluorescenza ed il numero dei cicli, mentre Log(No) e
Log(Eff) sono rispettivamente l’intercetta e la pendenza della curva di amplificazione. Per evitare un’ambigua selezione dei punti all’interno della fase esponenziale, l’algoritmo LinReg PCR identifica la migliore linea di tendenza per ciascuna curva di amplificazione, utilizzando da 4 a 6 punti e selezionando il massimo valore di pendenza (valore dell’efficienza di ciascuna reazione).
Utilizzando il software Light Cycler 480 1.5.1.62 SP2 (Roche) è stato determinato il valore di ciclo soglia Ct (cycle threshold), che corrisponde al punto in cui la fluorescenza supera il valore utilizzato come soglia (cioè il rumore di fluorescenza di base).
Analisi dell’espressione dei geni di risposta della vite a P. viticola in foglie intere e in campioni sottoposti a microdissezione
La quantificazione relativa è stata calcolata con l’equazione di Pfaffl (Pfaffl 2001):
espressione relativa = (Effgene)
∆Ctgene(controllo-inoculato) /(Effrif)
∆Ctrif(controllo-inoculato)
Effgene: efficienza di amplificazione del gene di interesse;
Effrif: efficienza di amplificazione del gene di riferimento (Actina_1);
∆Ctgene: differenza tra il valore di Ct del campione controllo e quello del campione inoculato per il gene di interesse;
∆Ctrif: differenza tra il valore di Ct del campione controllo e di quello del campione inoculato per il gene di riferimento.
L’equazione di Pfaffl combina la quantificazione e la normalizzazione in un unico calcolo e permette di esprimere il livello di espressione relativo di un gene come numero di volte (fold change) con cui cambia
l’espressione del gene nel campione inoculato rispetto al livello di espressione nel campione di riferimento (controllo), normalizzando in base al livello di espressione del gene di riferimento.
Come riferimento è stato utilizzato il gene Actina_1 (Act_1, VIT_212s0178g00200) che è risultato costitutivo durante l’infezione di P. viticola (Polesani et al. 2010, Perazzolli et al. 2011). La foglia intera fresca del campione controllo è stata inoltre utilizzata come riferimento per il calcolo del livello di espressione relativo nelle foglie intere fresche. La foglia intera fissata del campione controllo è stata invece utilizzata come riferimento per il calcolo del livello di espressione negli stomi e nelle regioni circostanti del campione controllo, inoculato-locale e inoculato-distale e nelle foglie intere fissate del campione inoculato-locale e inoculato-distale.
Analisi dell’espressione dei geni MLO e dei geni di risposta della vite ad oidio in piante trasformate La quantificazione relativa è stata calcolata con la formula riportata in Hellemans et al. (2007):
Normalized Relative Quantity (NRQ) = RQ/NF
Relative Quantification (RQ) = Eff (Ct-Ct’)
Normalization Factor (NF) = media geometrica delle RQ dei geni di riferimento considerati.
Eff: efficienza di amplificazione, calcolata dal programma LinReg PCR 11.1 (Paragrafo 3.9.2); Ct: il ciclo soglia dell’amplificazione di un gene in uno specifico campione;
Ct’: corrisponde alla media dei Ct tra tutti i campioni analizzati per lo stesso gene nel calcolo del livello di espressione dei geni MLO nel controllo EVB e nelle linee trasformate con il costrutto per il silenziamento dei geni MLO. Mentre, per il calcolo del livello di espressione dei geni di risposta della vite ad oidio nel controllo EVB e nella linea TLB4, Ct’ corrisponde alla media dei Ct nel controllo EVB a 0 dpi.
Come geni di riferimento sono stati usati: Actina_2 (Act_2), Glutaraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GADPH) e il Fattore di elongazione 1α (EF-1α) (Reid et al. 2006). La stabilità dei geni di riferimento è stata valutata tramite il software GeNorm (medgen.ugent.be/~jndesomp/genorm/) (Vandesompele et al. 2002) a partire dalle loro RQ. Per ogni gene di riferimento, il programma GeNorm fornisce un valore di stabilità (M), definito come la variazione media a coppie di un particolare gene di riferimento con gli altri geni oggetto di studio. I tre geni hanno presentato un valore di stabilità M, pari a 0,5. Come riportato in letteratura (Strube et al. 2008, Van Hiel et al. 2009, Ling and Salvaterra 2011), i geni di riferimento con valori di M al di sotto di 1,5 sono considerati stabili.
L’espressione relativa percentuale (RE %) è stata calcolata come il rapporto tra la media del livello di espressione relativa del gene MLO a 0, 1 e 10 dpi nella linea trasformata con il costrutto per il silenziamento dei geni MLO e la media dell’espressione relativa del gene MLO a 0, 1 e 10 dpi nel controllo EVB, ed espressa come percentuale.