3.2.1 Clonaggio e preparazione dei costrutti
Il clonaggio e la preparazione dei costrutti per la trasformazione genetica della vite per silenziare i geni MLO è stata effettuata in collaborazione con la Dott.ssa Simona Urso e il Dott. Giampiero Valè del Consiglio per la Ricerca in Agricoltura e l’analisi dell’Economia agraria (CRAE) di Fiorenzuola d’Arda (Piacenza), seguendo il protocollo descritto in Urso et al. (2013). In particolare, sono stati amplificati frammenti di 300-600 paia di basi (bp) dei geni MLO-6, MLO-7, MLO-11 e MLO-13 di vite tramite PCR utilizzando i primer riportati in Tabella 3.1.
Tabella 3.1: Primer usati per il clonaggio dei geni MLO.
Le basi sottolineate nel primer forward sono necessarie per l’inserimento del frammento nel vettore pENTR/SD/D-TOPO.
Il prodotto di PCR una volta purificato è stato inserito all’interno del vettore pENTR/SD/D-TOPO (Invitrogen) (Figura 3.3). I frammenti genici inseriti nel vettore pENTR/SD/D-TOPO sono stati sequenziati per verificarne la corretta sequenza. Il frammento genico clonato è stato quindi inserito mediante ricombinazione nel vettore pK7GWIWG2D (II) (http://www.psb.ugent.be/) (Figura 3.4 B). Questo vettore binario è basato sul sistema Gateway che permette con un unico processo di ricombinazione l’inserimento del frammento in orientamento senso ed antisenso sotto il controllo del promotore costitutivo del virus del mosaico del cavolfiore (CaMV) 35S e un terminatore (Karimi et al. 2002). Il vettore “vuoto” pK2GW7 (Figura 3.4 A) è stato usato come controllo nel processo di trasformazione (Tabella 3.2).
Il costrutto finale è stato ulteriormente verificato tramite sequenziamento in entrambe le direzioni. I vettori di trasformazione pK7GWIWG2D (II) e pK2GW7 sono stati introdotti per elettroporazione in cellule competenti di Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 come descritto in Zottini et al. (2008).
Figura 3.3: Vettore pENTR/SD/D-TOPO.
Gene Genoscope ID Primer Forward Primer Reverse Lunghezza
dell’amplicone (bp)
MLO-6 GSVIVT00024506001 CACCTGCTTACAGTATTACAAACTCCC TTTCCCTTGCATACCTAAAC 327
MLO-7 GSVIVT00018219001 CACCGACAATTTTTAACGAGAGAGT ATCTCATGTTGGGTTCGGATT 369
MLO-11 GSVIVT00023170001 CACCTCACTTATGCTACTGGGGTT ATCAACTTTGGGAACTGATCTGAC 504
Figura 3.4: Vettore usato (A) per la trasformazione di piante controllo e (B) per il silenziamento dei geni MLO di vite.
(Karimi et al. 2002)
Tabella 3.2: Costrutti usati per la trasformazione genetica della vite.
Costrutto Vettore Inserto Funzione attesa pK7GWIWG2D(II)-MLO-6 pK7GWIWG2D(II) MLO-6 Silenziamento di MLO-6 pK7GWIWG2D(II)-MLO-7 pK7GWIWG2D(II) MLO-7 Silenziamento di MLO-7 pK7GWIWG2D(II)-MLO-11 pK7GWIWG2D(II) MLO-11 Silenziamento di MLO-11 pK7GWIWG2D(II)-MLO-13 pK7GWIWG2D(II) MLO-13 Silenziamento di MLO-13
pK2WG7 pK2WG7 / Controllo
3.2.2 Trasformazione genetica della vite ed acclimatazione delle piante trasformate
La trasformazione delle piante di vite è stata condotta seguendo il protocollo descritto in Dalla Costa et al. (2014) in collaborazione con Dott.ssa Lorenza Dalla Costa e Dott. Mickael Malnoy (presso l’Unità Genomica e Biologia Avanzata della Fondazione Edmund Mach di San Michele all’Adige, Trento). Brevemente, i calli embriogenici sono stati messi in contatto per 48 ore con A. tumefaciens contenente i costrutti di trasformazione. Trascorso questo tempo è stato eliminato A. tumefaciens mediante lavaggio con terreno GS1CA liquido (Tabella 3.3) addizionato di 100 mg L-1 di timentina. Il callo è stato mantenuto il primo mese su terreno GS1CA solido con 100 mg L-1 di timentina a 25°C al buio. Nei mesi successivi il callo è stato trasferito periodicamente su terreno GS1CA fresco in presenza di 100 mg L-1 kanamicina, 1000 mg L-1 timentina per la selezione degli embrioni trasformati. Gli embrioni rigeneranti a stadio di torpedo sono stati trasferiti su terreno NN (Nitsch and Nitsch 1969) (Tabella 3.3) contenente 1 mg L-1 di 6-benzilaminopurina, 0,1 mg L-1 acido 3-indol butirrico e 25 mg L-1 di kanamicina alla luce (fotoperiodo di 16 ore) per indurre la differenziazione e la germinazione. I nuovi germogli sono stati trasferiti su terreno WP (Woody Plant Medium; Tabella 3.3) e incubati nella camera di crescita a 22 ± 2°C con un fotoperiodo di 16 ore e con un’umidità relativa del 70 ± 5%. Le piante sviluppate in vitro con almeno 2 radici di circa 3 cm di lunghezza sono state trasferite in un contenitore di plastica di 250 mL contenente torba autoclavata (Tercomposti Spa, Brescia, Italia) e coperto con Parafilm per preservare l’umidità.
Ogni 7 giorni, sono state create piccole aperture sul parafilm per ridurre l’umidità e promuovere la formazione della cuticola fogliare. Dopo 3 settimane, il parafilm è stato rimosso. Trascorsa un’ulteriore settimana, le piante sono state trapiantate in vasi da 1 L contenente torba (Tercomposti Spa, Brescia, Italia) e poste ad acclimatare in serra a 25°C, con un fotoperiodo di 16 ore e un’umidità del 70 ± 5%.
Tabella 3.3: Composizione dei terreni usati per la trasformazione e rigenerazione delle piante.
Terreno Composizione Utilizzo
GS1CA NN macroelementi; MS microelementi; vitamine Gamborg; NN ferro; 6% saccarosio; 2 mg L-1 NOA; 2 mg L-1 IAA; 0,2 mg L-1 IBA; pH 6,2;
0,4% Phytagel; 0,25% carbone attivo.
Formazione degli embrioni
NN NN microelementi; NN macroelementi; NN vitamine; NN ferro; 1,5% saccarosio; pH 6,2; 0,9% agar
Differenziazione degli embrioni e rigenerazione
WP 20 g L-1 saccarosio; pH 5,8; 2,5 g L-1 phytagel. Micropropagazione delle piante
NN: Nitsch and Nitsch (1969); MS: Murashige and Skoog (1962); Gamborg: Gamborg et al. (1968); NOA: acido β- naftossiacetico; IAA: Acido indol-3-acetico; IBA: Acido indol-3-butirrico.
3.2.3 Selezione delle linee trasformate con il costrutto per il silenziamento dei geni MLO
3.2.3.1 Estrazione del DNA genomico
I campioni fogliari sono stati polverizzati con mortaio e pestello in azoto liquido. Per l’estrazione del DNA genomico è stato impiegato il kit Illustra Nucleon Phytopure kit (GE Healthcare, Life Science). Ad 1 g di tessuto macinato sono stati aggiunti 4,6 mL di Reagent 1 (GE Healthcare, Life Science). Il campione è stato leggermente agitato ed in seguito sono stati aggiunti 1,5 mL di Reagent 2 (GE Healthcare, Life Science). I tubi sono stati invertiti alcune volte e incubati a 65°C per 10 minuti. Successivamente i campioni sono stati incubati in ghiaccio per 20 minuti. Dopodiché, sono stati aggiunti 2 mL di cloroformio (a -20°C) e in seguito 200 µL di Nucleon phytopure DNA extraction resin suspension (GE Healthcare, Life Science). I campioni sono stati posti in agitazione per 10 minuti a temperatura ambiente e successivamente centrifugati a 1300 × g per 10 minuti. La fase superiore contenente il DNA è stata trasferita in un tubo da 1,5 mL pulito, a cui è stato aggiunto un ugual volume di isopropanolo. Il campione è stato miscelato, centrifugato a 4000 × g per 5 minuti e il surnatante è stato rimosso. Il pellet contenente il DNA è stato lavato con etanolo 70% freddo, centrifugato a 4000 × g per 5 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, il DNA è stato lasciato asciugare per 10 minuti per rimuovere le tracce di etanolo. Il DNA è stato quindi risospeso in 50 µL di acqua sterile.
3.2.3.2 Conferma dell’inserimento del costrutto tramite PCR
La presenza del costrutto nelle linee trasformate è stata verificata mediante amplificazione usando GoTaq Green MasterMix (Promega) utilizzando il primer forward disegnato sul promotore 35S (5’- CGCACAATCCCACTATCCTT-3’) e il primer reverse disegnato su ciascun gene MLO usato per il clonaggio (Tabella 3.1). Le reazioni di amplificazione sono state realizzate assemblando la miscela di reazione in 25 µL finali come riportato in Tabella 3.4, utilizzando il termociclatore T-gradient (Biometra) secondo i cicli di amplificazione descritti nella Tabella 3.5.
Tabella 3.4: Miscela per la reazione di PCR.
Componente Quantità da aggiungere GoTaq Green Master Mix, 2× 12,5 µL
Primer Forward (10 mM) 1 µL Primer Reverse (10 mM) 1 µL
DNA 1 µL
H20 9,5 µL
Tabella 3.5: Schema dei cicli di amplificazione.
N° cicli Temperatura Tempo
1 95°C 2 minuti 35 95°C 30 secondi 58°C 30 secondi 72°C 45 secondi 1 72°C 5 minuti 15°C ∞