Analisi della metilazione del DNA mediante Methylation Specific PCR (MSP)

L'epigenetica ha per oggetto lo studio dei cambiamenti del genoma senza mutazioni nella sequenza di DNA. Tali modifiche epigenetiche comprendono RNAi, modifiche istoniche e non ultima, la metilazione del DNA. Quest'ultima avviene a carico della citosina a cui si lega un gruppo metile formando la 5'-metilcitosina, la quale viene mantenuta nella cellula poiché svolge delle funzioni di regolazione nei vari stadi di crescita della pianta (Zhang et al., 2010).

Per studiare la presenza della metilazione a carico della citosina nel dinucleotide CG (che costituisce la forma di metilazione più frequente nel genoma) nella zona del promotore, i campioni di DNA estratti da tutti i campioni dei 4 tempi sperimentali sono stati oggetto di una conversione utilizzando il bisolfito di sodio. Tale reagente permette la conversione esclusivamente delle citosine non metilate in uracile, mentre quelle metilate non vengono convertite e restano 5'-metilcitosina. Questo processo è alla base di una PCR condotta con primers specifici che consentono di discriminare le citosine metilate da quelle che non lo sono.

La conversione dei campioni è stata eseguita come illustrato in Materiali e Metodi (paragrafo ) In effetti, una fase molto importante è la corretta progettazione dei primers, i quali devono chiarire in maniera inequivocabile la presenza o meno della metilazione a carico della citosina. Le sequenze promotrici sono state analizzate mediante il software METHPRIMER il quale evidenzia le regioni ricche in CG (con un rapporto maggiore a 0.6), poiché sono i siti in cui si ha maggiore probabilità di trovare la condizione di metilazione. Tale software, elabora due coppie di primers che amplificano la stessa regione: la prima, chiamata Methylated PAIR (M PAIR) si appaia allo stampo, ed amplifica solo se la citosina in esame è nella forma metilata, la seconda, Unmethylated PAIR (U PAIR) si appaia allo stampo in presenza di una citosina non metilata che quindi dopo la conversione con bisolfito di sodio è stata convertita in uracile. Le coppie di primers fornite dal software sono state utilizzate per simulare delle PCR, tramite specifici programmi al computer, per appurarne la qualità poiché la difficoltà in questo tipo di elaborazione dei primers è quello di ottenere dei primers forward che si appaiano ad una regione in cui è presente una citosina da analizzare. Quindi, a seconda di quale primer forward (M oppure U) si appaia è possibile dedurre se la citosina in esame sia metilata o meno. Inoltre non tutte le sequenze sono analizzabili perché i primers e le sequenze da analizzare sono ricche di dinucleotidi CG che possono determinare la presenza di strutture di complementarietà interne, i cosiddetti hairpin. Inoltre, un'altra difficoltà è che essendo molto lunghi (circa 25 nucleotidi), perchè devono aumentare il ΔG abbassando così la probabilità di

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complementarsi su se stessi, tendono ad avere delle temperature di Melting alte. Quindi anche quelle di annealing sono molto elevate e talvolta troppo diverse tra il forward e reverse.

L'analisi in silico mediante il software METHPRIMER ha evidenziato due regioni interessanti nel promotore di BBPI per lo studio della metilazione del DNA: una si estende da -9544 a -8856 bp dall'ATG, e l'altra da -2666 a -2276 bp dall'ATG, l'altra. La medesima analisi condotta sul promotore di POX ha posto l’attenzione su due regioni: una da -6300 a -5700 bp dall'ATG, e l'altra da -4366 a - 4056 bp dall’ATG.

In seguito alla PCR, gli amplificati sono stati analizzati su gel di agarosio 1,2% (FIG.46 ).

FIG.46. Risultati MSP.C= controllo; W= ferita; J= trattamento spray 10 μM; J+W= trattamento spray 10 μM e ferita; M= metilato; U= non metilato. Pannello A: zona del promotore di BBPI da -2666 a -2276 bp dall'ATG; pannello B: zona del promotore di BBPI da -9544 a -8856 bp dall'ATG; pannello C: zona dl promotore di POX da -4366 a -4056 bp dall'ATG; pannello D: zona del promotore di POX da -6300 a -5700 bp dall'ATG. A e C: zone prossimali all'ATG. B e D: zone distali all'ATG.

Da questa analisi è emerso che la metilazione è presente esclusivamente nel sito più prossimale all'ATG (pannello A) nel promotore di BBPI e nel sito più distale nel promotore di POX (pannello D). La metilazione invece non è presente nel sito più distale dall'ATG (pannello B) nel promotore di BBPI e nel sito più prossimale all'ATG nel promotore di POX (pannello C).

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metilazione del DNA ed espressione genica in quanto non è presente una variazione di metilazione tra i campioni ai vari tempi, correlabile con l’andamento dell’espressione genica evidenziato con la qPCR. Quindi non sembra essere presente un “effetto epigenetico” indotto dalla metilazione del DNA per influenzare l’andamento dell'espressione genica nel priming. Tuttavia da letteratura emerge una cooperazione tra le modifiche epigenetiche come la metilazione del DNA e le modifiche istoniche che rendono possibile l'espressione genica (Li et al., 2008).

Tutto ciò sembra essere in netto contrasto con le conoscenze relative al mondo animale in cui la metilazione, che è poco frequente nel genoma, è spesso associata alla repressione genica ed inoltre è del tutto assente nelle isole CG. Nel mondo vegetale invece non solo è molto più diffusa, ma non è necessariamente associata alla repressione genica, poiché il suo effetto si esplica in relazione ad altre modifiche epigenetiche presenti (Li et al., 2008).

A questo punto per avere una visuale più completa del meccanismo del priming anche dal punto di vista epigenetico è stato necessario ed opportuno abbinare lo studio della metilazione del DNA con altre modifiche epigenetiche quali le modifiche istoniche.