RISULTATI E DISCUSSIONE
FIG.37 VISUALIZZAZIONE AL MICROSCOPIO CONFOCALE DELLE SEZIONI FOGLIARI CONTROLLO COLORATO: campione infiltrato con acqua sterile e trattato con 2,7 DCFH2-DA CONTROLLO NON
3.2.3 Validazione dei risultati mediante REAL TIME PCR
Per verificare l'attendibilità dei risultati ottenuti mediante RT-PCR semiquantitativa i livelli di espressione dei geni apparentemente coinvolti nel priming sono stati analizzati mediante REAL TIME PCR, tecnica che permette una maggiore sensibilità e precisione nell'analisi di espressione genica.
In queste analisi di qPCR, il gene codificante per il fattore di elongazione 1a degli eucarioti, eEF1a, è stato utilizzato come stardard interno o normalizzatore. Le reazioni di qPCR sono state allestite come descritto nella sezione di Materiali e Metodi (paragrafo ) utilizzando il SYBR Green per la rilevazione della fluorescenza. Essendo il SYBR GREEN un intercalante aspecifico, per tutti i campioni è stata sempre analizzata la curva di Melting per appurare la specificità degli ampliconi. I geni oggetto di indagine sono stati quelli che nell'analisi di RT-PCR relativa al trattamento con Me-JA 10 μM sembravano essere coinvolti nel priming e quindi BBPI, POX, LOX. In questa prima fase di analisi si è deciso di analizzare anche il gene JAMYB per essere sicuri che il suo pattern di espressione fosse realmente incompatibile con il priming (FIG. 40).
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3.2.3.1 Analisi di REAL TIME PCR del gene BBPI
Anova-Tukey post test. P<0,05
FIG 41. Risultati di q-PCR relativi al gene BBPI.
L'analisi di REAL TIME PCR ha permesso di evidenziare e confermare il ruolo di BBPI nel priming (FIG. 41). Tuttavia, mentre l’analisi di RT-PCR aveva evidenziato per BBPI un andamento compatibile con il priming a 3 e 6 hpw, la qPCR ha consentito di confermare il coinvolgimento di BBPI nel priming a 6 e 24 hpw, dove il livello di espressione del campione J+W è significativamente maggiore degli altri. In particolare, a 3h il campione di controllo (C3h) e quello trattato solo con Me-JA (J3h) hanno un basso livello di espressione e senza differenze significative, il che significa che il trattamento con Me-JA non influenza il livello di espressione costitutiva del gene; il campione ferito (W3h) invece, mostra un livello di espressione significativamente maggiore rispetto agli altri, indice del fatto che è la ferita ad indurre maggiormente l’espressione di questo gene a 3 hpw.
A 6h è possibile osservare un andamento compatibile con il priming perchè i campioni di controllo (C6h) e pre-trattato (J6h) hanno una bassa espressione mentre il campione ferito (W6h) mostra averne una maggiore. Tuttavia il picco massimo è raggiunto dal campione doppio trattato (J+W6h). Questo pattern è compatibile con il priming ed è in accordo con quello ottenuto nell'analisi di RT- PCR.
A 24h è presente un pattern analogo a quello di 6h ma con un valore di intensità delle espressioni significativamente inferiore rispetto al tempo precedente. Tuttavia, anche in questo set di campioni, C3h W3h J3h J+W3h C6h W6h J6h J+W6h C24h W24h J24h J+W24h C48h W48h J48h J+W48h 0 2 4 6 8 10 12 14
BBPI
a a a-e a a-e a-c-e a-e-g a-c b c d e f g c c-e107
il doppio trattato (J+W24h) ha un livello di espressione più elevato rispetto al resto dei campioni (C24h, W24h e J24h). Questo risultato non è concorde con l'andamento ottenuto nell'RT-PCR in cui a 24hpw l'effetto del priming sembrava già terminato.
A 48h l'espressione di tutti i campioni tende ad uniformarsi e non è possibile osservare un pattern particolarmente interessante. Ciò è stato rilevato anche nelle analisi di RT-PCR.
Tutto ciò consente di affermare che il coinvolgimento di BBPI nel priming è massimo a 6h e diminuisce entro le 24 dopo la ferita.
3.2.3.2 Analisi di REAL TIME PCR del gene POX
Anova-Tukey post test. P<0,05
FIG42. Risultati di q-PCR relativi al gene POX.
L'analisi di REAL TIME PCR ha permesso di confermare il coinvolgimento del gene POX nel meccanismo del priming (FIG. 42), ma, anche in questo caso, i tempi in cui si vede il massimo effetto sulla difesa della pianta sono posticipati rispetto a quanto evidenziato con la RT-PCR semiquantitativa. Nei primi tempi di analisi (3 e 6 hpw) il campione ferito (W) e il doppio trattato (J+W) mostrano un livello di espressione maggiore rispetto agli altri campioni, con l’espressione del doppio trattato leggermente superiore rispetto a quella del ferito, in analogia con quanto evidenziato nell’analisi di RT-PCR. Tuttavia dall'analisi statistica, risulta che la loro differenza di espressione non è statisticamente significativa.
Anche a 24 hpw è presente un picco di espressione maggiore nel doppio trattato (J+W24h) che, però, si traduce ancora una volta in una differenza non statisticamente significativa rispetto ai
C3h W3h J3h J+W3h C6h W6h J6h J+W6h C24h W24h J24h J+F24h C48h F48h J48h J+F48h 0 2 4 6 8 10 12
POX
a a-b-c a b a b a b a c c b-c a a-c a d108
campioni W24h e J24h. L’analisi di RT-PCR aveva evidenziato un picco di espressione a carico del campione ferito, che non è stata confermata in qPCR.
A 48 hpw è invece presente un importante picco di espressione del doppio trattato (J+W48h) il quale sottolinea la presenza di una condizione di priming che nell'analisi di RT-PCR non è stata individuata.
I valori di espressione genica e l’analisi statistica concordano nel fatto che soprattutto a 48h è presente un andamento compatibile con il priming per quanto riguarda il gene POX.
3.2.3.3 Analisi di REAL TIME PCR del gene LOX
Anova-Tukey post test. P<0,05
FIG.43. Risultati di q-PCR relativi al gene LOX.
L'analisi di REAL TIME ha evidenziato che, a differenza di quanto debolmente evidenziato con l’RT-PCR, il gene LOX non è coinvolto nel meccanismo del priming poiché non è mai presente un pattern di espressione compatibile con esso (FIG. 43). Infatti a 3 hpw il picco maggiore di espressione è raggiunto dal campione ferito (W3h), anche se l'analisi statistica non indica una differenza significativa rispetto al set di campioni di cui esso fa parte. A 6 hpw sembra che il pretrattamento con Me-JA e soprattutto la ferita inibiscano l’espressione costitutiva di tale gene facendone decrescere l'espressione. A 24 hpw si ha un'espressione molto bassa e pressoché identica in tutti i campioni; mentre a 48 hpw tale gene è responsivo esclusivamente alla ferita. Questo risultato in parte concorda con i dati ottenuti dall'RT-PCR in cui tale gene sembra essere indotto da C3h W3h J3h J+W3h C6h W6h J6h J+W6h C24h W24h J24h J+W24h C48h W48h J48h J+W48h 0 5 10 15 20 25 30 35
LOX
a a a a a a a a a a a b b b c c109
ferita (in particolare a 48 hpw), ma l'andamento compatibile con il priming debolmente individuato a 3 hpw con l'RT-PCR, non è stato confermato. Tutto ciò fa concludere che il gene LOX non sia coinvolto nel meccanismo del priming.
3.2.3.4 Analisi di REAL TIME PCR del gene JAMYB
Anova-Tukey post test. P<0,05
FIG44. Risultati di q-PCR relativi al gene JAMYB.
L'analisi di REAL TIME PCR ha evidenziato che il gene JAMYB non è coinvolto nel meccanismo del priming (FIG. 44), ma è semplicemente indotto da ferita, e ciò concorda con i dati provenienti dalla letteratura (Lee et al., 2001). Infatti nei primi due tempi di analisi 3hpw e 6hpw, è presente un picco maggiore di espressione nei campioni feriti (W3h e W6h) rispetto ai rispettivi doppio trattati (J+W3h, J+W6h). A 24hpw invece sembra che il campione ferito (W24h) e doppio trattato (J+W24h) abbiano la stessa intensità di espressione. A 48 hpw si ristabilisce la condizione iniziale in cui il campione ferito (W48h) ha maggiore espressione rispetto gli altri del set (C48h, W48h, J48h).
Il pretrattamento con metil-jasmonato non rende tale gene “primed”, anzi sembra che esso possa avere un effetto inibitorio sull'espressione che invece nella ferita è sempre molto intensa. Questi risultati chiariscono quelli ottenuti dall’analisi di RT-PCR in cui in tutti i quattro tempi di analisi era stato possibile osservare un discreto livello di espressione a carico dei campioni ferito e doppio trattato senza però riuscire a comprendere se ci fosse una effettiva differenza di espressione fra i due. a a C3h W3h J3h J+W3h C6h W6h J6h J+W6h C24h W24h J24h J+W24h C48h W48h J48h J+W48h 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
JAMYB
a c a a b d e f e d c f a a g d110
3.2.3.5 Conclusioni dell'analisi della REAL TIME PCR
La REAL TIME PCR è una tecnica molto sensibile e precisa che permette di avere una descrizione molto chiara circa il livello di espressione genica, cosa che non si può ottenere con la semplice analisi di RT-PCR semiquantitativa in quanto meno sensibile. Tuttavia, poiché quest’ultima è una analisi molto veloce e poco costosa, si è preferito realizzare uno screening iniziale di un gran numero di geni utilizzando questa tecnica per poi validare i risultati dei geni più interessanti con la qPCR.
In seguito a queste analisi si evince che è stato possibile indurre il priming con Me-JA ad una concentrazione di 10 μM in piante di riso di 4 settimane. Tale pre-stress è stato associato ad uno stress abiotico come la ferita perché fisiologicamente essa induce il pathway del JA che culmina con l'espressione dei geni di difesa ad esso responsivi. Tra i geni indagati, quelli che risultano essere coinvolti nel priming sono BBPI e POX, codificanti rispettivamente per una proteina inibitrice di proteasi della famiglia Bowman-Birk ed una perossidasi. Entrambe queste proteine partecipano attivamente nella difesa della pianta: la prima, avente dimensioni che oscillano tra gli 8-20 KDa (Rakwal et al., 2001), blocca le proteasi del patogeno per impedire la sua proliferazione nell'ospite. Inoltre vista la sua funzione anticarcinogenica ed anti-infiammatoria dimostrata da Kennedy (1998), è plausibile pensare ad un suo potenziale utilizzo anche in medicina (Rakwal et al., 2001). La seconda, POX, essendo un'ossidoreduttasi, ha molteplici ruoli nella pianta ed, infatti è coinvolta nel metabolismo delle auxine, nella biosintesi dell'etilene, nei processi mediati dalla luce, nella crescita, nello sviluppo, nella senescenza e non ultima nella difesa (Agrawal et al., 2002).
E' possibile osservare che l'andamento dell'espressione dei due geni nei campioni doppio trattati (J+W) è differente: per quanto riguarda BBPI, l'espressione raggiunge un massimo a 6 hpw per poi diminuire a 24 hpw, tempo in cui è osservabile un livello di espressione paragonabile al primo tempo di analisi, mentre a 48 hpw ha un livello di espressione ancora più basso (FIG.).
Invece è possibile osservare un pattern diverso per quanto riguarda il gene POX in cui i tempi 3-6- 24 hpw mostrano un'espressione paragonabile tra loro raggiungendo il picco massimo a 48 hpw (FIG.45).
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FIG.45. Andamento priming nei campioni doppio trattati per i geni BBPI e POX. Il gene eEF1a è stato utilizzato come controllo interno.