Analisi di espressione su coleoptil

I semi di riso sono stati sterilizzati con H2O2 10%, EtOH70% ed imbibiti over night in acqua sterile.

Dopo due giorni di incubazione a 37°C, necessaria per favorire la germinazione, i coleoptili sono stati trasferiti sterilmente in vaschette contenenti agar, dopodichè le vaschette sono state sigillate per evitare la contaminazioni da muffe. Le vaschette con le piantine sono state trasferite in camera di crescita per 6 giorni. Il trattamento con acido salicilico è stato eseguito mediante immersione dei coleoptili per 5 secondi in una soluzione di acido salicilico ad una concentrazione di 100μM. Successivamente le vaschette sono state nuovamente sigillate e rimesse in cella per altri due giorni. I coleoptili di 8 giorni sono stati dunque infettati con delle spore di Fusarium culmorum ad una concentrazione di 3· 105 spore/ml pipettate direttamente sul culmo della pianta. Quindi sono stati prelevati dei campioni fogliari sia prima dell'infezione che a 24-48-72h dall'infezione da cui è stato estratto l'RNA che è stato successivamente retrotrascritto. L'analisi di PCR semiquantitativa non ha portato risultati interessanti poiché i campioni non mostravano avere un pattern di espressione associabile al priming in quanto non è presente una variazione di intensità di espressione tra i vari campioni nonostante essi abbiano ricevuto trattamenti diversi. Dunque la tecnica dell'immersione utilizzata per indurre il priming in questo caso non è appropriata, inoltre anche l'infezione fungina eseguita pipettando direttamente le spore sul culmo non ha effetti sul coleoptile.

Quindi è stata allestita una nuova semina in cui i semi, dopo essere stati sterilizzati con H2O2 10% e

EtOH 70%, sono stati sottoposti ad un processo di osmopriming, cioè facendo imbibire i semi anziché in acqua, in una soluzione di salicilico 100μM per due ore. Successivamente è stato seguito il classico metodo della germinazione in piastre Petri a 37°C con successivo trasferimento in vaschette di agar. I coleoptili di 4 giorni sono stati infettati con 119000 spore di Fusarium

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culmorum, e prelevati a 24-48-72 hpi. L'analisi semiquantitativa (FIG. 35) di questi campioni ha

fatto emergere per alcuni geni un pattern di espressione differenziale compatibile con il priming in quanto i campioni doppio trattati (SA+ F.c) mostrano un livello di espressione maggiore rispetto sia ai campioni che hanno subito solo il pretrattamento con acido salicilico (SA), sia ai campioni che sono stati infettati con Fusarium culmorum (F.c.).

FIG.35. ANALISI DI RT-PCR SU COLEOPTILI DI 8 GIORNI. C= controllo; F.c.= infezione con spore di Fusarium culmorum (5x106 spore/ml); SA= trattamento spray con 300μM di SA; SA+F.c.= trattamento spray con 100μM di SA e infezione con spore di Fusarium culmorum (5·106 _{spore/ml). Geni analizzati:CHITINASI, enzima che}

degrada la chitina; CEBIP, proteina di mebrana che lega la chitina; BISAMT, metil transferasi della famiglia SAMT; WRKY71, fattore di trascrizione della famiglia SAMT; NH1, omologo di NPR1 da Arabidopsis thaliana; MAPK5, proteina chinasi attivata da mitogeno 5; LOX, lipo-ossigenasi; WRKY53, fattore di trascrizione della famiglia WRKY; PR4a, proteina pathogenesis related 4a; JAMYB, fattore di trascrizione della famiglia MYB indotto da jasmonato. I cDNA sono stati standardizzati utilizzando l'ACTINA come standard interno.

Sulla base di questi risultati è possibile concludere che geni come CHITINASI, CEBIP, MAPK5 e NH1 mostrano un effetto priming a 24 hpi e/o a 48 hpi, mentre tale effetto tende a diminuire a 72 hpi che è in linea con il fatto che il priming innesca una risposta precoce, rapida ed intensa. I geni

24hpi 48hpi 72hpi

C F.c. SA _100μM SA +F.c. C F.c. SA _100μM SA +F.c. C F.c. _SA 100μM SA +F.c . CHITINASI CEBIP BISAMT WRKY71 NH1 MAPK5 LOX WRKY53 PR4a JAMYB ACTINA

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BISAMT e WRKY 71 mostrano avere invece un andamento compatibile con il priming a 48/72 hpi. Tutti questi geni risultano da letteratura essere coinvolti nel pathway del salicilico il quale viene innescato durante l'induzione del priming indotto con basse concentrazioni dello stesso (100μM). In seguito, tale pathway induce l'attivazione della SAR. Quindi, i geni analizzati in questo studio permettono di ricostruire un ipotetico pathway di trasduzione del segnale innescato dallo stress biotico. Infatti il gene CEBIP codifica per una proteina recettrice di membrana la quale riconosce e lega molecole associate al patogeno (Kaku et al., 2006), quindi è plausibile pensare che la sua espressione è stata notevolmente incrementata nella condizione di priming indotto con acido salicilico prima e con l'infezione dopo. Il gene CHITINASI codifica per una proteina coinvolta nella risposta contro i patogeni fungini (Truong et al., 2003), quindi il priming rende tale gene maggiormente espresso in modo da potenziare la difesa. Il gene codificante per la MAPK5 risulta in queste condizioni essere maggiormente espresso poiché la proteina codificata è un trasduttore del segnale coinvolto nel pathway di difesa del SA (Song and Goodman, 2002). Anche il gene codificante per NH1 risulta essere notevolmente espresso nella condizione di priming. Esso infatti è una molecola chiave nel pathway del SA che porta all'attivazione di fattori di trascrizione e quindi anche di geni di difesa (Chern et al., 2012). Il gene codificante per BISAMT ha un andamento compatibile con il priming e ciò è in accordo con il fatto che tale gene viene espresso in seguito ad interazioni fungine incompatibili come meccanismo di difesa per indurre l'attivazione della SAR (Xu et al., 2005). Un ultimo gene che risulta avere un pattern di espressione compatibile con il priming è WRKY 71 codificante per l'omonimo fattore di trascrizione, il quale viene attivato come risultato finale dell'attivazione del pathway del SA, inducendo così l'espressione dei geni di difesa (Chujo et al., 2008). Il pathway ipotetico che si potrebbe innescare sulla base delle funzioni delle proteine codificate dai geni presi in analisi, vedrebbe l'enzima chitinasi degradare la parete dei patogeni fungini, liberando molecole di chitina la quale viene riconosciuta dal recettore di membrana codificato dal gene CEBIP. Tale recettore attiva a valle una cascata di segnalazione che può coinvolgere vari trasduttori del segnale come MAPK5 e NH1. La cascata di segnalazione raggiunge il nucleo attivando varie famiglie di fattori di trascrizioni, tra cui la famiglia WRKY la quale a sua volta induce l'espressione dei geni correlati alla difesa tra cui è possibile individuare il gene codificante per BISAMT.

Sulla base di questi risultati è possibile affermare che il priming innesca una difesa molto più potente rispetto ai classici meccanismi di difesa della pianta, permettendone un'attivazione su vari livelli, incrementando l'espressione dei geni codificanti per proteine coinvolte nella difesa, recettori, trasduttori, molecole segnale, fattori di trascrizione. Tutto ciò si traduce in una maggiore possibilità di sopravvivenza della pianta in risposta allo stress.

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Nel nostro studio, geni come LOX, WRKY 53 e PR4a non sembrano essere coinvolti in tale meccanismo di difesa nonostante in letteratura emergesse un loro ruolo nella difesa in seguito a stress biotici o a trattamento con acido salicilico ( Schaffrath et al., 2000; Chujo et al., 2009; Wang

et al., 2011). Non deve invece stupire l'assenza di espressione del gene JAMYB il quale è coinvolto nel pathway di segnalazione del jasmonato e che è stato selezionato come un controllo negativo dell'esperimento.