Analisi della modalità di trasmissione della displasia retinica

Prendendo in considerazione solamente le 11 cucciolate con entrambi i genitori visitati per le oculopatie ereditarie, abbiamo osservato la loro progenie per studiare la modalità di trasmissione delle diverse forme di displasia retinica. I riproduttori in totale possono essere suddivisi in 4 soggetti maschi (riproduttore 22, riproduttore 54, riproduttore 63 e riproduttore 69) e 6 soggetti femmine (riproduttore 23, riproduttore 24, riproduttore 52, riproduttore 53, riproduttore 62 e riproduttore 64). Tra questi riproduttori ne risultano 7 esenti fenotipicamente da displasia retinica (70%) e 3 affetti (30%). Due presentano la forma focale monolaterale, invece uno è affetto dalla forma geografica; per cui risultano 9 cucciolate (81,8%) in cui i riproduttori sono esenti o affetti dalla forma focale e 2 cucciolate (18,1%) tra un soggetto esente e uno affetto dalla forma geografica. Tra le 11 cucciolate, una di esse, ossia quella tra il riproduttore 22 e il riproduttore 23 è stata ripetuta due volte. Per studiare le modalità di trasmissione abbiamo suddiviso le cucciolate in base ai riproduttori di sesso maschile.

7.4.1 Riproduttore 22

Il riproduttore 22 è affetto da displasia retinica focale monolaterale. È stato accoppiato per due volte con il riproduttore 23, esente fenotipicamente da displasia retinica, e hanno generato un totale di 8 cuccioli, come possiamo osservare nella tabella seguente:

Riproduttore accoppiato

con R22

Cucciolo Sesso Diagnosi di displasia 23 C1 F Sospetto 23 C2 F Esente 23 C3 M Esente 23 C4 M Esente 23 C5 M Esente 23 C6 F Esente 23 C7 M Esente 23 C8 F Esente

Tabella 6 – Situazione figli del riproduttore 22

Sette dei loro figli sono risultati fenotipicamente esenti da displasia retinica; invece un figlio risulta sospetto, quindi con possibile displasia retinica.

% cuccioli esenti % cuccioli sospetti

87,5% 12,5%

Tabella 7 – % cuccioli tra il riproduttore 22 e il riproduttore 23

7.4.2 Riproduttore 54

Il riproduttore 54 è fenotipicamente esente da displasia retinica. È stato accoppiato con tre femmine diverse, ossia riproduttore 24, riproduttore 53 e riproduttore 62; tutte queste fattrici sono fenotipicamente esenti da displasia retinica. Andiamo a visualizzare nella tabella sottostante la situazione dei cuccioli (16):

Riproduttore accoppiato con

R54

Cucciolo Sesso Diagnosi di displasia 24 C9 F Affetto 24 C10 F Esente 24 C11 M Esente 24 C12 F Affetto 24 C13 F Affetto 24 C14 M Esente 53 C15 F Esente 53 C16 F Affetto 53 C17 F Esente 53 C18 F Affetto 53 C19 M Esente 53 C20 M Esente 53 C21 M Affetto 53 C22 M Esente 53 C23 M Esente 62 C24 F Esente

Tabella 8 – Situazione figli del riproduttore 54

Tra i 6 figli del riproduttore 54 e del riproduttore 24 ne risultano 3 esenti e 3 affetti (2 dei quali dalla forma focale monolaterale e 1 con la forma focale all’occhio destro e la forma multifocale e la forma geografica all’occhio sinistro).

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

50% 50%

Nella tabella 7 possiamo osservare anche la cucciolata del riproduttore 54 con il riproduttore 53. La coppia ha generato 9 cuccioli, di cui 6 esenti e 3 affetti da forme focali/multifocali.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

66,7% 33,3%

Tabella 10 – % cuccioli tra il riproduttore 54 e il riproduttore 53

Il riproduttore 54 è stato anche accoppiato con il riproduttore 62, fenotipicamente esente. Da questo accoppiamento è nato solo un cucciolo, esente da displasia retinica.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

100% 0%

Tabella 11 – % cuccioli tra il riproduttore 54 e il riproduttore 62

7.4.3 Riproduttore 63

Il riproduttore 63 è fenotipicamente esente da displasia retinica. È stato accoppiato con tre femmine diverse, ossia riproduttore 52, riproduttore 62 e riproduttore 64. Il riproduttore 62 è l’unico esente fenotipicamente da displasia retinica; il riproduttore 64 è invece affetto da displasia retinica focale monolaterale. Anche il riproduttore 52 è affetto da displasia retinica ma presenta invece la forma geografica monolaterale. Nella tabella sottostante andiamo a osservare la situazione di tutti i 30 cuccioli figli del riproduttore 63:

Riproduttore accoppiato con R63

Cucciolo Sesso Diagnosi di displasia 52 C25 M Esente 52 C26 F Esente 52 C27 M Esente 52 C28 F Esente 52 C29 M Esente 52 C30 M Esente 52 C31 M Esente 52 C32 M Esente 62 C33 F Esente 62 C34 F Esente 62 C35 M Affetto 62 C36 F Affetto 62 C37 M Esente 62 C38 F Esente 62 C39 F Esente 62 C40 M Affetto 62 C41 F Esente 62 C42 M Esente 64 C43 M Esente 64 C44 M Esente 64 C45 M Affetto 64 C46 F Esente 64 C47 F Esente 64 C48 M Affetto 64 C49 M Esente 64 C50 M Esente 64 C51 M Esente 64 C52 M Esente 64 C53 M Affetto 64 C54 F Esente

Dall’accoppiamento tra il riproduttore 63 e il riproduttore 52 risultano 8 cuccioli tutti esenti da displasia retinica.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

100% 0%

Tabella 13 – % cuccioli tra il riproduttore 63 e il riproduttore 52

Nella tabella 8 possiamo osservare anche i 10 figli del riproduttore 63 e del riproduttore 62. Sette di essi risultano fenotipicamente esenti da displasia mentre tre manifestano la forma focale/multifocale.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

70% 30%

Tabella 14 – % cuccioli tra il riproduttore 63 e il riproduttore 62

Il riproduttore 63 è stato accoppiato anche con il riproduttore 64; questa coppia ha generato 12 figli, di cui 9 esenti e 3 affetti dalla forma focale monolaterale.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

75% 25%

Tabella 15 – % cuccioli tra il riproduttore 63 e il riproduttore 64

7.4.4 Riproduttore 69

Il riproduttore 69 è fenotipicamente esente da displasia retinica. È stato accoppiato con tre femmine diverse, ossia il riproduttore 52, il riproduttore 53 e il riproduttore 64. Il riproduttore 53 è fenotipicamente esente da displasia retinica, il riproduttore 64 è affetto da displasia retinica focale monolaterale. Anche il riproduttore 52 è affetto da displasia retinica ma ha invece la forma geografica monolaterale. Andiamo a visualizzare nella tabella sottostante la situazione dei 15 figli del riproduttore 69:

Riproduttore accoppiato con

R69

Cucciolo Sesso Diagnosi di displasia 52 C55 M Esente 52 C56 F Esente 52 C57 F Esente 52 C58 F Esente 52 C59 M Esente 52 C60 F Esente 53 C61 M Esente 53 C62 M Affetto 64 C63 F Affetto 64 C64 F Esente 64 C65 M Esente 64 C66 F Esente 64 C67 F Esente 64 C68 F Esente 64 C69 F Esente

Tabella 16 – Situazione figli del riproduttore 69

Dall’accoppiamento tra il riproduttore 69 e il riproduttore 52 risultano 6 cuccioli tutti esenti da displasia retinica.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

100% 0%

In tabella 9 possiamo osservare anche i 2 figli del riproduttore 69 e del riproduttore 53, uno di essi risulta esente da displasia e l’altro affetto dalla forma focale.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

50% 50%

Tabella 18 – % cuccioli tra il riproduttore 69 e il riproduttore 53

Dall’accoppiamento tra il riproduttore 69 e il riproduttore 64 sono nati 7 figli, di cui solo uno affetto dalla forma focale e gli altri 6 esenti.

% cuccioli esenti % cuccioli affetti

85,7% 14,3%

CAPITOLO 8 – Discussione

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di valutare gli aspetti clinici delle diverse forme di displasia retinica e di analizzare le loro modalità di trasmissione in un gruppo di 206 soggetti di razza Labrador Retriever, provenienti dalla Scuola Nazionale Cani Guida per Ciechi di Scandicci (FI). Le visite oftalmologiche di questi soggetti sono state effettuate in un periodo di 105 mesi, da Gennaio 2007 a Novembre 2016. L’età media dei pazienti è di 16,62 mesi (range 6-116 mesi), in linea con quanto riportato da altri autori [44]. Alcuni veterinari oftalmologi europei e americani [23] hanno riscontrato la comparsa della forma multifocale e soprattutto della forma geografica, in cani di 5-6 e 18 mesi che erano stati dichiarati normali quando erano stati esaminati da cuccioli all’età di circa 8 settimane; questo avviene poiché la displasia retinica può comparire anche in periodi successivi a una prima visita se fatta su animali molto giovani [44]. Alla luce di queste osservazione possiamo affermare che l’età media dei nostri pazienti rientra perfettamente nel periodo corretto per effettuare una diagnosi certa di displasia retinica. Nello studio di Holle et al. [23] l’età ottimale per effettuare una visita per la diagnosi della forma geografica di displasia retinica è di 18 mesi poiché se dichiariamo il soggetto esente in tale data non svilupperà la displasia retinica in seguito; i soggetti da noi visitati affetti dalla forma geografica sono stati visitati a 13, 15 e 16 mesi.

In generale, non abbiamo riscontrato nessuna differenza legata al sesso nella comparsa della displasia retinica, anzi i soggetti di sesso femminile e maschile risultano colpiti in numero abbastanza simile con una leggera prevalenza delle femmine. Le forme di displasia retinica che abbiamo diagnosticato sono di seguito elencate in ordine di frequenza: la displasia focale monolaterale, la displasia multifocale bilaterale, la displasia multifocale monolaterale, la displasia geografica monolaterale, la displasia focale bilaterale e la displasia geografica bilaterale. Nessuno dei soggetti del nostro studio ha manifestato la forma di displasia totale con

distacco retinico. Come emerge dalla letteratura [43] anche il nostro studio ci ha confermato che la forma focale di displasia retinica è quella che compare più frequentemente nel Labrador Retriever. La maggior parte dei soggetti presenta lesioni monolaterali, ed il più colpito risulta di poco essere l’occhio sinistro. Tra le forme bilaterali, le lesioni che abbiamo riscontrato sono risultate sempre non simmetriche tra i due occhi e in un soggetto abbiamo riscontrato tre forme di displasia diverse, una in un occhio e due nel controlaterale; questi dati coincidono esattamente con quanto riportato in letteratura [23].

Il Labrador Retriever può anche essere colpito da una grave forma di displasia associata a malformazioni scheletriche, la patologia si chiama Sindrome displasia oculo-scheletrica (OSD); per questa patologia esiste un test genetico per svelare la mutazione che la causa [48]. Nessuno dei soggetti del nostro studio ha effettuato il test del DNA RD/OSD, in quanto nessuno manifestava alterazioni scheletriche e perché in Italia non ci sono evidenze cliniche che giustifichino l'utilizzo di questo test.

Per quanto riguarda lo studio genetico abbiamo calcolato, attraverso l’analisi dei pedigree dei soggetti visitati e la loro suddivisione in gruppi familiari, il coefficiente di parentela tra i riproduttori e il coefficiente di consanguineità (F) dei loro figli. La parentela è un rapporto tra due soggetti, invece la consanguineità (inbreeding) è propria di un individuo e indica la frazione di loci all’interno del genoma in cui sono presenti alleli identici per origine. Questa probabilità assume valori diversi da zero quando i genitori sono tra loro parenti. La consanguineità porta ad un aumento della frequenza di individui omozigoti nella popolazione e si quantifica attraverso il coefficiente di inbreeding, che corrisponde alla metà del rapporto di parentela tra i genitori. In tutte le cucciolate da noi analizzate questi due coefficienti risultano sempre particolarmente bassi come già riportato in letteratura in studi precedenti che valutavano una popolazione di Labrador Retriever sempre selezionati dalla Scuola Nazionale Cani Guida per Ciechi di Scandicci (FI) [52]. Abbiamo determinato il coefficiente di consanguineità perché è un valore utile

negli accoppiamenti in cui i genitori non hanno effettuato la visita oculistica, quindi di cui non conoscevamo minimamente il fenotipo. Un coefficiente di consanguineità alto ci avrebbe aiutato a risalire al genotipo dei riproduttori in quanto la consanguineità è il fattore di rischio più importante per la ricorrenza di malattie autosomiche recessive [53]. Se una malattia autosomica recessiva è rara, è tanto più probabile che origini dall’accoppiamento tra soggetti consanguinei poiché essi hanno antenati comuni, per cui sono più a rischio di essere portatori sani della stessa mutazione genetica. In solo un accoppiamento, abbiamo un valore del coefficiente di parentela relativamente alto (0,25) ma quella cucciolata non rientra nello studio sulle modalità di trasmissione delle diverse forme di displasia poiché ha generato solo una figlia femmina esente fenotipicamente dalla malattia.

Nel Labrador Retriever la trasmissione della displasia retinica si sospetta che sia di tipo autosomico-recessivo [14], [25], [37], [42], [43]; quindi i genitori devono essere entrambi portatori e avere genotipo eterozigote (Aa) oppure affetti, e quindi con genotipo omozigote recessivo (aa), per causare la malattia nella discendenza. Al giorno d’oggi non esiste ancora un test genetico per svelare con certezza le mutazioni che causano queste alterazioni. Le caratteristiche delle malattie autosomiche recessive sono: stessa probabilità di trasmissione ai figli maschi e alle figlie femmine; i soggetti affetti hanno solitamente genitori normali, infatti la maggior parte delle volte la mutazione salta una generazione; il 25% dei figli di due genitori eterozigoti manifesta il carattere fenotipico; due riproduttori affetti generano il 100% dei figli affetti; la frequenza della malattia è maggiore nelle cucciolate tra consanguinei [53].

Madre Pad re A a A AA Aa a Aa aa

Come possiamo notare dalla tabella 20, in un accoppiamento tra due soggetti portatori sani, ossia con fenotipo esente per la patologia ma genotipo eterozigote (Aa) si ottiene:

- il 25% dei figli che non ereditano dai genitori nessuno degli alleli mutati e quindi avranno genotipo omozigote AA. Questi soggetti non trasmetteranno l’allele con la mutazione in quanto hanno entrambe le copie normali del gene.

- il 50% dei figli che ereditano una copia normale e una mutata del gene, per cui avranno genotipo eterozigote Aa. Come i riproduttori, questi soggetti saranno portatori sani e quindi avranno la probabilità del 50% di trasmettere ai loro figli l’allele mutato a.

- il 25% dei figli che ereditano entrambe le copie alterate del gene e quindi avranno genotipo omozigote aa e quindi manifesteranno la patologia [53].

Per effettuare uno studio sulle modalità di trasmissione della forma focale/multifocale e della forma geografica dividiamo le 11 cucciolate in base al fenotipo dei genitori in:

 tra entrambi i riproduttori esenti (5/11; 45,5%);

 cucciolate tra un riproduttore esente e uno affetto da displasia retinica focale monolaterale (4/11; 27,3%);

 cucciolate tra un riproduttore esente e uno affetto da displasia geografica monolaterale cucciolate (2/11; 18,2%).

Prendendo in considerazione i dati delle tabelle 9, 10, 11, 14 e 18, ossia le percentuali dei cuccioli fenotipicamente esenti e cuccioli affetti da forme di displasia retinica nelle cucciolate tra riproduttori esenti, abbiamo questi risultati:

Accoppiamento % cuccioli esenti % cuccioli affetti Tot. cuccioli R54 x R24 50% 50% 6 R54 x R62 100% 0% 1 R54 x R53 66,7% 33,3% 9 R63 x R62 70% 30% 10 R69 x R53 50% 50% 2

Tabella 21 - % cuccioli esenti e cuccioli affetti nelle cucciolate tra riproduttori esenti

Analizzando questi dati possiamo concordare con la letteratura sull’ipotizzare che la displasia retinica abbia trasmissione autosomica- recessiva [32]. Nonostante non sia possibile dare una conferma sulla significatività statistica, i dati ci suggeriscono questa modalità di trasmissione poiché abbiamo riscontrato che in cucciolate tra riproduttori fenotipicamente esenti, più del 25% dei cuccioli sono affetti (solo una cucciolata, come possiamo vedere, ha il 100% dei cuccioli esenti, ma è una cucciolata in cui è presente un solo soggetto e ciò non è un dato significativo) e poichè la probabilità di trasmissione tra figli maschi e femmine è pressoché la stessa (60% femmine/40% maschi). Quindi possiamo ipotizzare che i riproduttori 24, 53, 54, 62, 63 e 69 abbiano genotipo eterozigote Aa per la forma di displasia retinica focale/multifocale.

A questo punto possiamo andare ad analizzare le altre cucciolate tra riproduttori fenotipicamente esenti e riproduttori affetti dalla forma focale. Nella tabella 6 possiamo osservare i cuccioli nati dall'accoppiamento tra il riproduttore 22, affetto dalla forma focale monolaterale e il riproduttore 23, esente. Sette dei loro figli sono risultati fenotipicamente esenti da displasia retinica, quindi, avendo un genitore affetto, potremmo ipotizzare che abbiano genotipo eterozigote (Aa). Un figlio risulta sospetto, quindi con possibile displasia retinica. Se fosse certamente affetto avrebbe genotipo aa e quindi il riproduttore 23 avrebbe

sicuramente genotipo eterozigote. Riassumiamo la situazione nella tabella sottostante: Madre–R23 Pad re -R22 A a a Aa aa a Aa aa Tabella 22

Invece se tale cucciolo fosse esente, avrebbe come gli altri fratelli genotipo eterozigote e di conseguenza il riproduttore 23 avrebbe genotipo omozigote dominante (AA) e tutti i cuccioli sarebbero invece eterozigoti, e quindi portatori della displasia:

Madre-R23 Pad re -R22 A A a Aa Aa a Aa Aa Tabella 23

Tra le due ipotesi risulta, per i rapporti statistici tra cuccioli esenti e cuccioli affetti (1:1 vs 1:0), più probabile la seconda ipotesi, ossia che il cucciolo sospetto sia esente da displasia retinica.

Nella tabella 12 possiamo osservare invece i cuccioli tra il riproduttore 63 esente fenotipicamente ma con genotipo probabilmente eterozigote (Aa) e il riproduttore 64, affetto dalla forma focale monolaterale, quindi con probabile genotipo aa. Questa coppia ha generato 12 figli, di cui 9 esenti e 3 affetti dalla forma focale monolaterale.

Madre-R64 Pad re -R63 a a A Aa Aa a aa aa Tabella 24

In questo caso ci dovremmo attendere il rapporto statistico di 1:1, ossia il 50% di cuccioli fenotipicamente esenti e il 50% di cuccioli affetti; invece in questa cucciolata ritroviamo il 75% di cuccioli esenti e il 25% di cuccioli affetti. La semplice spiegazione di questa incongruenza nelle percentuali è dovuta al fatto che abbiamo dati limitati. Però il fatto che ci siano dei cuccioli affetti ci conferma l’ipotesi che il riproduttore 63 abbia possibile genotipo eterozigote. Se avesse ipoteticamente avuto genotipo omozigote dominante AA, l’accoppiamento in questione sarebbe diventato AA x aa e, quindi, nella cucciolata ci sarebbe dovuto essere il 100% di soggetti fenotipicamente esenti e nessun cucciolo affetto.

Nella tabella 19 infine possiamo osservare i cuccioli tra il riproduttore 69 e il riproduttore 64. Il discorso si equivale a quello della precedente cucciolata, ma cambia il numero dei cuccioli, che in questa cucciolata sono 7, di cui 6 esenti e 1 affetto da displasia retinica focale; in questo caso le percentuali di cuccioli esenti/affetti sono ancora più basse (85,7% vs 14,3%). Madre-R64 Pad re -R69 a a A Aa Aa a aa aa Tabella 25

Il riproduttore 52, affetto dalla forma geografica, è stato accoppiato con due soggetti diversi: il riproduttore 54 e il riproduttore 69, entrambi fenotipicamente esenti ma con probabile genotipo eterozigote Aa per la forma focale/multifocale. Prendendo in considerazione le tabelle 12 e 16 possiamo notare che tutti i 14 figli nati da queste due cucciolate sono esenti fenotipicamente da qualsiasi forma di displasia retinica (100% di cuccioli fenotipicamente esenti). Se la forma geografica fosse correlata genotipicamente alla forma focale/multifocale questi dati potrebbero sembrare un po’ anomali, in quanto in una cucciolata tra un soggetto affetto aa e un soggetto portatore Aa dovrebbe nascere il 50% di soggetti affetti. Questi dati, seppur limitati, ci potrebbero indicare una diversa mutazione genetica causa della forma geografica di displasia retinica rispetto alla forma focale/multifocale nei Labrador Retriever.

CAPITOLO 9 – Conclusioni

Il Labrador Retriever è la razza maggiormente sottoposta a visite e controlli oculistici in Italia, vista la sua notevole diffusione (è la terza razza più diffusa in Italia con 9546 esemplari registrati nell’anno 2015 all’Ente Nazionale Cinofilia Italiana) e l'utilizzo di questi animali anche per impieghi socialmente utili. I soggetti del nostro studio, ad esempio, vengono addestrati come cani guida per ciechi dalla Scuola Nazionale di Scandicci (FI). Dal 2007 ad oggi, la Scuola Nazionale Cani Guida per Ciechi di Scandicci ha portato in visita per l'esenzione dalle patologie oculari in media 21 cani/anno; la media dei cani affetti da displasia retinica è di 3 soggetti/anno. Inoltre sono stati calcolati e osservati i coefficienti di parentela e di inbreeding tra i riproduttori, anche nel periodo antecedente al nostro lavoro, grazie allo studio di Cecchi et al. [52]. I valori di tali coefficienti sono risultati sempre relativamente bassi indicando un ottimale management genetico e riproduttivo della Scuola che quindi effettua già da diversi anni corretti accoppiamenti tra i riproduttori. Avere, e soprattutto mantenere, questi coefficienti bassi è molto importante per cercare di evitare qualsiasi tipo di patologie genetiche e per evitare di fissare caratteri indesiderati. Abbiamo precedentemente già affermato, infatti, che le patologie genetiche a trasmissione autosomica recessiva si riscontrano più frequentemente tra i soggetti consanguinei.

Risulta ottimale anche l'età dei soggetti alla visita oftalmologica, in quanto la media delle età di tutti i soggetti del nostro studio è di 16,62 mesi; questo valore è molto vicino ai 18 mesi, l'età entro la quale la displasia retinica può ancora manifestarsi. La letteratura riporta infatti che per la displasia retinica andrebbero visitati i cuccioli tra le 6 e le 8 settimane e poi fatti dei controlli tra i 10 e i 18 mesi [23], ossia fino al completamento dello sviluppo della retina.

tutti i figli sono stati visitati, risultino in numero limitato, possiamo ipotizzare che la displasia retinica abbia una modalità di trasmissione autosomica recessiva. Sarebbe auspicabile riuscire a visitare un gruppo di famiglie più numerose per avere una conferma di quanto riscontrato in questo lavoro. Questo è la base per poter effettuare uno studio a livello molecolare che ci potrebbe dare l'assoluta conferma della modalità di trasmissione di questa malattia. Dai nostri dati emerge che la displasia geografica non sembra essere correlata geneticamente alla forma focale/multifocale.

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