3.2 Pazienti e Metodi
3.2.2 Analisi di laboratorio
Le concentrazioni di AFP e PIVKA-II sono state misurate su campioni di siero conservati alla temperatura di -20°C fino al momento dell’analisi. I test quantitativi sono basati sul metodo della chemiluminescenza (chemiluminescent enzyme immunoassay, CLEIA) e vengono effettuati in modo completamente automatico sulla piattaforma LumipulseG1200 (Fujirebio Inc., Tokyo, Giappone).
La sensibilità analitica del test quantitativo di AFP è 0.8 ng/mL con range dinamico: 0.8 - 22.451 ng/mL e valore normale <7.4; la sensibilità analitica del test quantitativo di PIVKA-II è di 1.37 mAU/mL con range dinamico: 1.37 - 75.000 e valore normale < 48 mAU/mL). Il coefficiente di variazione dei due test è <3.3 e < 4.0% per AFP e PIVKA-II, rispettivamente133. I test sono stati eseguiti in una seduta unica presso il laboratorio di
39
riferimento dell’Azienda Ospedaliero Universitaria di Padova. I campioni in cui il valore è risultato al di fuori del range dinamico sono stati ritestati dopo appropriata diluizione.
3.2.3 Analisi statistica
Le variabili continue sono state espresse come valori mediani e range. Le variabili categoriche sono espresse come numeri e percentuali. L’andamento temporale di AFP e PIVKA-II nei casi (HCC+) e nei controlli (HCC-) è stato stimato retrospettivamente per mezzo di un modello di regressione basato sui minimi quadrati generalizzati con effetto random (Random- Effect Generalized Least Squares, RE-GLS) . Le variabili dipendenti del modello sono la trasformazione logaritmica di AFP e PIVKA-II. La trasformazione logaritmica è stata utilizzata per ridurre l'asimmetria attesa per entrambe le variabili. I predittori del modello RE- GLS sono: il tempo (variabile continua), il tempo al quadrato (variabile continua), lo status HCC (variabile dicotomica, 0 = no; 1 = si), l’interazione status HCC*tempo (dicotomico*continuo), l’interazione status HCC*tempo al quadrato (dicotomico*continuo). Non sono state utilizzate altre trasformazioni del tempo oltre al suo quadrato a causa della disponibilità di soli tre punti temporali e della distanza variabile fra essi. Coerentemente con la natura del modello, i predittori sono stati tenuti in esso indipendentemente dalla loro significatività statistica. Le stime di log10 AFP e log10 PIVKA-II elaborate dal modello di
regressione sono state presentate graficamente per aiutare l'interpretazione clinica dei risultati. L'effetto random del RE-GLS è stato assegnato al paziente. Inoltre il modello è stato sottoposto ad una validazione interna mediante bootstrap su 1000 campioni con sostituzione per renderlo più robusto e generalizzabile. Si è anche provveduto a testare il modello RE-GLS utilizzando il centro di arruolamento dei pazienti come cluster (0 = Pisa; 1 = Napoli; 2 = Padova) ed eseguendo il bootstrap all'interno di ciascun centro, tuttavia questo non ha modificato i risultati dell’analisi e non è stato riportato nel presente lavoro. Il RE-GLS è un modello robusto verso i dati mancanti, sotto l’assunzione che essi siano mancanti in modo casuale, come è ragionevole pensare sia accaduto per il presente studio. Il numero medio di campioni effettivi disponibili per l'analisi è stato di 2.8 (da 2 a 3), sia per log10 AFP che per
log10 PIVKA-II. Tutti i coefficienti di regressione e le stime ottenute dal modello sono state
presentati con i rispettivi intervalli di confidenza al 95% (95%CI). L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software Stata 15.1 (Stata Corporation, College Station, TX, USA)150.
40
3.3 Risultati
Sono stati raccolti e testati un totale di 1163 sieri così suddivisi: due campioni di siero in 91 pazienti (29 HCC+ e 62 HCC-), tre campioni di siero in 327 pazienti (95 HCC+ e 232 HCC-). Gli intervalli di tempo fra i campioni testati sono risultati ampiamente distribuiti; il tempo mediano fra il primo e l’ultimo campione è stato 13.1 (3.2; 96.0) mesi per i pazienti HCC+ e 22.8 (2.0; 74.5) mesi per i pazienti HCC-. L’ultimo siero testato nei pazienti HCC+ era il più vicino alla diagnosi, con un intervallo di tempo mediano di 0.1 mesi (-3.6; 4.7). La durata mediana del follow-up nei rimanenti 297 pazienti HCC- è stata di 14.2 (12.1:71.7) mesi a partire dall’ultimo campione testato e nessuno di questi pazienti ha sviluppato HCC durante tale periodo.
La prevalenza degli HCC+ rispetto al totale dei pazienti seguiti presso ciascuno dei tre centri è stata di 93 su 200 a Pisa (46.5%), 23 su 162 a Napoli (14.2%), 8 su 56 a Padova (14.3%). Si è osservata una maggiore prevalenza del sesso maschile, sia fra i pazienti che hanno sviluppato HCC (103/124, 83.1%) che fra i pazienti che non hanno avuto progressione neoplastica (217/294, 73.8%). L’eziologia dell’epatopatia è risultata essere l’HBV in 37 HCC+ (29.8%) e 93 HCC- (31.6%); l’HCV in 75 HCC+ (60.5%) e 170 HCC- (57.8%); non virale in 12 HCC+ (9.7%) e in 31 HCC- (10.5%). In Tabella 1 sono riassunte le caratteristiche demografiche e vengono riportate le variabili di laboratorio che si riferiscono all’ultimo campione di siero testato.
Nella Figura 1 è illustrato l’andamento temporale di log10 AFP (a) e log10 PIVKA-II (b)
stimato dal modello RE-GLS. Per entrambi i biomarcatori, i valori stimati nei pazienti HCC+ sono più elevati rispetto a quelli stimati negli HCC- e tale differenza si mantiene in tutti i punti temporali valutati nell’analisi. I coefficienti di regressione del modello RE-GLS sono riportati nella tabella 2.
E’ stato calcolato il rapporto (ratio) tra i valori dei biomarcatori stimati dal modello ad un determinato tempo e il valore basale. La Figura 2 riporta in grafico i ratio calcolati per log10
AFP e log10 PIVKA-II nei pazienti HCC+ e negli HCC-. Nei pazienti HCC- (a), i valori dei
ratio di log10 PIVKA-II calcolati a diversi tempi di osservazione si sono mantenuti vicini al
valore di 1, ovvero tendenzialmente stabili, e con intervalli di confidenza molto stretti rispetto a log10 AFP. Negli HCC + (b), i ratio di entrambi i biomarcatori hanno superato il valore di 1
in tutti i punti temporali, a segno dell’incremento stimato nel tempo da parte del modello. Come si può desumere dagli intervalli di confidenza, la precisione delle stime è risultata maggiore nei primi 24 mesi e si è ridotta successivamente a causa del minore numero di dati sperimentali disponibili per l’analisi. Per caratterizzare ulteriormente l’entità della variabilità
41
dei biomarcatori sono stati calcolati i cambiamenti di log10 AFP e log10 PIVKA-II ad un
determinato tempo rispetto al basale, espressi come variazione percentuale stimata negli HCC+ rispetto agli HCC- (Tabella 3). La variazione percentuale di log10 AFP è risultata
maggiore rispetto a quella di log10 PIVKA-II per tutti gli intervalli di tempo considerati,
tuttavia l’ampiezza degli intervalli di confidenza indica che l’accuratezza delle stime di log10
PIVKA-II è superiore rispetto a quella di log10 AFP.
3.4 Discussione
La misura di un qualsiasi biomarcatore varia in relazione alla variabilità analitica del test utilizzato per quantificare l’analita e alla variabilità biologica dello stesso biomarcatore che può essere fisiologica o patologica.
Nel caso di un biomarcatore utilizzato per la sorveglianza di una neoplasia e per il quale la variabilità analitica del test sia accettabile (inferiore al 10%), diventa di fondamentale importanza definire l'entità delle fluttuazioni che caratterizzano la variabilità biologica: nello specifico, distinguere le variazioni fisiologiche, ovvero espressione di condizioni benigne da quelle patologiche che conseguono al processo neoplastico in atto.
Lo studio oggetto di questa tesi è stato condotto con lo scopo di esaminare le fluttuazioni periodiche di AFP e PIVKA-II in pazienti cirrotici che hanno o non hanno sviluppato HCC, per verificare la potenziale utilità di eseguire misure ripetute di questi biomarcatori nella sorveglianza dei soggetti ad alto rischio per questa neoplasia. Si è trattato di uno studio retrospettivo su sieri ottenuti consecutivamente a diverse cadenze temporali in pazienti cirrotici sottoposti a sorveglianza ecografica per HCC, con o senza sviluppo di HCC durante il follow-up. A tale scopo è stato costruito un modello di regressione che ha analizzato le concentrazioni sieriche dei biomarcatori in funzione del tempo e dello sviluppo di HCC, restituendo una stima del loro andamento temporale in presenza o in assenza della neoplasia (HCC+/HCC-).
Il risultato rilevante dell’analisi è che l’andamento temporale dei log10 di AFP e PIVKA-II
stimato dal modello di regressione nei pazienti che hanno sviluppato la neoplasia (HCC+) si distingue dall’andamento stimato nei pazienti senza neoplasia (HCC-). La Figura 1 mostra che le traiettorie dinamiche dei biomarcatori negli HCC+ (in blu) e negli HCC- (in nero) non si intersecano e che la distanza già evidente al tempo 0 tende a diventare più netta nei punti temporali successivi. La ridotta ampiezza degli intervalli di confidenza è un segnale dell’accuratezza delle stime e di robustezza del modello. Sulla base di queste evidenze
42
analitiche si può ipotizzare che lo studio delle fluttuazioni di AFP e PIVKA-II attraverso misure ripetute nel tempo possa avere un’utilità clinica nella sorveglianza.
Un altro risultato rilevante emerso dall’analisi modellistica, è il diverso comportamento di AFP e PIVKA-II nei pazienti HCC-. Il grafico in Figura 2 illustra i ratio fra il valore del biomarcatore stimato del modello ad un determinato tempo e il valore basale, con i rispettivi intervalli di confidenza. Risulta evidente come i ratio calcolati per il log10 PIVKA-II non si
discostino significativamente da 1 se non dopo i 24 mesi di tempo, quando la precisione della stima si riduce come dimostrato dalla maggiore ampiezza degli intervalli di confidenza. Al contrario, i ratio calcolati per il log10 AFP mostrano uno scostamento dal valore di 1 già dai
primi 3 mesi di tempo e presentano intervalli di confidenza più ampi che denotano una minore precisione nella stima rispetto al log10 PIVKA-II. E’ verosimile che queste differenze
riflettano il diverso meccanismo biologico di produzione dei due biomarcatori, e in particolare il fatto che PIVKA-II non è influenzato dall’attività necro-infiammatoria della malattia epatica di base a differenza dell’AFP che si associa anche alla normale rigenerazione epatica indotta dalla necro-infiammazione101,125.
Il presente studio retrospettivo con cadenze temporali variabili delle determinazioni dei biomarcatori non ha permesso di quantificare l’entità della variabilità biologica di AFP e PIVKA-II clinicamente rilevante nella diagnosi di HCC; tuttavia ha reso possibile calcolare i contrasti fra le stime ad un determinato tempo e il valore basale, ed esprimere tali contrasti come variazioni percentuali negli HCC + rispetto agli HCC-. La Tabella 3 riporta le variazioni percentuali negli HCC+ per i due biomarcatori a determinati tempi e conferma la maggiore variabilità e la minore precisione della stima di log10 AFP rispetto a log10 PIVKA-II.
Prendendo ad esempio un intervallo di 6 mesi, che corrisponde alla finestra di tempo ideale per la sorveglianza ecografica dei pazienti a rischio, la variabilità negli HCC+ rispetto agli HCC- equivale all’11% (95%CI:5-17%) per log10 AFP e al 5% (95%CI:1-8%) per log10
PIVKA-II.
Sulla base di questi dati è ipotizzabile che un aumento dei livelli sierici di PIVKA-II superiore a 2 deviazioni standard della variabilità analitica del test possa essere clinicamente rilevante per la diagnosi di HCC; al contrario è giustificabile attendersi che i cambiamenti di AFP debbano essere più rilevanti per essere informativi.
Tutti questi risultati sono in accordo con l'evidenza che l'attività di malattia influenzi l’accuratezza diagnostica di AFP in misura molto maggiore rispetto a quella di PIVKA-II110. Da questo punto di vista la popolazione coinvolta nel presente studio mostrava un’ampia eterogeneità; infatti il 90% dei pazienti con cirrosi HBV-correlata erano in trattamento
43
antivirale con viremia soppressa e normalità degli enzimi epatici, per contro, solo il 31% dei pazienti con epatopatia da HCV era sottoposto ad un trattamento antivirale, e solo un 43% di essi aveva enzimi epatici nella norma.
Il limite principale del presente studio consiste nel fatto che i campioni di siero su cui sono stati testati AFP e PIVKA-II si trovano ad intervalli temporali molto variabili fra loro. Per poter superare questo limite è stato scelto un modello di regressione costruito sul tempo (utilizzato come variabile continua) e sull’interazione del tempo con lo status di HCC, assegnando un effetto random al livello del paziente. Sebbene da un punto di vista teorico questo approccio sia accettabile, non permette, come anticipato, di giungere ad un’adeguata identificazione della variazione quantitativa utile per identificare il rischio neoplastico. A tal scopo sarà necessario uno studio nel quale i campioni di siero siano raccolti a tempi equidistanti (ad esempio semestrali). Un altro limite è la sopracitata eterogeneità dei pazienti arruolati nello studio, sia in termini di eziologia che di attività di malattia, condizione sicuramente rappresentativa dei pazienti abitualmente seguiti, ma non adeguata per l’identificazione delle variazioni significative nei diversi sottogruppi.
Infine, occorre sottolineare che la prevalenza di HCC è risultata sostanzialmente differente fra i tre centri partecipanti allo studio, essendo 46.5% a Pisa, 14.2% a Napoli e 14.3% a Padova. Questa differenza è dovuta al fatto che il requisito fondamentale per l’inclusione nello studio era che vi fossero almeno due campioni di siero a disposizione per ciascun paziente e il centro di Pisa è risultato quello con la maggiore frequenza di pazienti che soddisfacevano tale criterio. Per verificare il peso di questo bias di selezione, l’analisi di regressione è stata ripetuta utilizzando il centro di arruolamento dei pazienti come cluster ed eseguendo il bootstrap all'interno di ciascun centro, tuttavia questo approccio non ha modificato in nessun modo i risultati sopra riportati.
In conclusione, lo studio delle fluttuazioni sieriche di AFP e PIVKA-II nei pazienti a rischio di HCC ha mostrato che la variabilità biologica dei due biomarcatori aumenta nel tempo in modo rilevante nei pazienti che sviluppano HCC. Questa osservazione supporta l’utilità di effettuare misure periodiche di AFP e PIVKA-II durante la sorveglianza dei pazienti a rischio. Un campionamento dei biomarcatori ad intervalli di tempo regolari potrebbe permettere di quantificare l’entità della variabilità dei biomarcatori nel tempo e identificare le variazioni clinicamente significative per la diagnosi precoce di HCC. Se validato in studi prospettici, un simile approccio potrebbe aggiungersi alle altre strategie di ottimizzazione dei biomarcatori e contribuire a personalizzare i programmi di sorveglianza sulla base di una fine stratificazione del rischio individuale.
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3.5 Figure e Tabelle
Tabella 1: Dati demografici e di laboratorio
HCC - HCC+ Totale Sesso M F 217 (73.8) 77 (26.2) 103 (83.1) 21 (16.9) 320 (76.6) 98 (23.4) Eziologia HBV HCV Non virale 93 (31.6) 170 (57.8) 31 (10.5) 37 (29.8) 75 (60.5) 12 (9.7) 130 (31.1) 245 (58.6) 43 (10.3) Centro Pisa Napoli Padova 107 (36.4) 139 (47.3) 48 (16.3) 93 (75.0) 23 (18.5) 8 (6.5) 200 (47.8) 162 (38.8) 56 (13.4) Età (anni) (33.3 - 87.3) 63.5 (37.2 - 87.7) 65.9 (33.3 - 87.7) 64.2 AFP (ng/mL) (1.1 - 179.8) 4.2 (1.5 - 8198.9) 8.3 (1.1 - 8198.9) 5.0 PIVKA-II (mAU/mL) (4 - 53541) 32 (9 - 31155) 66 (4 - 53541) 35 AST (U/L) 26 (10 - 196) 43 (14 - 490) 29 (10 - 490) ALT (U/L) 22 (8 - 298) 34 (10 - 480) 26 (8 - 480) GGT (U/L) (9 - 497) 31 (14 - 378) 60 (9 - 497) 38 ALP (U/L) (30 - 424) 76.5 (39 - 585) 102.5 (30 - 585) 85 Albumina (g/dL) (2.6 - 5.2) 4.3 (2.6 - 8.1) 4.1 (2.6 - 8.1) 4.2 PT (%) (18 - 116) 81.5 (46 - 111) 83 (18 - 116) 82 INR (0.92 - 3.17) 1.10 (0.96 - 1.52) 1.11 (0.92 - 3.17) 1.10 PCHE (U/L) (1064 - 16458) 6383.5 (1278 - 9253) 5664 (1064 - 16458) 6192 Bilirubina totale (mg/dL) (0.22 - 6.29) 0.95 0.79 (0.21 - 2.90) 0.90 (0.21 - 6.29) Bilirubina diretta (mg/dL) 0.35 (0.10 - 2.90) 0.32 (0.05 - 1.29) 0.35 (0.05 - 2.90) G.B. (x 103/mL) 5.0 (1.7 – 12.6) 4.8 (1.7 – 8.9) 4.9 (1.7 – 12.6) Piastrine (x 109/L) 121 (23 - 670) 110.5 (33 - 291) 115 (23 - 670)
Note: AFP, alfa-fetoproteina; ALP, fosfatasi alcalina; ALT, alanina aminotransferasi; AST, aspartato aminotransferasi; G.B., Globuli Bianchi; GGT, gamma-glutamiltransferasi; INR, International Normalized Ratio; PIVKA-II, Proteina indotta dall’assenza/antagonismo della Vitamina-K II; PT, Tempo di Protrombina; PCHE, Pseudocolinesterasi.
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Tabella 2: Coefficienti di regressione del modello RE-GLS
Predittori Log10 AFP Log10 PIVKA-II
HCC+ 0.173*** [0.074 ; 0.272] 0.088 [-0.024 ; 0.200] Tempo -0.010 ** [-0.016 ; -0.004] -0.000 [-0.007 ; 0.006] HCC+*Tempo 0.17** [0.05 ; 0.30] 0.18** [0.05 ; 0.31] Tempo*Tempo 0.018*** [0.008 ; 0.028] 0.014* [0.002 ; 0.025] HCC+*Tempo*Tempo 0.000 * [0.000 ; 0.000] 0.000 [-0.000 ; 0.000] HCC+*Tempo*Tempo -0.000* [-0.001 ; -0.000] -0.000 [-0.001 ; 0.000] Intercetta 0.799 *** [0.748 ; 0.850] 1.599*** [1.542 ; 1.656] Valori di 95%CI fra parentesi.
* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001
Tabella 3: Variazioni percentuali rispetto al basale ad un determinato tempo nei pazienti HCC+ vs HCC- Tempo (mesi) Log10 AFP (%) Log10 PIVKA-II (%) 3 6 (3 ; 9) 2 (0 ; 4) 6 11 (5 ; 17) 5 (1 ; 8) 12 19 (10 ; 29) 8 (3 ; 14) 24 27 (15 ; 38) 14 (6 ; 21) 36 (6 ; 39) 23 (5 ; 26) 16 48 7 (-29 ; 42) 15 (-6 ; 36) Valori di 95%CI fra parentesi.
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Figura 1: Andamento temporale dei biomarcatori stimato dal modello RE-GLS
Andamento di log10 AFP (a) e log10 PIVKA-II (b) stimato dal modello di regressione RE-GLS
(cfr. Analisi statistica per i dettagli). I valori sono presentati come medie e intervalli di confidenza al 95%.
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Figura 2: Andamento dei ratio fra il valore dei biomarcatori stimati ad un determinato tempo e il valore basale
Ratio fra valori di log10 AFP e log10 PIVKA-II a determinati tempi (3, 6, 12, 24, 36 e 48 mesi)
e i rispettivi valori basali stimati dal modello RE-GLS nei pazienti HCC- (a) e HCC+ (b) (cfr. Analisi statistica per i dettagli). Valori superiori a 1 indicano un trend ascendente; valori inferiori ad 1 indicano un trend discendente. Le aree colorate corrispondono agli intervalli di confidenza al 95%.
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