Analisi immunologiche

Sono stati impiegati topi ibridi B6D2/F1, derivati dall’incrocio di topi inbred C57BL6 e DBA2, femmine, di circa 4-5 settimane di età (Harlan Laboratories, Italia). Gli animali sono stati stabulati presso il Centro di Servizi Interdipartimentale-Stazione per la Tecnologia Animale (STA) dell’Università di Roma Tor Vergata. I topi sono stati stabulati in condizioni ambientali controllate: temperatura (20±2°C), umidità relativa (50±10%), ventilazione (15 ricambi l’ora), regolare ciclo giorno/notte (12 ore/12 ore), alimentazione con dieta standard Serie 4 RF 18 (Mucedola s.r.l., Italia) ed acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo i

63 criteri stabiliti dal Decreto Legislativo n. 116 del 27/1/92. Un medico veterinario ha seguito il benessere animale in tutte le fasi della sperimentazione.

3.5.2 Schema sperimentale

Gli animali sono stati suddivisi in 7 gruppi sperimentali costituiti da un numero variabile di animali. L’immunizzazione è stata eseguita attraverso una prima immunizzazione o priming (Giorno 0) e due richiami o boosting (Giorno 14 e 35) ed è stata caratterizzata dalla somministrazione di una quantità di 100 µg, 50 µg o 25 µg di nanoparticelle, rispettivamente. Le VNPs sono state somministrate per via sottocutanea, mentre l’adiuvante BCG per via intradermica. Per ottenere la chimera in forma aggregata, le CVNPs di TBSV-GP63 sono state incubate a 100°C per 5 m e poi sono state iniettate a t.a. nel topo. Il sacrificio è stato compiuto 49 giorni dopo il priming.

3.5.3 Risposta di ipersensibilità ritardata

La risposta di ipersensibilità ritardata (DTH, delayed-type hypersensitivity) è un saggio in vivo che viene utilizzato per valutare risposte immunitarie cellulo-mediate. A sei settimane dal

priming, tramite l’utilizzo di un micrometro comparatore (sensibilità 1/100 cm), è stato misurato

lo spessore del cuscinetto plantare. Dopo aver applicato un anestetico locale (Lidocaina) sul cuscinetto plantare si è proceduto con l’inoculo intraderma di 20µg/20µl di PPD (purified

protein derivative). Dopo 24, 48 e 72 h è stato misurato l’incremento dello spessore del

cuscinetto plantare.

3.5.4 Prelievi di sangue

I prelievi di sangue ottenuti attraverso il plesso retro-orbitale sono stati eseguiti prima del sacrificio, in animali anestetizzati localmente (Novesina, Novartis, Italia). Per ottenere il siero, il sangue prelevato è stato lasciato per 15 m a t.a. (20-25°C) e poi sottoposto a centrifugazione in una microcentrifuga a 15700xg per 7 m in tubi con gel separatore (Serum Separator Tube, Becton Dickinson, USA). Il siero è stato conservato a -80°C.

3.5.5 Saggio immunoenzimatico (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)

Il saggio ELISA è una tecnica biochimica usata principalmente in immunologia per rilevare la presenza di un anticorpo o di un antigene in un campione.

Il peptide GP63synth è stato diluito ad una concentrazione di 5 µg/ml in un tampone composto da carbonato di sodio 0,03 M e bicarbonato di sodio 0,068 M (pH 9.6). Successivamente 100 µl

64 di questa soluzione sono stati dispensati in pozzetti di piastre ELISA “pro-bind” (Becton Dickinson) e lasciati ad aderire a t.a. per una notte. Dopo tre lavaggi con wash buffer (PBS 1X; Tween-20 0,05%), si è proceduto a bloccare i siti di legame non specifici con 200 µl di blocking

buffer (PBS 1X; BSA 2%) per pozzetto, a t.a. per 1 h.

I sieri sono stati successivamente diluiti serialmente in assay buffer (PBS 1X; Tween-20 0,05%; BSA 0,01%) e, dopo tre lavaggi delle piastre con 200 µl di wash buffer per pozzetto, si è proceduto a dispensare nei pozzetti 100 µl dei sieri diluiti in duplicato, incubando le piastre per 2 h a 37°C. Dopo tre lavaggi con wash buffer sono stati aggiunti gli anticorpi secondari, coniugati con una perossidasi (HRP) e diluiti in assay buffer, specifici per l’isotipo murino IgG (goat anti-

mouse IgG, Invitrogen) o per le sottoclassi IgG1 (goat anti-mouse IgG1, Invitrogen) ed IgG2a

(goat anti-mouse IgG2a, Bethyl) e le piastre sono state incubate a t.a. per 1 h.

Dopo 3 ulteriori lavaggi con wash buffer, è stata aggiunta OPD fast (o-Fenilendiammina di- idrocloridata, Sigma), il substrato della perossidasi, e dopo 5-15 m di incubazione a t.a. la reazione è stata bloccata con 50µl H2SO4 0,18 M. Infine si è proceduto alla lettura a 490 nm dell’assorbanza ottenuta (lettore TECAN mod. Sunrise).

3.5.6 Isolamento degli splenociti dalla milza

Per ottenere l’isolamento degli splenociti, utile per gli studi sulla produzione di citochine tramite saggio ELISPOT (enzyme-linked immunospot), si è proceduto a sacrificare gli animali, disinfettare con alcol la pelliccia ed aprire la pelle con un paio di forbici sterili. Con gli animali poggiati sul fianco destro, in condizioni sterili, si è proceduto ad aprire il peritoneo in corrispondenza della milza ed a rimuovere asetticamente l’organo, il quale è stato messo in una provetta contenente 3 ml di terreno R10 composto da terreno RPMI (GibcoBRL); 10 % di FBS (Fetal Bovine Serum) inattivato al calore; 2-mercaptoetanolo 55 mM (GibcoBRL) diluito 1:1000; HEPES buffer 1M (GibcoBRL) diluito 1:100; L-glutammina 200mM (GibcoBRL) diluita 1:100 ed una soluzione 100X di penicillina-streptomicina (GibcoBRL) diluita 1:100.

Gli splenociti sono stati isolati schiacciando l’organo contro un filtro da 70 µm (cell strainer, Falcon) all’interno di una provetta da 50 ml, preventivamente contrassegnata con il numero di codice di ogni animale. Il filtro è stato lavato con terreno R10 e la sospensione cellulare ottenuta è stata poi centrifugata a 161xg per 10 m. Si è quindi proceduto alla lisi dei globuli rossi tramite risospensione del pellet in 3 ml di soluzione lisante ACK lysis buffer (GibcoBRL); dopo 5 m si è bloccata la lisi attraverso l’aggiunta di 30 ml di PBS 1X e si è centrifugato a 160xg per 10 m. Le cellule sono state lavate due volte con 20 ml di terreno R10, risospese in 20 ml dello stesso terreno, e filtrate nuovamente attraverso un filtro da 70 µm (Falcon), per rimuovere i detriti

65 cellulari derivati dalla lisi dei globuli rossi. Si è infine proceduto alla conta delle cellule diluite 1:20 nel colorante vitale Trypan blue (Lonza).

3.5.7 Saggio ELISPOT

Il saggio ELISPOT (enzyme-linked immunospot) è un saggio immunologico funzionale che permette di valutare la presenza di linfociti T specifici per un antigene; infatti, tali cellule, quando ristimolate in vitro con l’antigene specifico, rispondono secernendo citochine che vengono legate da anticorpi diretti contro le citochine stesse attaccati al fondo del pozzetto. L’avvenuto legame anticorpo-citochina viene rivelato da una reazione colorimetrica dando origine a degli spot, il cui conteggio permette di calcolare la frequenza dei linfociti T specifici per l’antigene. La metodologia utilizzata ha previsto una fase di coating, nella quale gli anticorpi anti-IFN-γ (U-Cytech), anti-IL-4 (U-Cytech) e anti-IL-10 (U-Cytech), tutti con una concentrazione di 2 mg/ml, sono stati diluiti 1:200 in PBS 1X sterile, distribuiti 100 µl per pozzetto nelle piastre (Millipore Multiscreen HTS MSIP4510) e lasciati la notte a 4°C. In seguito si è proceduto alla fase di blocking, dove le piastre sono state lavate con PBS 1X sterile per 3 volte. Eliminato il PBS 1X, sono stati distribuiti 200 µl di terreno R10 per pozzetto, lasciando poi le piastre per almeno 2 h in incubatore al 5% di CO2 e a 37°C. Dopo aver eliminato il

blocking buffer, si è proceduto alla distribuzione delle cellule e degli stimoli: a tal fine per

ciascun topo di ogni gruppo sono state previste diverse condizioni di stimolazione, ovvero nessuno stimolo (controllo negativo), il mitogeno Concanavalina A (ConA, controllo positivo) e gli stimoli specifici. Gli stimoli utilizzati sono stati ConA, GP63synth e le nanoparticelle TBSV- GP63 e TBSV-wt. In dettaglio, sono stati distribuiti in duplicato, per ciascuno stimolo, 50 µl ad una concentrazione di 2 µg/ml per pozzetto, seguiti da altri 50 µl di sospensione cellulare contenente gli splenociti (5x105 splenociti per pozzetto). Le piastre sono state lasciate in incubatore 5% CO2 , 37°C per 18 h, al fine di rilevare la presenza di IFN-γ, e 40 h per rilevare la presenza di IL-4 e IL-10. Successivamente, dopo aver lavato le piastre 7 volte con 200 µl per pozzetto di wash buffer (PBS 1X; Tween-20 0,05 %) sono stati aggiunti gli anticorpi secondari biotinilati anti-IFNγ (U-Cytech), anti-IL-4 (U-Cytech) e anti-IL-10 (U-Cytech), 50 µl per pozzetto diluiti in assay buffer (PBS 1X; FBS 5%; Tween-20 0,005%). Le piastre sono state lasciate per 3 h a t.a. e poi lavate per 4 volte con wash buffer prima di aggiungere la streptavidina-fosfatasi alcalina (SA-AP, Pharmingen) opportunamente diluita in assay buffer, 50 µl per pozzetto, e lasciata a t.a. per 2 h. In seguito le piastre sono state lavate per 4 volte con 200 µl per pozzetto di wash buffer e poi, per ottenere la reazione colorimetrica, sono stati aggiunti 50 µl per pozzetto di P-nitroblue tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfatasi (NBT/BCIP, Thermo

66 Scientific) come substrato; questo è stato lasciato reagire per 5-10 m al buio e la reazione è stata bloccata lavando le piastre con acqua distillata. Dopo aver fatto asciugare all’aria le piastre, gli spot sono stati contati usando un lettore ELISPOT automatico (A.EL.VIS ELISPOT Scanner). I dati sono stati analizzati calcolando la media dei duplicati e sottraendo il numero di spot del controllo negativo a quelli ottenuti dopo stimolazione. I dati sono mostrati come SFC (spot

forming cells) per milione di splenociti.

3.5.8 Analisi statistiche

L’analisi statistica dei dati espressi in questa tesi è stata effettuata con il test T di Student attraverso l’utilizzo del programma GraphPad® e le differenze tra i gruppi sono state considerate statisticamente significative quando p ≤ 0,05.