Progettazione e realizzazione delle chimere TBSV-PT3 e TBSV-GP63

Per la realizzazione di un vaccino contro la CanL, sono state create due chimere basate sul virus vegetale TBSV in modo tale che espongano sulla superficie esterna del virione, in fusione con la proteina CP, due peptidi altamente immunogenici derivati dalla metalloproteasi GP63 di L.

infantum.

4.2.1.1.1 Scelta degli epitopi immunogenici

Per la scelta degli epitopi da esporre sulle particelle chimeriche sono stati analizzati dati presenti in letteratura. La ricerca si è focalizzata su peptidi con comprovata attività immunologica, capaci di indurre una chiara risposta T, in particolare Th1 vista la natura del patogeno. L’attenzione è stata focalizzata principalmente su due peptidi derivati dalla glicoproteina GP63.

La metalloproteasi zinco-dipendente di Leishmania, denominata glicoproteina 63 (GP63) o Leishmanolisina, è stata descritta dal punto di vista genetico e biochimico come il maggiore antigene di superficie del protozoo (Olivier et al., 2012). Questa proteasi, appartenente alla classe delle Metzincine, presenta un motivo HExxHxxGxxH e un pro-peptide N-terminale che rende il pro-enzima inattivo durante la traduzione, tale pro-peptide viene rimosso poi opportunamente durante la maturazione della proteina per consentirne l’attivazione. Data la sua presenza in entrambe le forme replicative del patogeno, la GP63 risulta essere fondamentale nel ciclo vitale del patogeno, come dimostrato in letteratura. Studiando infatti i promastigoti di L.

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amazonensis e L. major è stato riscontrato che la proteasi GP63 gioca un ruolo chiave, in quanto

evita la lisi del patogeno mediata dal sistema del complemento (Brittingham et al., 1995) e favorisce l’internalizzazione dei promastigoti (Mosser and Edelson, 1985), promuovendo la loro interazione con i macrofagi (Brittingham et al., 1999). La GP63 è in grado inoltre di influenzare le funzioni anti-microbiche ed infiammatorie dei macrofagi, favorendo di conseguenza la sopravvivenza del patogeno nella forma amastigote (Olivier et al., 2012).

Per la progettazione delle chimere, l'attenzione si è concentrata su due zone distinte della metalloproteasi GP63: la porzione 154-169 e la porzione 467-482. La porzione 154-169 (YDQLVTRVVTHEMAHA, PT3) è stata definita come “single synthetic T cell epitope” ed è stata usata in studi di vaccinazione animale come peptide nudo dando risultati molto promettenti (Spitzer et al., 1999). La porzione 467-482 (GNVQAAKDGGNAAAGR), invece, è stata individuata grazie ad un lavoro nel quale tutta la GP63 è stata sottoposta ad epitope mapping, testando i vari peptidi sintetici anche per la capacità di stimolare la risposta T. Il peptide scelto (porzione 467-482) presentava la performance migliore rispetto agli altri peptidi testati nel lavoro e per questo è stato selezionato (Yang et al., 1991).

Si è inoltre pensato che la creazione di un peptide chimerico, formato da entrambi gli epitopi fusi fra di loro, potesse rappresentare un’innovazione e potesse potenziare ulteriormente l’attività di induzione delle risposta T rispetto ai peptidi esposti singolarmente.

E’ da notare infine che le sequenze di GP63 usate nei lavori precedentemente citati si riferiscono a L. major. Per questo progetto però si è deciso di scegliere le medesime porzioni della proteina GP63 ma di L. infantum, in quanto quest’ultimo è l’agente eziologico principale della leishmaniosi nelle aree mediterranee ed è in grado di infettare principalmente cani, ma anche esseri umani.

A tal proposito, come raffigurato nella Fig. 16, è stato constatato che le stesse porzioni nucleotidiche codificanti per GP63 in L. infantum non presentavano mutazioni tali da modificare la sequenza amminoacidica; l’unica eccezione era per la A in posizione 478 che è stata opportunamente modificata, a partire da una T, durante le fasi di ingegneria genetica per ottenere il 100% di identità con le sequenze nucleotidiche di GP63 specifiche di L. infantum.

87 Figura 16. Allineamenti amminoacidici delle sequenze della metalloproteasi GP63 di L. major (Yang et

al., 1991) e L. infantum (Acc. Num. CAB06018.1). In nero sono state sottolineate le porzioni 154-169 (Spitzer et al., 1999) e 467-482 (Yang et al., 1991) impiegate nel progetto.

4.2.1.1.2 Ingegneria genetica

Per la realizzazione delle chimere TBSV-PT3 e TBSV-GP63 è stato impiegato il vettore TBSV- vector, che è stato ingegnerizzato e dettagliatamente descritto nel paragrafo 4.1.1.

Inizialmente la CDS PT3, corrispondente al peptide YDQLVTRVVTHEMAHA (Spitzer et al., 1999), è stata ottimizzata in silico modificando la composizioni dei codoni (codon usage) in modo da massimizzare quelli preferenzialmente utilizzati da N. benthamiana (pianta ospite). E’ stato ottenuto pertanto il clone TBSV-PT3, dopo aver allestito una reazione di ligazione con il vettore TBSV-vector, opportunamente digerito ApaI/PacI, e con gli oligonucleotidi codificanti PT3 appaiati in vitro (Leish-PT3-for, Leish-PT3-rev, Tabella 1) e presentanti le opportune estremità appiccicose.

Successivamente è stato effettuato un clonaggio modulare non direzionale: il costrutto TBSV- PT3 è stato linearizzato con ApaI e messo in ligazione con gli oligonucleotidi compatibili GP63 appaiati in vitro (Leish-Gp63-for, Leish-Gp63-rev, Tabella 1) codificanti il peptide GNVQAAKDGGNAAAGR (Yang et al., 1991). Si è ottenuto così il clone TBSV-GP63. Anche in questo caso la sequenza nucleotidica codificante il peptide eterologo è stata ottimizzata in

silico. Inoltre in tutti i cloni realizzati è stata introdotta una sequenza codificante il linker

amminoacidico GGPGGGG tra l’ultimo nucleotide del gene cp ed il primo nucleotide della sequenza codificante il peptide eterologo, e nella chimera TBSV-GP63 i due peptidi PT3 e GP63 sono stati spaziati l’uno dall’altro dal linker GPGGGG (Fig. 17).

La scelta di introdurre un linker amminoacidico si basa sul presupposto di cercare di diminuire l'influenza negativa che la porzione eterologa potrebbe esercitare nei confronti dell’assemblaggio del virione. Questo linker amminoacidico difatti potrebbe favorire l’assemblaggio delle chimere, in quanto è noto che i residui di glicina conferiscono flessibilità, mentre quelli di prolina servono ad interrompere l’eventuale formazione di strutture secondarie. Inoltre per i costrutti contenenti

88 più epitopi la presenza del linker dovrebbe favorire la loro tipica conformazione nativa, indipendentemente dalla presenza delle regioni fiancheggianti.

Figura 17. Rappresentazione schematica dei costrutti a cDNA: TBSV- wt, -PT3 e -GP63 utilizzati nel

progetto. I siti di restrizione per l’ingegneria genetica sono riportati, così come la sequenza delle porzioni eterologhe esposte all'esterno del capside, sia a livello nucleotidico che a livello proteico. In rosso è indicata la porzione eterologa derivante da Leishmania, in blu il linker chimerico responsabile per la separazione dei peptidi fra di loro e tra la CP.

4.2.1.1.3 Infezione di piante di N. benthamiana

Dato che il genoma virale del virus vegetale TBSV è costituito da un singolo filamento positivo di RNA di circa 4,8 kbp, per testare la capacità infettiva delle chimere, è stato necessario produrre molecole di RNA genomico virale mediante trascrizione in vitro al fine di ottenere molecole di acido nucleico virale infettivo. Il DNA plasmidico dei costrutti TBSV-wt, TBSV- PT3 e TBSV-GP63, pertanto, dopo essere stato linearizzato con l’enzima di restrizione XmaI, è stato trascritto in vitro sfruttando la T7 RNA polimerasi, in quanto i genomi del TBSV-wt e delle chimere sono posti sotto il controllo della sequenza del promotore del fago T7. Dopo aver controllato la qualità del trascritto ottenuto mediante corsa elettroforetica su gel di agarosio in condizioni denaturanti, si è proceduto all'infezione di piante di N. benthamiana di 6-8 settimane. A tal proposito 2-3 µg di RNA infettivo, diluiti in 50 µl di H2O ultrasterile, sono stati inoculati su ciascuna foglia (2 foglie per pianta). L'ingresso delle molecole di RNA virali nelle cellule vegetali è stato consentito mediante l’utilizzo di una sostanza abrasiva nota come carborundum,

89 che è stata massaggiata delicatamente sulla pagina superiore della foglia insieme alla sospensione di genoma virale.

La sintomatologia delle piante inoculate è stata costantemente monitorata e documentata attraverso l’acquisizione di foto. Si è potuto evidenziare che la comparsa delle caratteristiche lesioni locali clorotiche sulle foglie inoculate si è avuta dopo 2-3 dpi. Dopo 5-7 dpi, invece, le VNPs sono state in grado di diffondersi in sistemico nei palchi fogliari superiori, in quanto sono apparsi i tipici sintomi, quali foglie deformate, arricciate e con discolorazioni marginali. A 11-14 dpi si è avuta la necrosi dei germogli apicali e la morte della pianta dovuta all’abbattimento del fusto (Fig. 18). Inoltre le piante inoculate con molecole di RNA chimeriche infettive hanno mostrato la stessa sintomatologia, in termini di cinetica e severità, rispetto a quelle inoculate con il virus TBSV-wt.

Figura 18. Tipica sintomatologia indotta su piante di N. benthamiana infettate da TBSV. (a) e (b) Piante

di N.benthamiana di 6-8 settimane non infettate; (c) foglia inoculata con il virus TBSV: notare gli spot clorotici indicati dalle frecce; (d) ed (e) tipica sintomatologia presente nei palchi fogliari superiori: notare le foglie deformate ed arricciate (d) e la necrosi dei germogli apicali (e), come indicato dalle frecce. 4.2.1.1.4 Purificazione delle VNPs

Dopo la comparsa della tipica sintomatologia dovuta all'infezione virale, il tessuto infetto è stato campionato a 7-10 dpi, separando le foglie sistemiche da quelle inoculate, ed è stato sottoposto al processo di purificazione, seguendo il protocollo di Burgyan e Russo (1998) al quale sono state apportate alcune modifiche. La concentrazione delle VNPs è stata valutata mediante saggio Bradford, utilizzando per la retta di taratura quantità crescenti (da 1 a 10 µg) di albumina di siero bovino (BSA), ed è stata confermata mediante SDS-PAGE seguita da una colorazione con Blue

90 di Coomassie disciolto in una soluzione di fissaggio. Sono stati ottenuti circa 300 µg di VNPs purificate e monodisperse da 1 g di materiale fogliare fresco. La qualità della purificazione, invece, è stata validata mediante SDS-PAGE, seguito da una colorazione con nitrato d'argento. Di ciascun lotto di purificazione, infatti, sono stati caricati su SDS-PAGE (gel di separazione T=13,5%) circa 1 µg di proteine purificate precedentemente denaturate. Il grado di purezza è stato ottimale, poiché non sono state evidenziate altre proteine vegetali indesiderate (Fig. 19). La scelta della colorazione con nitrato d'argento dipende dal fatto che, a differenza della colorazione con il Blue di Coomassie che permette di rilevare proteine presenti con una quantità di almeno 0,1-0,3 µ g, tale tecnica risulta essere circa 100 volte più sensibile, consentendo di rilevare anche 1 ng di proteina.

Figura 19. SDS-PAGE visualizzato con nitrato d'argento delle VNPs purificate e denaturate. 1 µg di

nanoparticelle purificate di TBSV-wt, TBSV-PT3 e TBSV-GP63 sono state sottoposte a denaturazione. Le proteine risultanti sono state poi risolte su un SDS-PAGE al 13,5% e rilevate mediante colorazione con nitrato d’argento.