Caratterizzazione meccanica delle VNPs

Le VNPs sono state sottoposte successivamente ad analisi di nanoindentazione. L'AFM, infatti, grazie alla capacità di misurare forze al picoNewton, consente di studiare le proprietà nanomeccaniche anche delle VNPs, attraverso l'indentazione.

L’indentazione è forse il più comune mezzo per testare le proprietà meccaniche dei materiali. La tecnica ha la sua origine nella scala di Mohs per la durezza, dove i materiali vengono classificati in base a ciò che possono graffiare e, a loro volta, in base a ciò da cui possono essere graffiati. Nei virus, per effettuare analisi di nanoindentazione, è necessario acquisire una buona immagine della singola nanoparticella e successivamente esercitare una forza al centro di essa con una punta acuminata. Il corrispondente valore della deflessione della microleva viene registrato ed in seguito interpretato (Ivanovska et al., 2004; Roos, 2011).

A seconda del virus analizzato, sono stati osservati regimi di deformazione molto diversi tra loro indicanti distinte proprietà meccaniche dei sistemi virali studiati (Snijder et al., 2012). In ogni caso i due parametri indagati per rilevare le proprietà meccaniche dei capsidi virali sono la durezza e la forza di rottura. La durezza è ottenuta dal regime elastico della deformazione e permette di determinare il modulo di Young del virus sulla base della teoria dell’elasticità (Ivanovska et al., 2004). La formulazione della legge dell’elasticità si deve a Hooke. Nel caso semplice di un corpo soggetto a trazione essa afferma che l’allungamento è proporzionale alla forza. Se si introducono però anche i concetti di sforzo e di deformazione, la legge di Hooke riformulata, nei limiti del comportamento elastico, afferma che la deformazione è direttamente proporzionale allo sforzo, ove per deformazione si intende la variazione di lunghezza sulla lunghezza iniziale e per sforzo la forza che si esercita su un campione di lunghezza unitaria.

82 Pertanto il modulo di Young, chiamato anche modulo di elasticità, dipendente dal campione esaminato, è dato dal rapporto tra lo sforzo e la deformazione. La forza di rottura, invece, corrisponde alla fine del limite elastico ed è ascrivibile alla forza necessaria per distruggere il capside virale (Ivanovska et al., 2011). E’ bene considerare che quando si esercitano piccole indentazioni sul campione, la deformazione risultante è minima e quindi il capside mantiene un comportamento elastico. Quando invece le indentazioni esercitate sono più grandi, il danneggiamento del capside può permanere anche dopo la sollecitazione: si avrà così un comportamento anelastico o plastico. Al di fuori del limite elastico, le curve di indentazione risultanti, comunemente associate alla perdita delle subunità strutturali o a deformazioni non lineari, possono contenere molte informazioni utili per le proprietà del campione (Castellanos et

al., 2012; Ivanovska et al., 2011). L’esistenza di un regime plastico nei virus, interpretato come

una deformazione permanente e non come una frattura, ad esempio, è molto importante da analizzare anche se finora è stato scarsamente studiato (Rapaport, 2008).

In questo progetto sono state compiute analisi di nanoindentazione su 11 UVNPs e 16 SVNPs, applicando sollecitazioni continue alla stessa nanoparticella. Ogni singola indentazione è stata analizzata e le curve risultanti (Force vs Indentation Curves, FICs) sono state interpretate per valutare la resistenza e la fatica dei campioni esaminati. La Fig. 14 mostra l’evoluzione topografica e meccanica di una UVNP (A, B, C) e di una SVNP (D, E, F). Le FIC consecutive ottenute da una singola UVNP dimostrano che tale nanoparticella presenta 3 differenti risposte meccaniche: elastica (friabile), una transizione elastica-plastica (duttile) ed infine un regime non lineare (solido). La prima FIC (curva 1, nera), corrispondente ad un regime puramente elastico, presenta un comportamento lineare fino ad una forza di 4,8 nN, tuttavia questo valore tende ad abbassarsi nelle successive FIC. Durante la transizione elastica-plastica (curve 2-6, grigio scuro), il limite elastico è raggiunto a valori più bassi (circa 2 nN) ed è seguito da leggere variazioni della forza. Infine, le ultime FIC (curve 9-10, grigio chiaro) non presentano un regime elastico e quindi la nanoparticella si comporta come un oggetto solido. Inoltre, le immagini della stessa UVNP acquisite dopo ogni evento di indentazione, evidenziano una graduale diminuzione dell’altezza (Fig. 14B). Ciononostante, non si riscontra una frattura del capside fino alla settima curva.

83 Figura 14. Esperimenti basati su ripetute indentazioni esercitate su una singola nanoparticella. A)

Sollecitazioni cicliche esercitate su una singola UVNP. B), C) Evoluzione topografica dell’UVNP per ogni evento di nanoindentazione, ad esempio il profilo indicato con il numero 1 indica la topografia acquisita dopo il primo FIC. D), E), F) Lo stesso esperimento condotto su una SVNP. Nella sezione D è illustrata la caratteristica risposta meccanica di un materiale malleabile, caratterizzata da un’iniziale risposta elastica (linea rossa) seguita da una deformazione plastica (linea blu).

Lo stesso esperimento condotto sulle SVNPs, invece, evidenzia un comportamento differente tra le UVNPs e le SVNPs (Fig. 14D): le SVNPs non presentano una tendenza elastica. Per le SVNPs, infatti, la prima FIC (curva 1, grigio scuro) mostra già una transizione elastica-plastica, la forza dopo il limite elastico mantiene un valore costante di circa 1 nN. Le immagini della stessa SVNP acquisite dopo ogni evento di indentazione evidenziano un decremento irreversibile delle altezze, senza però danneggiamento del capside (curve 1-5, Figg. 14E e 14F).

Inoltre le Figg. 15A e 15B mostrano le prime 3 FIC ottenute da 11 UVNPs e 16 SVNPs, rispettivamente. Il confronto del limite elastico riscontrato per le varie indentazioni (Fig. 15C) evidenzia che le UVNPs e le SVNPs presentano un comportamento distinto all’inizio, ma simile nelle successive deformazioni. Infatti dopo la prima FIC, la risposta meccanica della UVNP presenta valori simili a quelli ottenuti per la SVNP. Per esempio, considerando i valori delle prime 2 FIC e valutando la costante elastica ed il limite elastico, si avranno valori per le UVNPs da (0,72±0,09) N/m a (0,51±0,07) N/m e da (3,2±0,25) nN a (1,75±0,2) nN, rispettivamente, e per le SVNPs da (0,55±0,07) N/m a (0,36±0,03) N/m e da (1,9±0,15) nN a (1,7±0,1) nN, rispettivamente.

84 Figura 15. Confronto tra le proprietà meccaniche di UVNPs e SVNPs. A) Il grafico mostra la

sovrapposizione dei primi tre FIC effettuati su 11 differenti UVNPs: prima curva (nera), seconda curva (grigio scuro) e terza curva (grigio chiaro). B) Il grafico mostra la sovrapposizione dei primi tre FIC effettuati su 15 differenti SVNPs: prima curva (nera), seconda curva (grigio scuro) e terza curva (grigio chiaro). C) Evoluzione del limite elastico. D) Evoluzione della costante elastica ottenuta considerando la parte lineare che precede la transizione plastica. E) Evoluzione dell’altezza. E’ stata indicata l’altezza media delle particelle prima che siano state sottoposte al FIC corrispondente.