Analisi dei metaboliti e degli enzimi del ciclo di Halliwell-Asada

Come detto, lo stress ossidativo è la conseguenza di uno squilibrio tra la produzione e la degradazione delle ROS (Conklin e Barth, 2004; Baier et al., 2005), che (in particolare l’H2O2) sono normalmente generate nel corso di processi metabolici che coinvolgono il trasporto di elettroni, come la fotosintesi e la respirazione. In risposta a condizioni di stress ambientali, tuttavia, si verifica una maggiore produzione che può reagire con vari bersagli cellulari provocandone l’ossidazione.

L’O3, nella fase acquosa della matrice apoplastica, reagisce immediatamente generando le ROS, quali O2•-, H2O2 e radicale idrossilico (OH•-), il cui bersaglio primario è rappresentato dai lipidi e dalle proteine di membrana con conseguente (i) perdita della permeabilità selettiva, (ii) alterazione dell’integrità cellulare e (iii) possibile produzione di molecole segnale. L’alterazione dello stato redox cellulare e il danno che ne consegue attivano meccanismi costitutivi di protezione, tra i quali il ciclo di Halliwell-Asada. La sorte della cellula vegetale dipende, perciò, dal

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mantenimento o meno di un equilibrio tra generazione e detossificazione dei radicali liberi mediante l’azione anche di questo sistema antiossidante.

Tra le ROS prodotte in seguito all’esposizione, è stato analizzato il contenuto di O2•- e H2O2 (Tab. 8 e 9, rispettivamente). Nel primo caso non sono state osservate differenze statisticamente significative tra le tesi. Analizzando il contenuto di H2O2 dopo 14 giorni di fumigazione, soltanto il fattore O3 risultava significativo.

Tab. 8 - Contenuto fogliare di anione superossido (μmol g-1 peso secco) in talli di Parmotrema

perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi).

Wet Dry

-O3 0,33±0,054 0,32± 0,042 +O3 0,46±0,097 0,42±0,043

Tab. 9 - Analisi a due fattori (ozono ed idratazione) della varianza (ANOVA) sul contenuto in acqua

ossigenata in talli di Parmotrema perlatum sottoposti o meno ad idratazione, esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). F-ratio indica il valore di F per ogni sorgente di variazione. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** = P ≤ 0,001; ns = non significativo (P>0,05).

F-ratio P

Ozono 17,65 ***

Idratazione 1,42 ns

Ozono x idratazione 0,37 ns

Nei talli sottoposti e non ad idratazione è evidente un significativo accumulo, conseguente alla fumigazione, del contenuto in H2O2 (+39% e +31%, wet e dry rispettivamente, in confronto al materiale di controllo mantenuto in aria filtrata) (Tab. 10). Analogamente a quanto osservato nel nostro studio, Pisani et al. (2011) riportano che i livelli di questa molecola aumentano significativamente in talli di X. parietina trattati con dosi crescenti di arsenico (0,1, 1 e 100 ppm). In particolare, il trattamento con la dose più alta determina un incremento di 1,8 volte nel contenuto in H2O2 rispetto ai controlli.

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Tab. 10 - Contenuto fogliare di acqua ossigenata (μmol g-1 peso secco) in talli di Parmotrema

perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). L’analisi statistica è stata applicata alle medie separatamente per ogni riga e colonna. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** = P ≤ 0,001; ** = P ≤ 0,01; ns = non significativo (P>0,05).

Wet Dry P

-O3 0,33±0,054 0,32±0,042 ns +O3 0,46±0,097 0,42±0,043 ns

P ** ***

Risulta di fondamentale importanza, per il destino dell’organismo, l’attivazione o meno di enzimi e metaboliti antiossidanti in grado di detossificare le molecole su riportate. Per questo, è stata esaminata l’attività della SOD, che converte O2•- in H2O2. Osservando i risultati dell’analisi bifattoriale della varianza è stato notato che, dopo 14 giorni di esposizione, solo i fattori analizzati singolarmente mostrano significatività (Tab. 11).

Tab. 11 - Analisi a due fattori (ozono ed idratazione) della varianza (ANOVA) sull’attività della

superossido dismutasi in talli di Parmotrema perlatum sottoposti o meno ad idratazione ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). F-ratio indica il valore di F per ogni sorgente di variazione. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** = P ≤ 0,001; * = P ≤ 0,05; ns = non significativo (P>0,05).

F-ratio P

Ozono 15,11 *

Idratazione 27,47 ***

Ozono x idratazione 0,11 ns

Nei talli sottoposti ad idratazione si verifica un incremento dell’attività della SOD, conseguente alla fumigazione con O3 (+21% rispetto al materiale mantenuto in aria filtrata). La mancanza di idratazione comporta, invece, una diminuzione sia nei trattati che nei controlli (-36% e -42%, rispettivamente) (Tab. 12).

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Tab. 12 – Attività della superossido dismutasi (unità mg-1 proteine) in talli di Parmotrema perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5h d-1 per 14 giorni consecutivi). L’analisi statistica è stata applicata alle medie separatamente per ogni riga e colonna. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: * = P ≤ 0,05; ns = non significativo (P>0,05).

Wet Dry P

-O3 1815±424,9 1045±44,8 * +O3 2203±467,6 1416±252,2 *

P * ns

In uno studio condotto su Ramalina farinacea, Deltoro et al. (1999) riportano un significativo incremento dell’attività della SOD nei lobi sottoposti a trattamento con SO2 (1,7 ppm, 5 h d-1 per 2 giorni consecutivi). Egger et al. (1994) osservano una marcata produzione di SOD in talli di Hypogimnia physodes trapiantati in aree altamente inquinate (con concentrazioni mensili di O3 comprese in un range di 20- 198 μg m-3

). Analoghe risposte sono state osservate in aria ambiente da Silberstein et al. (1996) e Weissman et al. (2006) rispettivamente in X. parietina e R. lacera. Monnet et al. (2006), studiando la tossicità del rame sull’attività di alcuni enzimi antiossidanti in Dermatocarpon luridum (lichene acquatico), affermano che l’impiego di concentrazioni crescenti di questo metallo pesante (0,25, 0,50, 0,75 e 1,00 mM) determina un significativo incremento della SOD, analogamente a quanto riportato per altri tipi di stress. Al contrario, Weissman et al. (2005) rilevano significative riduzioni dell’attività di varie isoforme di SOD sia algali che fungine (in particolare Mn-SOD, Fe-SOD e Cu/Zn-SOD) in talli di R. lacera sottoposti a cicli di idratazione/disidratazione. Anche Gasulla et al. (2009) rilevano una diminuzione dell’attività di questo enzima in individui di Trebouxia erici disseccati per 24 h (20 °C, 67% UR), a dimostrazione del fatto che lo stato idrico del tallo assume un ruolo fondamentale nella performance fotosintetica e metabolica del lichene stesso, come riscontrato anche nel nostro studio (sia nei controlli che nei trattati).

L’APX è uno dei principali enzimi coinvolti nella detossificazione di H2O2. Dopo 14 giorni di esposizione, il fattore O3 e la sua interazione con l’idratazione sono significativi (Tab. 13).

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Tab. 13 - Analisi a due fattori (ozono ed idratazione) della varianza (ANOVA) sull’attività

dell’ascorbato perossidasi in talli di Parmotrema perlatum sottoposti o meno ad idratazione ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). F-ratio indica il valore di F per ogni sorgente di variazione. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** = P ≤ 0,001; * = P ≤ 0,05; ns = non significativo (P>0,05).

F-ratio P

Ozono 30,90 *

Idratazione 7,92 ns

Ozono x idratazione 19,91 ***

Nei talli non sottoposti ad idratazione ed esposti ad O3 l’attività dell’APX aumenta in maniera statisticamente significativa (+74% rispetto al materiale mantenuto in aria filtrata). Questa incrementa anche nel materiale trattato dry rispetto al wet (+40%), mentre diminuisce in quello di controllo per le stesse tesi (-30%) (Tab. 14). Simili risultati sono stati riportati da Deltoro et al. (1999) su R. farinacea, in cui l’SO2 determinava un significativo incremento dell’attività dell’APX. Anche dall’analisi di altri tipi di agenti di stress, Monnet et al. (2006) notano che l’impiego di concentrazioni crescenti di rame (0,25-1,00 mM) provoca un significativo incremento dell’attività di questo enzima in talli di D. luridum, prevenendo il danno ossidativo.

Tab. 14 - Attività dell’ascorbato perossidasi (μunità mg-1 proteine) in talli di Parmotrema perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). Lettere diverse corrispondono a valori significativamente diversi (P ≤ 0,05).

Wet Dry

-O3 99,7±10,55 bc 70,1±10,70 a +O3 87,4±4,72 ab 122,0±20,8 c

Nei tessuti vegetali l’acido ascorbico svolge un importante ruolo nella protezione dal danno ossidativo indotto dall’O3, sia come un diretto scavenger chimico di questo e delle ROS derivate sia come substrato di enzimi antiossidanti (Burkey et al., 2006). La valutazione dei livelli fogliari di acido ascorbico ha compreso la misura della forma sia ridotta (AsA) che ossidata (DHA), allo scopo di evidenziare lo stato redox di questo composto, da sempre considerato uno dei principali sistemi antiossidanti di natura non enzimatica in grado di mantenere lo stato di equilibrio tra la formazione e la rimozione di ROS. L’ANOVA bifattoriale

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non ha mostrato differenze significative. Le Tabella 15 e 16 mostrano i valori per la forma ridotta e ossidata, per il totale e per lo stato redox nelle condizioni wet e dry, rispettivamente.

Tab. 15 - Contenuto fogliare in acido ascorbico (mmol g-1 peso secco) nella forma ridotta (AsA) e ossidata (DHA), totale (AsA+DHA) e stato redox (AsA/AsA+DHA) in talli di Parmotrema perlatum sottoposti ad idratazione (wet) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi).

AsA DHA AsA+DHA AsA/AsA+DHA

-O3 2,2±0,15 11,4±0,71 13,4±0,85 0,16±0,005 +O3 2,1±0,34 10,5±0,80 12,4±1,12 0,17±0,012

Tab. 16 - Contenuto fogliare in acido ascorbico (mmol g-1 peso secco) nella forma ridotta (AsA) e ossidata (DHA), totale (AsA+DHA) e stato redox (AsA/AsA+DHA) in talli di Parmotrema perlatum non sottoposti ad idratazione (dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi).

AsA DHA AsA+DHA AsA/AsA+DHA

-O3 2,1±0,19 10,8±0,97 12,8±1,13 0,17±0,003 +O3 2,1±0,11 10,4±0,57 12,3±0,67 0,17±0,001

La Tabella 17 mostra l’ANOVA a due vie applicata all’attività della DHAR: tutti i fattori presi in considerazione e la loro interazione risultano significativi.

Tab. 17 - Analisi a due fattori (ozono ed idratazione) della varianza (ANOVA) sull’attività della

deidroascorbato reduttasi in talli di Parmotrema perlatum sottoposti o meno ad idratazione ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). F-ratio indica il valore di F per ogni sorgente di variazione. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** = P ≤ 0,001.

F-ratio P

Ozono 32,69 ***

Idratazione 21,41 ***

Ozono x idratazione 32,50 ***

Nei talli sottoposti ad idratazione e fumigati, l’attività della DHAR aumenta in maniera statisticamente significativa (+60% rispetto al materiale mantenuto in aria filtrata) (Tab. 18).

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Tab. 18 - Attività delle deidroascorbato perossidasi (μunità mg-1 proteine) in talli di Parmotrema

perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). Lettere diverse corrispondono a valori significativamente diversi (P ≤ 0,05).

Wet Dry

-O3 86,8±5,53 a 73,7±11,43 a +O3 138,8±11,07 b 69,8±6,48 a

Ancora nell’ambito del ciclo di Halliwell-Asada, tra i vari processi di cui gli organismi vegetali dispongono per la rigenerazione della forma ridotta dell’acido ascorbico vi è l’ossidazione del glutatione. Questo composto tiolico, localizzato principalmente nel cloroplasto, occupa una posizione centrale all’interno dei sistemi di difesa, partecipando anche direttamente al processo di detossificazione delle ROS.

L’ANOVA bifattoriale sul contenuto di glutatione nella sua forma ossidata (GSSG) mostra differenze statisticamente significative per i fattori analizzati singolarmente e per la loro interazione (Tab. 19).

Tab. 19 - Analisi a due fattori (ozono ed idratazione) della varianza (ANOVA) sul contenuto di

glutatione nella sua forma ossidata in talli di Parmotrema perlatum sottoposti o meno ad idratazione ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). F-ratio indica il valore di F per ogni sorgente di variazione. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** =

P ≤ 0,001; * = P ≤ 0,05.

F-ratio P

Ozono 11,24 *

Idratazione 30,26 ***

Ozono x idratazione 30,79 ***

I valori di GSSG nei talli sottoposti ad idratazione aumentavano dopo l’ozonizzazione (+14% rispetto ai controlli). La disidratazione, invece, determina una riduzione nel contenuto del metabolita nel materiale sia trattato che mantenuto in aria filtrata (-19% e 29%, rispettivamente) (Tab. 20).

Tab. 20 - Contenuto fogliare di glutatione nella forma ossidata (nmol mg-1 peso secco) in talli di

Parmotrema perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb,

5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). Lettere diverse corrispondono a valori significativamente diversi (P

≤ 0,05).

Wet Dry

-O3 2,1±0,03 b 1,7±0,06 a +O3 2,4±0,08 c 1,7±0,14 a

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La valutazione dei livelli fogliari di glutatione ha compreso anche la misura della forma ridotta (GSH) e del contenuto totale (GSH+GSSG), che non ha dato però risultati statisticamente significativi (Tab. 21 e 22).

Tab. 21 - Contenuto fogliare in glutatione (nmol mg-1 peso secco) nella forma ridotta (GSH) e in quella totale in talli di Parmotrema perlatum sottoposti ad idratazione (wet) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi).

GSH GSH+GSSG

-O3 0,5±0,14 2,8±0,34 +O3 0,4±0,13 2,7±0,05

Tab. 22 - Contenuto fogliare in glutatione (nmol mg-1 peso secco) nella forma ridotta (GSH) e in quella totale in talli di Parmotrema perlatum non sottoposti ad idratazione (dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi).

GSH GSH+GSSG

-O3 0,4±0,07 2,1±0,03 +O3 0,3±0,13 2,0±0,25

E’ ormai noto in letteratura l’importante ruolo del glutatione (nella sua forma ossidata e ridotta) nelle piante peciloidriche in presenza di stress idrico (Kranner e Grill, 1996). Per questo motivo, particolare attenzione è stata rivolta alla stima del contenuto di questo composto tiolico al fine di definirne un possibile ruolo nell’induzione di resistenza all’O3 e alla disidratazione (presi in esame singolarmente o in combinazione).

I nostri risultati sono simili a quelli riportati da Kranner (2002) in tre specie licheniche (Pseudovernia furfuracea, Peltigera polydactyla e Lobaria pulmonaria), in cui un breve ciclo di disidratazione/idratazione (della durata di due giorni) non induceva significative variazioni nel contenuto totale di glutatione. La progressiva ossidazione del GSH in GSSG durante il trattamento con O3 nei lobi sottoposti ad idratazione può costituire uno dei possibili meccanismi di protezione attivati da P. perlatum in risposta alla formazione di ROS (in particolare di H2O2), proteggendo le proteine dal danno ossidativo (Kranner e Grill, 1996, 1997).

La GR è una flavoproteina, che catalizza la riduzione del GSSG a GSH tramite il NADPH e che, insieme all’APX, partecipa al processo di eliminazione dell’H2O2 e alla successiva rigenerazione delle forme ridotte dell’acido ascorbico e del glutatione nel ciclo di Halliwell-Asada. Dopo 14 giorni di fumigazione, il fattore

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idratazione e l’interazione tra questo e il fattore O3 mostra differenze statisticamente significative (Tab. 23).

Tab. 23 - Analisi a due fattori (ozono ed idratazione) della varianza (ANOVA) sull’attività della

glutatione reduttasi in talli di Parmotrema perlatum sottoposti o meno ad idratazione ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). F-ratio indica il valore di F per ogni sorgente di variazione. Gli asterischi indicano differenze statisticamente significative per: *** = P ≤ 0,001; * = P ≤ 0,05; ns = non significativo (P > 0,05).

F-ratio P

Ozono 3,11 ns

Idratazione 30,01 ***

Ozono x idratazione 10,04 *

Differenze significative si verificano nei campioni ozonati, con una diminuzione dovuta alla disidratazione del 28% (Tab. 24).

Tab. 24 - Attività della glutatione reduttasi (μmol NADPH mg-1 proteine) in talli di Parmotrema

perlatum sottoposti e non ad idratazione (wet e dry) ed esposti e non ad ozono (250 ppb, 5 h d-1 per 14 giorni consecutivi). Lettere diverse corrispondono a valori significativamente diversi (P ≤ 0,05).

Wet Dry

-O3 105±6,9 bc 92±9,6 ab +O3 117±8,6 c 84±11,8 a

Simili risultati sono stati riportati da Deltoro et al. (1999) su talli di Evernia prunastri, in cui il trattamento acuto con SO2 (1,7 ppm, 5 h d-1 per 2 giorni consecutivi) non determinava alcun effetto significativo sull’attività della GR. Nel nostro studio, è possibile ipotizzare che il progressivo disseccamento dei talli (sia nei controlli che nei trattati) agisca direttamente sulla GR localizzata nel citoplasma e nei cloroplasti delle cellule, inducendo così una significativa riduzione della sua attività.

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