Su tutti i campioni (cagliate, formaggi a 2 mesi di stagionatura, formaggi a fine stagionatura), prelevati nell'ambito della caseificazione sperimentale descritta nel paragrafo 6.2, sono stati effettuati la conta e l'isolamento dei microorganismi potenziali produttori di ammine biogene: enterococchi, lattobacilli mesofili,
Enterobacteriaceae.
6.5.1 Conte batteriche, isolamento
Per ogni campione, 10 g di formaggio o di cagliata prelevati asetticamente sono stati addizionati a 90 ml di diluente (soluzione di citrato di sodio 2% p/v) e omogeneizzati in uno Stomacher 400 Circulator (PBI International, Milano, Italia); successivamente sono state preparate le diluizioni seriali usate per gli inoculi nei terreni selettivi.
Per la conta e l'isolamento di Enterococcus spp. è stato utilizzato il terreno Kanamycin Aesculin Azide Agar (inoculo per spatolamento, 0,2 ml), lasciato a incubare a 42 °C per 48 h; per le Enterobacteriaceae è stato usato il terreno Violet Red Bile Glucose Agar (inoculo per spatolamento, 0,2 ml), incubato a 37 °C per 24 h; per i lattobacilli mesofili è stato usato l'MRS agar (inoculo per inclusione, 1 ml) incubato in condizioni di anaerobiosi a 37 °C per 72 h.
Tutti i terreni colturali e i supplementi sono stati acquistati da Oxoid Ltd., Basingstoke, UK.
6.5.2 Identificazione di specie
L'identificazione a livello di specie è stata eseguita sui ceppi batterici isolati e scelti per essere successivamente testati per la valutazione della capacità di produrre AB; per le Enterobacteriaceae è stato utilizzato il kit API 20 E (Biomerieux, Marcy-l'Etoile, Francia) e il relativo software Apiweb standalone
6 Fase 2 - Materiali e metodi
v.1.1.0 (2004). Per gli enterococchi e i lattobacilli mesofili l'identificazione è stata effettuata con analisi genotipica mediante PCR specie-specifiche, come in seguito descritto.
Estrazione del DNA
Per l'estrazione del DNA è stato utilizzato il kit “GenElute Bacterial Genomic DNA Kit” (Sigma-Aldrich Inc., Saint Louis, MO, USA) seguendo il protocollo suggerito dal produttore. Nello specifico, per ogni ceppo, 1,5 ml di una coltura
overnight sono stati centrifugati a 14.000 g ed il surnatante è stato eliminato; il
pellet è stato quindi risospeso in 200 µl di “Lysozyme Solution” (45 mg/ml di lisozima in “Gram-Positive Lysis Solution”), vortexato e incubato a 37 °C per 30 minuti. Dopo l'addizione di 20 µl di soluzione di proteinasi K (20 mg/ml) e di 200 µl di “Lysis Solution C”, il campione è stato vortexato e incubato a 55 °C per 10 minuti. In una colonna di estrazione del DNA, che era stata precedentemente preparata aggiungendovi 500 µl di “Column Preparation Solution”, centrifugandola a 12.000 g per 1 minuto e scartando l'eluato, è stato trasferito il lisato dopo averlo addizionato di 200 µl di etanolo e vortexato. La colonna è stata quindi nuovamente centrifugata a 6.500 g per 1 minuto e l'eluato scartato. Sono stati quindi effettuati due lavaggi della colonna: uno con 500 µl di “Wash Solution 1” e con centrifugazione a 6.500 g per 1 minuto, e uno con 500 µl di “Wash Solution” e centrifugazione a velocità massima per 3 minuti; in entrambi i casi l'eluato è stato scartato. Da ultimo l'eluizione del DNA genomico puro è stata effettuata con addizione di 200 µl di “Elution Solution”, seguita da 5 minuti di incubazione a temperatura ambiente per aumentare l'efficienza dell'estrazione, e quindi centrifugazione a 6.500 g per 2 minuti. L'eluato è stato quindi conservato a -20 °C fino al momento dell'amplificazione con PCR.
PCR specie-specifica
Per l'amplificazione è stato utilizzato un termociclatore LifePro (Bioer, Cina), usando per ogni campione: 6,5 µl di acqua, 12,5 µl di Taq EconoTaq® PLUS 2X Master Mix (Lucigen, Middleton, USA), 1,5 µl di primer forward e 1,5 µl di
6 Fase 2 - Materiali e metodi
primer reverse, e 3 µl di DNA.
Tutti gli amplificati sono stati analizzati con corsa elettroforetica su gel di agarosio (1,5% in TAE) e successivamente osservati al transilluminatore per verificare la presenza delle corrette bande specie-specifiche identificate sulla base della grandezza in paia di basi grazie al confronto con il marker di riferimento (GelPilot 100 bp Plus Ladder (100), Qiagen, Hilden, Germania). Per ciascuna specie batterica i primer, i cicli di amplificazione utilizzati e i prodotti attesi vengono specificati qui di seguito.
• Enterococcus faecalis, secondo il protocollo di Dutka-Malen et al. (1995):
Primer forward EF-E1: 5'-ATCAAGTACAGTTAGTCTT-3' Primer reverse EF-E2: 5'-ACGATTCAAAGCTAACTG-3' Ciclo amplificazione: – 94 °C, 2 minuti – 94 °C, 30 secondi – 55 °C, 30 secondi 30 cicli – 72 °C, 30 secondi – 72 °C, 10 minuti Prodotto atteso: 941 bp
• Enterococcus faecium, secondo il protocollo di Dutka-Malen et al. (1995):
Primer forward FM-F1: 5'-GCAAGGCTTCTTAGAGA-3' Primer reverse FM-F2: 5'-CATCGTGTAAGCTAACTTC-3' Ciclo amplificazione: – 94 °C, 2 minuti – 94 °C, 1 minuto – 54 °C, 30 secondi 30 cicli – 72 °C, 60 secondi – 72 °C, 10 minuti Prodotto atteso: 550 bp
6 Fase 2 - Materiali e metodi
• Lactobacillus curvatus, secondo il protocollo di Berthier e Ehrlich (1998):
Primer forward LCLPE: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' Primer reverse LC: 5'-TTGGTACTATTTAATTCTTAG-3' Ciclo amplificazione: – 94 °C, 5 minuti – 94 °C, 1 minuto – 53 °C, 30 secondi 20 cicli – 72 °C, 1 minuto – 72 °C, 10 minuti Prodotto atteso: 230-240 bp
• Lactobacillus fermentum, secondo il protocollo di Dickson et al. (2005):
Primer forward LF1: 5'-AATACCGCATTACAACTTTG-3' Primer reverse LF2: 5'-GGTTAAATACCGTCAACGTA-3' Ciclo amplificazione: – 94 °C, 5 minuti – 94 °C, 1 minuto – 50 °C, 1 minuto 35 cicli – 72 °C, 1 minuto – 72 °C, 10 minuti Prodotto atteso: 337 bp
• Lactobacillus paracasei, secondo il protocollo di Desai et al. (2006):
Primer Y2: 5'-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' Primer W2: 5'-CACCGAGATTCAACATGG-3' Ciclo amplificazione: – 94 °C, 3 minuti – 94 °C, 45 secondi – 50 °C, 45 secondi 30 cicli – 72 °C, 1 minuto
6 Fase 2 - Materiali e metodi
– 72 °C, 5 minuti Prodotto atteso: 295 bp
• Lactobacillus plantarum, secondo il protocollo di Berthier e Ehrlich
(1998):
Primer forward: 5'-GCTGGATCACCTCCTTTC-3' Primer reverse: 5'-ATGAGGTATTCAACTTATG-3' Ciclo amplificazione: – 95 °C, 5 minuti – 94 °C, 1 minuto – 53 °C, 30 secondi 30 cicli – 72 °C, 1 minuto – 72 °C, 10 minuti Prodotto atteso: 230-240 bp
• Lactobacillus rhamnosus, secondo il protocollo di Desai et al. (2006):
Primer Y2: 5'-CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3' Primer W3: 5'-TGCATCTTGATTTAATTTTG-3' Ciclo amplificazione: – 94 °C, 3 minuti – 94 °C, 45 secondi – 50 °C, 45 secondi 30 cicli – 72 °C, 1 minuto – 72 °C, 5 minuti Prodotto atteso: 295 bp
6.5.3 Screening dell'attività decarbossilasica
Per alcuni dei ceppi isolati è stata valutata la capacità di produrre ammine biogene a partire dagli amminoacidi precursori sia con un metodo qualitativo, che prevede l'utilizzo di terreni colturali differenziali, sia con un metodo quantitativo effettuando l'analisi HPLC dei brodi colturali per quantificare le ammine biogene
6 Fase 2 - Materiali e metodi
eventualmente prodotte.
In totale sono stati testati con entrambi i metodi 72 ceppi: 10 Enterobacteriaceae, 34 Enterococcus spp. e 28 lattobacilli mesofili. Il prospetto del numero di ceppi testati con le due metodologie e dei campioni da cui provenivano è dettagliato nella tabella VIII; nel decidere la selezione dei ceppi si è cercato di riflettere la presenza relativa delle diverse categorie microbiche nei diversi tipi di campione.
Tab. VIII. Microorganismi isolati testati per l'attività decarbossilasica Tipo di latte Tipo di ceppo N° ceppi testati
Cagliata stagionatura in2 mesi di stabilimento Fine stagionatura (4 mesi) Stabilimento Grotta P as to ri zz at o Eb 0 2 0 1 Ec 0 3 5 5 Lb 1 3 3 3 C ru do Eb 2 4 0 1 Ec 4 7 4 6 Lb 4 7 3 4
Eb: Enterobacteriaceae; Ec: Enterococcus spp.; Lb: lattobacilli mesofili
6.5.4 Screening dell'attività decarbossilasica – metodo
qualitativo
Per rilevare la loro eventuale attività decarbossilasica i ceppi batterici isolati di
Enterococcus spp. e di Enterobacteriaceae sono stati inoculati in Tryptone Soy
Broth (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) ed incubati a 37 °C per 24 h. Successivamente ciascun ceppo è stato inoculato all'1% v/v in 8 tubi di Moeller Decarboxylase Broth (Moeller, 1954): uno senza alcuna aggiunta e ciascuno dei 7 restanti addizionato all'1% p/v con un diverso amminoacido. In tutti 8 i tubi è stato misurato il pH mediante un pHmetro GLP 21 (Crison Instruments S.A.,
6 Fase 2 - Materiali e metodi
Barcellona, Spagna), portandolo ad un valore finale di 5,3.
Per i lattobacilli mesofili i ceppi batterici isolati sono stati inoculati in MRS Broth (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) ed incubati a 37 °C per 24 h. Successivamente ciascun ceppo è stato inoculato all'1% v/v in 8 tubi del terreno differenziale descritto da Bover-Cid e Holzapfel (1999), ma in forma non agarizzata: uno senza alcuna aggiunta e ciascuno dei 7 restanti addizionato all'1% p/v con un diverso amminoacido; tutti 8 sono stati portati ad un pH finale di 5,3. In tutti i casi (Enterobacteriaceae, Enterococcus spp., lattobacilli mesofili) i 7 amminoacidi utilizzati erano: L-arginina cloridrato, L-fenilalanina, L-istidina cloridrato-monoidrato, L-lisina cloridrato, L-ornitina cloridrato, sale disodico di L-tirosina monoidrato, L-triptofano; i tubi sono stati incubati a 37 °C per 72 h e la reazione è stata considerata positiva in caso di viraggio del terreno al viola, in assenza di viraggio nel tubo corrispondente senza amminoacidi aggiunti.
6.5.5 Screening dell'attività decarbossilasica – metodo
quantitativo mediante analisi HPLC
I 72 ceppi testati con il metodo qualitativo sono stati testati anche con l'analisi HPLC per quantificare l'eventuale capacità di produrre ammine biogene a partire dagli amminoacidi corrispondenti.
In tutti i casi l'inoculo in terreno differenziale è avvenuto come descritto per il metodo qualitativo nel paragrafo precedente, ma preparando per ciascun microorganismo un solo tubo contenente un'aggiunta all'1% p/v di tutti i 7 amminoacidi utilizzati.
Dopo incubazione a 37 °C per 72 h, le colture sono state centrifugate a 3000 g per 5 minuti e il surnatante è stato filtrato con filtri da 0,45 µm. In seguito, a 2 ml del filtrato sono stati addizionati 8 ml di HCl 0,1 M e 20 µl di SI (10 mg/ml). La derivatizzazione, la preparazione all'iniezione nell'apparato cromatografico e l'analisi cromatografica sono state eseguite con le stesse modalità descritte per le soluzioni standard di ammine (paragrafi 4.2.2 e 4.2.3) e utilizzando il gradiente di
6 Fase 2 - Materiali e metodi
eluizione individuato nella Fase 1.
6.6 Analisi statistiche
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate con il software R (R Core Team, 2013), versione 3.0.2. I test sono stati considerati significativi se associati ad un valore di probabilità p < 0,05.
La significatività delle differenze nel contenuto di singole ammine e di AB totali tra i formaggi prodotti con latte pastorizzato e quelli prodotti con latte crudo analizzati a 2 mesi stagionatura è stata testata utilizzando il test t; per i campioni analizzati a fine maturazione è stato fatto un test ANOVA a due vie con interazione, usando il tipo di latte (pastorizzato o crudo) e il tipo di stagionatura (totalmente in stabilimento o parzialmente in grotta) come fattori, seguito dal test di Tukey HSD per i confronti post-hoc.
Per investigare la significatività delle differenze in ciascuno degli attributi valutati nell'analisi sensoriale descrittiva è stata usata un'analisi ANOVA a due vie con interazione utilizzando il tipo di latte (pastorizzato o crudo) e il tipo di stagionatura (totalmente in stabilimento o parzialmente in grotta) come fattori, seguita dal test di Tukey HSD per i confronti post-hoc.
Per valutare il valore di probabilità associato ai risultati dei test sensoriali triangolari è stata usata la funzione di ripartizione della distribuzione binomiale con p=1/3.
Per i campioni di cagliata e di formaggio a 2 mesi di stagionatura relativi alla caseificazione sperimentale, la significatività delle differenze delle diverse cariche batteriche tra i campioni prodotti con latte pastorizzato e quelli a latte crudo è stata analizzata con il test t; per i campioni a fine maturazione è stato invece usato un test ANOVA a due vie con interazione, usando il tipo di latte (pastorizzato o crudo) e il tipo di stagionatura (totalmente in stabilimento o parzialmente in grotta) come fattori, seguito dal test di Tukey HSD per i confronti
6 Fase 2 - Materiali e metodi post-hoc.