Tutte le analisi statistiche sono state effettuate con il software R (R Core Team, 2013), versione 3.0.2. I test sono stati considerati significativi se associati ad un valore di probabilità p < 0,05.
Per le rette di taratura è stata usata una regressione lineare semplice ed è stato calcolato il quadrato del coefficiente di correlazione lineare di Pearson (R2).
Per il confronto dei 4 tipi di campioni dell'indagine preliminare su pecorini prodotti in Toscana, la significatività delle differenze nelle concentrazioni delle singole ammine e del totale è stata testata con il test non parametrico di Kruskal- Wallis e con il test di Tukey HSD sui ranghi dei dati per i confronti post-hoc.
5 Fase 1 - Risultati
5.1 Metodica HPLC per la determinazione di AB in
formaggi
5.1.1 Gradiente di eluizione
In figura 3 è mostrato il confronto tra le porzioni contenenti i picchi di TYR, SPD e SPM dei cromatogrammi ottenuti con i diversi gradienti testati per valutare la separazione di una miscela di ammine (100 µg/ml).
Il gradiente originale proposto da Innocente et al. (2007) non permetteva una efficace separazione dei picchi di TYR e SPM da due picchi di disturbo. Con il Gradiente n. 2 si otteneva già una parziale separazione dei picchi, che risultava
Fig. 3. Confronto tra porzioni dei cromatogrammi di una miscela di ammine biogene (100µg/ml) ottenuti con diversi gradienti. a, Gradiente n. 1 (Innocente et al., 2007); b, Gradiente n. 2; c, Gradiente n. 3.
5 Fase 1 - Risultati
completa con l'uso del Gradiente n. 3.
Per tutte le analisi successive (costruzione delle curve di taratura, valutazione dei parametri di validazione del metodo, analisi dei campioni) è stato quindi utilizzato il Gradiente n. 3.
5.1.2 Curve di taratura
In figura 4 sono rappresentati, a confronto, due cromatogrammi relativi a miscele a concentrazioni diverse (1 µg/ml e 25 µg/ml) di soluzioni standard di ammine, usati per la costruzione delle curve di taratura iniziali; queste sono state utilizzate per verificare per ciascuna ammina la linearità della risposta rilevata nell'analisi cromatografica rispetto alla sua concentrazione nella miscela analizzata.
La figura 5 mostra, per ciascuna ammina, i grafici dei punti sperimentali e delle rette di regressione lineare calcolate, mentre la tabella II elenca i corrispondenti parametri delle rette di regressione.
Fig. 4. Confronto fra due cromatogrammi di miscele di soluzioni standard di ammine biogene usati per il calcolo delle rette di taratura. A; 1 µg/ml, B; 25 µg/ml.
1, triptamina; 2, 2-feniletilammina; 3, putrescina; 4, cadaverina; 5, istamina; 6, standard interno; 7, tiramina; 8, spermidina; 9, spermina.
5 Fase 1 - Risultati
Fig. 5. Punti sperimentali e rette di taratura di ciascuna ammina.
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina; F, fattore di risposta.
5 Fase 1 - Risultati
Tab. II. Parametri delle rette di regressione lineare del fattore di risposta in funzione della concentrazione della ammina.
Ammina Intercetta Pendenza R2
Triptamina -0,01673 0,02181 0,9987 2-feniletilammina 0,02251 0,02245 0,9997 Putrescina 0,12028 0,03464 0,9961 Cadaverina 0,06005 0,03545 0,9994 Istamina 0,17535 0,01973 0,9610 Tiramina 0,03101 0,03890 0,9996 Spermidina 0,24478 0,03067 0,9756 Spermina 0,23521 0,02307 0,9732
5.1.3 Precisione within-day e between-day
Per ciascuna ammina e concentrazione reale della soluzione analizzata la tabella III riporta i valori del coefficiente di variazione della concentrazione ricalcolata, ottenuti nelle prove per valutare la precisione within-day della metodica.
Tab. III. Coefficiente di variazione within-day delle concentrazioni di ammine ricalcolate sulla base dell'analisi cromatografica.
Ammina
Coefficiente di variazione within-day (%) (n=5) Concentrazione analizzata (µg/ml) 1 12,5 100 Triptamina 2,144 3,455 1,616 2-feniletilammina 3,474 4,282 1,601 Putrescina 1,781 6,507 1,305 Cadaverina 0,916 4,891 1,267 Istamina 10,957 4,004 1,158 Tiramina 7,531 2,794 6,096 Spermidina 0,696 4,823 1,734 Spermina 2,647 7,780 2,989
5 Fase 1 - Risultati
Tutti i valori sono risultati ampiamente inferiori al 15%, con un valore massimo di 10,957% per l'HIS alla concentrazione più bassa (1 µg/ml), e solo 4 valori su 24 erano superiori al 5%.
Per ciascuna ammina e concentrazione reale della soluzione analizzata, la tabella IV riporta i valori del coefficiente di variazione della concentrazione ricalcolata, ottenuti nelle prove per valutare la precisione between-day.
Tab. IV. Coefficiente di variazione between-day delle concentrazioni di ammine ricalcolate sulla base dell'analisi cromatografica.
Coefficiente di variazione between-day (%) (n=4) Concentrazione analizzata (µg/ml) 1 2,5 5 7,5 12,5 25 50 75 100 125 TRP 5,856 5,714 6,233 3,769 4,470 4,170 5,555 2,967 1,821 0,465 2PHE 3,461 3,313 2,239 2,704 2,147 1,056 2,786 2,679 2,703 0,915 PUT 1,720 4,738 3,593 1,842 5,123 1,990 4,252 2,320 2,362 3,921 CAD 5,293 3,740 3,690 1,042 4,473 1,616 3,507 2,278 2,619 0,224 HIS 9,516 7,870 6,808 1,067 4,080 2,353 5,770 3,461 2,450 0,443 TYR 5,655 1,224 1,372 1,284 2,659 4,666 7,429 5,940 8,196 0,574 SPD 3,614 3,051 3,166 3,166 5,910 2,410 3,874 2,345 2,430 0,798 SPM 4,397 3,570 2,212 1,909 6,355 0,827 5,857 2,588 2,482 0,895
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina.
Nelle prove between-day tutti i valori sono risultati inferiori al 10%; il valore massimo è stato di 9,516% per l'istamina a concentrazione più bassa (1 µg/ml) e sono risultati superiori al 5% 17 valori su 80.
5.1.4 Percentuale di recupero delle AB da campioni di
formaggio
La figura 4 mostra un esempio di cromatogramma relativo ad un campione di estratto di formaggio a confronto con un cromatogramma di una miscela di soluzioni standard di ammine, mentre la tabella V mostra per ciascuna ammina la
5 Fase 1 - Risultati
percentuale di recupero media ottenuta da campioni di formaggio.
Tab. V. Percentuale di recupero delle singole ammine da campioni di formaggio.
Ammina Percentuale di recupero
(media ± deviazione standard)
Triptamina 103,13 ± 9,25 2-feniletilammina 86,14 ± 4,90 Putrescina 83,17 ± 9,61 Cadaverina 83,75 ± 4,55 Istamina 66,24 ± 5,41 Tiramina 96,03 ± 3,35 Spermidina 71,22 ± 7,90 Spermina 74,38 ± 9,55
Solo per l'HIS è stata riscontrata una percentuale di recupero media inferiore al
Fig. 6. Cromatogrammi di una soluzione standard di ammine (A) e di un campione di formaggio (B).
1, triptamina; 2, 2-feniletilammina; 3, putrescina; 4, cadaverina; 5, istamina; 6, standard interno; 7, tiramina; 8, spermidina; 9, spermina.
5 Fase 1 - Risultati
70%; la percentuale di recupero media della TYR, principale ammina presente nei formaggi, è stata del 96,03%.
5.2 Indagine sul contenuto di AB in pecorini prodotti in
provincia di Pisa
Le concentrazioni medie delle singole ammine, la loro concentrazione totale e la composizione percentuale in ammine per ciascuno dei quattro tipi di formaggio analizzati sono dettagliate nella tabella VI e mostrate graficamente nella figura 7.
Tab. VI. Concentrazioni (mg/kg, media ± deviazione standard) e composizione percentuale delle ammine biogene singole e totali nei quattro tipi di formaggio analizzati.
Tipo1 Tipo2 Tipo3 Tipo4
TRP 11,10 ± 2,55a (2,17 %) 11,76 ± 2,77 a (4,29 %) 11,89 ± 6,51 a (0,93 %) 88,14 ± 38,96 b (4,08 %) 2PHE 55,76 ± 70,56a,b (10,88 %) 23,98 ± 17,48 a (8,76 %) 127,12 ± 64,78 b (9,91 %) 143,65 ± 75,84 b (6,65 %) PUT 21,72 ± 47,29a (4,24 %) 54,03 ± 52,18 a (19,73 %) 39,14 ± 34,38 a (3,05 %) 512,14 ± 69,18 b (23,70 %) CAD 1,95 ± 2,37a (0,38 %) 36,79 ± 4,52 b (13,43 %) 54,38 ± 77,69 b (4,24 %) 261,88 ± 101,81 c (12,12 %) HIS NRa - NR a - 10,07 ± 15,74 a,b (0,78 %) 23,36 ± 20,84 b (1,08 %) TYR 420,36 ± 477,64a (82,03 %) 147,34 ± 70,25 a (53,79 %) 1039,65 ± 483,35 b (81,00 %) 1131,55 ± 247,59 b (52,37 %) SPD NRa - NR a - NR a - NR a - SPM 1,54 ± 2,94a (0,30 %) NRa - 1,13 ± 2,78a (0,09 %) NRa - Tot 512,43 ± 589,96a (100 %) 273,90 ± 127,37 a (100 %) 1283,39 ± 635,06 b (100 %) 2160,72 ± 434,02 b (100 %)
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina; Tot, totale; NR, non rilevata. Lettere diverse nella stessa riga indicano differenze statisticamente significative.
5 Fase 1 - Risultati
formaggi più della metà delle AB totali (minimo 52,37%, massimo 82,03%). Anche PUT, CAD, 2PHE e TRP erano presenti in diversa misura. È stato possibile rilevare la presenza di HIS solo nel formaggio di Tipo4, mentre SPD e SPM erano presenti solo in tracce o al di sotto della soglia di rilevabilità.
I risultati erano sempre associati ad un'alta deviazione standard, evidenziando una grande variabilità nel contenuto di AB anche all'interno dello stesso tipo di formaggio.
I quattro tipi di formaggio avevano concentrazioni totali di AB molto diverse; in
Fig. 7. Contenuto in ammine biogene singole e totali nei 4 tipi di formaggio analizzati (medie e deviazioni standard).
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina.
5 Fase 1 - Risultati
particolare i formaggi di Tipo3 e di Tipo4 hanno mostrato un contenuto di TYR e di AB totali significativamente più alto. In entrambi questi tipi di formaggio, inoltre, la concentrazione media di TYR superava i 1000 mg/kg (1039,65 ± 483,35 mg/kg per il Tipo3 e 1131,55 ± 247,59 mg/kg per il Tipo4); di conseguenza, anche il contenuto totale faceva lo stesso e raggiungeva valori superiori ai 2000 mg/kg nel pecorino di Tipo4.
Sebbene inferiori, anche nel formaggio pecorino di Tipo1 i livelli di TYR erano piuttosto elevati (420,36 ± 477,64 mg/kg), ma il contenuto totale medio di AB era comunque inferiore ai 1000 mg/kg (512,43 ± 589,96 mg/kg).
5.3 Allestimento di una scheda per l'analisi sensoriale
descrittiva di campioni di pecorino
A seguito degli assaggi commentati, dei 24 attributi sensoriali inizialmente presi in considerazione ne sono stati rimossi 5: i 2 attributi di aspetto (colore bianco, distribuzione degli occhi), perché si è ritenuto che nel futuro utilizzo della scheda per la valutazione di campioni non evidenziassero differenze importanti, e l'attributo di aroma di acido lattico, l'attributo di sapore acido e l'attributo di succosità relativo alla consistenza, perché non considerati pertinenti al tipo campioni in esame. Sono invece stati aggiunti ai parametri da considerare 11 attributi indicati dal panel come potenzialmente caratteristici o pertinenti per i futuri campioni: 6 di aroma (intensità di stagionatura, burro, caglio, frutti secchi, tostato, “sensazione di acidità”) e 5 di gusto (burro, caglio, frutti secchi, tostato, “sensazione di acidità”). In particolare l'aroma di intensità di stagionatura è stato considerato come quello più caratterizzante e quindi si è deciso di inserirlo come primo parametro da valutare. Per gli aromi e i gusti estranei è stato deciso di togliere le specifiche voci lasciando invece una riga indicata con “...” in cui gli assaggiatori, addestrati in tal senso, potessero indicare sia la natura dell'aroma o gusto estraneo percepito (se riuscivano ad identificarlo), sia la sua intensità. Gli assaggi non commentati successivi hanno permesso di individuare, tra quelli presi in considerazione, parametri non pertinenti o poco caratterizzanti, che sono
5 Fase 1 - Risultati
stati rimossi dagli attributi da valutare: l'aroma e il sapore di muffa/funghi, l'aroma e il sapore di caglio e di tostato, il sapore astringente, il sapore di salato e l'aderenza.
La scheda di valutazione risultante è mostrata in figura 8. Essa prevede l'uso di una scala grafica lineare non strutturata lunga 10 cm per la valutazione di 19 attributi sensoriali: 7 attributi di aroma, 8 relativi al gusto e 4 di consistenza. I 7 attributi di aroma sono: “Intensità di stagionatura”, definito come l'insieme degli aromi comunemente associati ad un formaggio stagionato; “Odore di latte di pecora”; “Animale/Stalla”; “Burro”; “Latte cotto/scaldato”; “Frutti secchi”; “Sensazione di acidità”, definito come un odore acido lattico fermentato irritante. Gli 8 attributi di gusto sono: “Latte di pecora”; “Amaro”; “Dolce”; “Piccante”; “Animale/Stalla”; “Frutti secchi”; “Burro”; “Sensazione di acidità”, definito come un retrogusto acido lattico fermentato irritante.
I 4 attributi di consistenza sono: “Durezza”; “Fragilità”; “Granulosità”; “Carattere grasso”, tutti definiti secondo la norma ISO 5492:2008.
5 Fase 1 - Risultati
Fig. 8. Scheda di valutazione usata per l'analisi sensoriale descrittiva dei campioni di formaggio.