Indice
Riassunto ... 1
Abstract ... 2
1 Introduzione ... 3
2 Le ammine biogene ... 5
2.1 Effetti tossicologici sull'uomo ... 5
2.2 Sintesi delle ammine biogene ... 8
2.3 Microorganismi produttori di ammine biogene ... 9
2.4 Ammine biogene negli alimenti ... 10
2.5 Ammine biogene nei formaggi ... 12
3 Introduzione alla parte sperimentale ... 20
4 Fase 1 - Materiali e metodi ... 22
4.1 Sostanze chimiche e reagenti ... 22
4.2 Metodica HPLC per la determinazione di AB in
formaggi ... 22
4.3 Indagine sul contenuto di AB in pecorini prodotti in
provincia di Pisa ... 27
4.4 Allestimento di una scheda per l'analisi sensoriale
descrittiva di formaggi pecorini ... 29
4.5 Analisi statistiche ... 30
5 Fase 1 - Risultati ... 31
5.1 Metodica HPLC per la determinazione di AB in
formaggi ... 31
5.2 Indagine sul contenuto di AB in pecorini prodotti in
provincia di Pisa ... 37
5.3 Allestimento di una scheda per l'analisi sensoriale
descrittiva di campioni di pecorino ... 39
6 Fase 2 - Materiali e metodi ... 42
6.1 Caseificazione sperimentale ... 42
6.2 Disegno sperimentale ... 42
6.3 Analisi del contenuto di AB ... 43
6.4 Analisi sensoriale ... 43
6.5 Analisi microbiologiche e screening dell'attività
decarbossilasica dei ceppi isolati ... 46
6.6 Analisi statistiche ... 53
7 Fase 2 - Risultati ... 55
7.1 Contenuto di AB nei formaggi prodotti ... 55
7.2 Analisi sensoriale ... 60
7.3 Analisi microbiologiche e screening dell'attività
decarbossilasica dei ceppi isolati ... 63
8 Discussione ... 70
9 Conclusioni ... 79
Riassunto
Parole chiave: ammine biogene, formaggio pecorino, HPLC, sicurezza alimentare, tiramina.
La presenza di ammine biogene (AB) negli alimenti può avere effetti negativi sulla salute del consumatore; nei formaggi è nota la presenza di AB sebbene in misura molto variabile nelle varie tipologie e talvolta all'interno della stessa. In questo studio, in una prima fase, è stato analizzato il contenuto di AB di pecorini prodotti in Toscana prelevati dal commercio; in una seconda fase è stata condotta una caseificazione sperimentale per valutare l'effetto di alcuni parametri tecnologici (pastorizzazione e stagionatura in grotta) sul contenuto di AB dei formaggi e sulle loro caratteristiche organolettiche. È stata anche valutata la capacità decarbossilasica di microorganismi isolati dai campioni analizzati. La quantificazione delle AB è stata eseguita con analisi HPLC-UV. Le AB più presenti erano tiramina (TYR), putrescina (PUT) e cadaverina (CAD). Il livello di AB totali di un pecorino a latte crudo stagionato 5 mesi, parzialmente in grotta, era significativamente più alto di quello di un pecorino a latte pastorizzato con stagionatura simile e di un pecorino a latte crudo stagionato in stabilimento 2 mesi. Nessuna differenza significativa è stata rilevata tra il contenuto di AB totali dello stesso pecorino a latte crudo stagionato 5 mesi e quello di un pecorino prodotto con latte pastorizzato e stagionato 6 mesi, in parte in una “fossa”. Nella caseificazione sperimentale entrambi i fattori studiati si sono rivelati significativi; la pastorizzazione ha avuto un effetto limitante sul contenuto di ammine, mentre i formaggi maturati in grotta avevano i contenuti di ammine più elevati. Nel formaggio prodotto con latte crudo e stagionato in grotta i livelli di AB totali erano significativamente più elevati che negli altri tipi; in questo tipo di formaggio, come nel formaggio a latte crudo stagionato in grotta e quello di fossa della prima fase, il contenuto di AB totali superava i 1000 mg/kg. La TYR era in molti casi presente in concentrazioni superiori ai 1000 mg/kg, per contro il contenuto di istamina è sempre stato contenuto (max. 28,69 ± 20,67 mg/kg). All'analisi sensoriale esisteva una differenza percepibile tra i diversi tipi di pecorino prodotti nella caseificazione sperimentale (triangle test), sebbene l'analisi descrittiva non abbia evidenziato differenze significative per i singoli attributi. Per quanto riguarda i microorganismi isolati, le Enterobacteriaceae e gli enterococchi hanno rivelato un'alta attività decarbossilasica per produrre, rispettivamente, CAD e PUT, e TYR, mentre i lattobacilli si sono mostrati generalmente con scarsa attività decarbossilasica sebbene in pochi casi abbiano prodotto quantità elevate di TYR.
Abstract
Parole chiave: biogenic amines, “pecorino” cheese, HPLC, food safety, tyramine.
The presence of biogenic amines (BAs) in foods can have negative effects on consumers' health; their presence in cheeses is known although with levels varying greatly in different types of cheeses and sometimes within the same type. In this study, in a first phase, the BA content of commercial “pecorino” cheeses manufactured in Tuscany was analyzed; in a second phase an experimental cheesemaking was carried out to assess the effects of two technological parameters (pasteurization and ripening in a cave) on cheeses' BA content and on their sensory characteristics. The decarboxylase activity of microorganisms isolated from analyzed samples was also studied. BA quantification was performed by HPLC-UV analysis. The BA present in higher amounts were tyramine (TYR), putrescine (PUT) and cadaverine (CAD). Total BAs level of a raw milk “pecorino” ripened 5 months, partly in a cave, was significantly higher than that of a pasteurized milk “pecorino” with a similar ripening and of a 2 months raw milk “pecorino” ripened in the dairy plant. No statistically significant difference was found when comparing total BAs of the same 5 months ripened raw milk “pecorino” with a pasteurized milk “pecorino” ripened 6 months, partly in a “fossa”. In the cheesemaking experiment both factors were significant; pasteurization had a limiting effect on amine content, whiles cheese ripened in a cave had the highest amine levels. In raw milk cheeses ripened in a cave total BA levels were significantly higher than those of the other types; in this kind of cheese, as in the raw milk cheese ripened in a cave and the “fossa” one of the first phase, total BAs content exceeded 1000 mg/kg. TYR was in many cases present in levels higher than 1000 mg/kg, conversely histamine levels were always moderate (max. 28.69 ± 20.67 mg/kg). Regarding the sensory analysis, there was a detectable difference among the types of cheese manufactured in the cheesemaking experiment (triangle test), although descriptive analysis did not reveal significant differences in specific attributes. As for the isolated microorganisms, Enterobacteriaceae and enterococci revealed a high decarboxylase activity with production, respectively, of CAD and PUT, and TYR, whilst lactic acid bacteria generally had a very low decarboxylase activity, even though in few cases they produced high quantities of TYR.
1 Introduzione
Le ammine biogene sono composti a basso peso molecolare presenti naturalmente in molti alimenti e bevande, specialmente se fermentati, nei quali sono principalmente il risultato della decarbossilazione di amminoacidi da parte di microorganismi. Le ammine biogene più abbondanti nei cibi sono istamina, tiramina, putrescina, cadaverina e 2-feniletlilammina. La presenza di quantità elevate di ammine negli alimenti può essere un rischio per la salute a causa della loro tossicità. L'istamina è responsabile della “sindrome sgombroide”, la tiramina della sindrome chiamata “cheese reaction”, mentre le altre ammine agiscono soprattutto come fattori potenzianti. In presenza di nitriti, le ammine sono una fonte di preoccupazione per la possibile formazione di nitrosammine cancerogene.
L'identificazione di livelli di sicurezza per le ammine biogene negli alimenti è difficile perché la loro tossicità varia a seconda del contenuto delle singole ammine e di quello totale. L'effetto sul consumatore, inoltre, è correlato con l'efficienza del suo sistema di detossificazione, efficienza che può variare molto da individuo a individuo e che può essere influenzata da particolari farmaci (ad esempio le mono-ammino ossidasi), dal fumo o dal consumo di alcool (ten Brink
et al., 1990). Alcune ammine biogene sono anche considerate un indice di qualità
per certi alimenti e alti livelli sono stati spesso associati con cattive pratiche di lavorazione (Nout, 1994).
La disponibilità di amminoacidi liberi, dovuti alla proteolisi, le condizioni ambientali che permettono la crescita di microorganismi decarbossilasi-positivi e la presenza del cofattore piridossal fosfato rendono il formaggio una matrice ideale per la formazione di ammine (Stratton et al., 1991; Loizzo et al., 2013). Diversi studi sono stati condotti sulla presenza di ammine biogene nei formaggi sia in Italia sia all'estero, evidenziando una grande variabilità tra i diversi tipi di formaggio studiati (Loizzo et al., 2013), ma pochi sono i dati presenti in
1 Introduzione
letteratura riguardanti formaggi pecorini prodotti in Toscana (Bavazzano et al., 2011; Forzale et al., 2011a; Forzale et al., 2011b).
Lo scopo di questa ricerca è stato quello di rilevare e quantificare il contenuto di ammine biogene in pecorini prodotti in Toscana mediante una metodica HPLC. La ricerca si è svolta in due fasi. In una prima fase, dopo la messa a punto della metodica, è stato valutato il profilo amminico di alcuni pecorini prodotti in Toscana. Nella seconda fase è stata effettuata una caseificazione sperimentale utilizzando un pecorino che dai dati della fase precedente risultava avere un contenuto particolarmente elevato di ammine biogene; il disegno sperimentale aveva lo scopo di valutare l'effetto di alcuni parametri tecnologici (pastorizzazione o meno, e tipo di stagionatura), in primis sul contenuto di ammine dei formaggi prodotti e poi sulle loro caratteristiche organolettiche. Parallelamente, nell'ambito nella medesima caseificazione, sono stati isolati ceppi batterici potenziali produttori di ammine biogene e ne è stata valutata l'effettiva produzione delle singole ammine.
2 Le ammine biogene
Le ammine biogene (AB) sono basi azotate con basso peso molecolare, aventi attività biologica, che vengono formate e degradate durante il normale metabolismo di animali, piante e microorganismi (ten Brink et al., 1990). Comprendono molecole che hanno un ruolo importante anche nella fisiologia umana, come ad esempio adrenalina, noradrenalina, dopamina, serotonina e istamina.
Nel settore alimentare il termine “ammine biogene” viene per lo più usato per indicare ammine non volatili presenti negli alimenti che provengono dal metabolismo microbico (Raguenes, 1988).
2.1 Effetti tossicologici sull'uomo
Sebbene le AB, come l'istamina (HIS), la spermidina (SPD), la spermina (SPM) e la putrescina (PUT), siano necessarie per molte funzioni critiche nell'uomo e negli animali, l'assunzione di cibo contenente elevate quantità di AB può portare ad effetti tossicologici che possono essere vasoattivi (tiramina (TYR)), psicoattivi o di entrambi i tipi (HIS) (ten Brink et al., 1990).
La più nota intossicazione correlata con una AB è la “sindrome sgombroide” (o
Scombroid Fish/Food Poisoning) causata dall'ingestione di alti quantitativi di
HIS; la sindrome prende il nome dalla famiglia di pesci degli Scombridae perché spesso è associata al consumo di tonno o sgombro. Gli effetti sono uguali a quelli del rilascio di istamina in circolo per degranulazione dei mastociti e quindi i sintomi sono simili a quelli di una reazione allergica. L'intossicazione da HIS è caratterizzata da un periodo di incubazione che varia da pochi minuti ad alcune ore con sintomi, solitamente presenti solo per alcune ore, correlati con l'effetto sui vasi sanguigni e sulla muscolatura liscia, che includono mal di testa, secrezione nasale, broncospasmo, tachicardia, extrasistole, ipotensione, edema delle palpebre, urticaria, prurito, arrossamenti e asma (EFSA, 2011). In alcuni
2 Le ammine biogene
casi, però, la sindrome sgombroide può portare ad effetti cardiovascolari gravi che necessitano di cure intensive, compreso l'infarto del miocardio (Sarullo et al., 2013).
Concentrazioni elevate di TYR negli alimenti possono causare la cosiddetta “sindrome del formaggio” o “cheese reaction” i cui sintomi, rappresentati da ipertensione (dovuta all'effetto vasocostrittivo), mal di testa, sudorazione, vomito e dilatazione delle pupille, compaiono normalmente da mezz'ora ad alcune ore dopo l'ingestione e scompaiono dopo alcune ore con remissione solitamente completa dopo 24 ore (EFSA, 2011).
Le ammine secondarie, come PUT e cadaverina (CAD), possono inoltre reagire con i nitriti per formare nitrosammine cancerogene (ten Brink et al., 1990).
Nel tratto intestinale dei mammiferi esistono sistemi di detossificazione dalle AB piuttosto efficienti, in cui hanno un ruolo importante le monoammino-ossidasi (MAO) e diammino-ossidasi (DAO); tali sistemi possono metabolizzare le quantità di AB normalmente assunte con il cibo, ma possono non riuscire ad eliminare alti livelli di AB ingeriti con cibi fermentati o andati a male (ten Brink
et al., 1990).
Il livello di tossicità di ciascuna ammina è difficile da determinare poiché è fortemente dipendente dall'efficienza del sistema di detossificazione. Quest'ultimo può essere influenzato negativamente, ad esempio, dalla assunzione di bevande alcoliche o di alcuni farmaci (es. inibitori delle MAO); in più l'ingestione contemporanea di più ammine causa un fenomeno di competizione per i sistemi di detossificazione per cui anche AB con un'attività farmacologica minore, quali CAD e PUT, fungono da potenziatori dell'effetto di HIS e TYR ostacolandone la rimozione (ten Brink et al., 1990).
Per questi motivi sarebbe necessario prendere in considerazione non solo la quantità di una singola AB in un singolo cibo, ma la quantità totale di AB ingerite in un pasto; infatti nelle categorie di consumatori a rischio (bambini, anziani, malati, ecc.), che possiedono sistemi di detossificazione immaturi o carenti,
2 Le ammine biogene
l'ingestione di dosi anche limitate di AB può portare ad episodi tossici anche gravi.
Alla luce di quanto detto è comprensibile la mancanza di livelli limite per la maggioranza delle ammine nei cibi. In Italia l'unico limite normativo riguardante il contenuto di AB nei cibi è stabilito dal Regolamento CE n. 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari, che indica tra i criteri di sicurezza alimentare i valori limite per il contenuto di HIS nelle specie ittiche associate ad un elevato tenore di istidina nelle carni; l'estratto della parte relativa all'HIS nel Regolamento CE n. 2073/2005 è mostrato in figura 1.
Alcuni Autori indicano un contenuto di HIS pari a 500 - 1000 mg/kg come potenzialmente pericoloso per la salute umana e riportano limiti suggeriti per l'HIS (100 mg/kg per i cibi e 2 mg/l per le bevande alcoliche), per la TYR (100 - 800 mg/kg) e per la 2-feniletilammina (2PHE) (30 mg/kg) (ten Brink et
al., 1990); altri riportano che un livello totale di 1000 mg/kg di AB negli alimenti
sia da considerarsi come pericoloso per la salute (Silla-Santos, 1996).
Fig. 1. Estratto dal Regolamento CE n. 2073/2005 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari. Criteri di sicurezza alimentare relativi al contenuto di istamina nel pesce.
2 Le ammine biogene
2.2 Sintesi delle ammine biogene
Le AB presenti nelle bevande e negli alimenti provengono generalmente dalla decarbossilazione, da parte di microorganismi, degli amminoacidi corrispondenti (ten Brink et al., 1990).
Pertanto per decarbossilazione possono essere formate, ad esempio: la 2PHE dalla 2-fenilalanina, la CAD dalla lisina, l'HIS dall'istidina, la PUT dall'ornitina, la TYR dalla tirosina e la triptamina (TRP) dal triptofano.
La PUT può anche essere formata a partire dall'arginina: dall'agmatina che è prodotto della decarbossilazione dell'arginina, o dall'ornitina stessa, prodotta a partire dall'arginina, con la via dell'arginasi oppure dell'arginina deidrolasi.
SPD e, da essa, SPM vengono formate non per semplice decarbossilazione, ma a partire da un'altra poliammina: la PUT.
L'acquisizione di vie enzimatiche che permettono la decarbossilazione degli amminoacidi rappresenta per i batteri un aumento della capacità di sopravvivere in condizioni di alta acidità e una ulteriore risorsa di energia (Rossi et al., 2014); la decarbossilazione può anche mediare altri effetti fisiologici come risposte a stress osmotici e ossidativi (Linares et al., 2011).
Vari fattori influenzano l'attività decarbossilasica; la produzione di AB è stata correlata con fattori come pH, concentrazione salina e temperatura (Silla-Santos, 1996; Gardini et al., 2001).
Poiché in ambiente acido i microorganismi sono più portati a produrre gli enzimi decarbossilasici come parte del loro meccanismo di difesa contro l'acidità (Halász et al., 1994), non stupisce che il livello di pH, in particolare, sia un importante fattore influenzante l'attività decarbossilasica (Silla-Santos, 1996). Di fatto per la maggior parte dei microorganismi il pH ottimale per l'attività decarbossilasica è compreso tra 5 e 6,5 (Raguenes, 1988).
Per ciò che riguarda la distruzione delle AB esse sono, ad eccezione della SPM, termostabili, per cui la loro rimozione negli alimenti può avvenire solo per azione
2 Le ammine biogene
delle MAO e DAO batteriche (Raguenes, 1988).
2.3 Microorganismi produttori di ammine biogene
Sebbene le decarbossilasi non siano largamente diffuse tra i batteri, esistono specie batteriche di molti generi che sono in grado di decarbossilare uno o più amminoacidi (Rice et al., 1976).
Tra i generi capaci di produrre AB si possono annoverare: Bacillus, Citrobacter,
Clostridium, Klebsiella, Enterococcus, Escherichia, Morganella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Photobacterium e i batteri lattici Lactobacillus, Pediococcus e Streptococcus.
Ma la capacità di produrre ammine non è omogenea tra le varie specie; alcune specie vengono associate principalmente alla produzione di determinate AB: il genere Lactobacillus è considerato produttore di HIS e PUT e solitamente non descritto come produttore di TYR (Loizzo et al., 2013), sebbene siano stati riportati, ad esempio, ceppi di Lactobacillus brevis e Lactobacillus casei produttori di tale ammina (Roig-Sagués et al., 2002); gli enterococchi sono considerati buoni produttori di TYR e PUT (Ladero et al., 2012; Loizzo et al., 2013); le Enterobacteriaceae vengono associate alla produzione di CAD, PUT e HIS (ten Brink et al., 1990; Bover-Cid e Holzapfel, 1999); i più forti produttori di HIS sono stati isolati da pesci coinvolti in casi di sindrome sgombroide e sono batteri Gram-negativi contaminanti (Hafnia alvei, Morganella morganii,
Klebsiella pneumoniae, Morganella psychrotolerans, Photobacterium
phosphoreum, Photobacterium psychrotolerans) (EFSA, 2011).
La capacità di produrre una determinata AB è tradizionalmente considerata una caratteristica distintiva a livello di ceppo (Marino et al., 2000; Linares et al., 2011), con grandi differenze riportate per il tipo e la quantità di AB prodotte da ceppi diversi della stessa specie (EFSA, 2011). Recentemente però è stato proposto che, almeno in certi casi, la capacità di produrre AB rappresenti una caratteristica di specie: Ladero et al. (2012) suggeriscono infatti che la capacità
2 Le ammine biogene
di produrre TYR sia un tratto caratteristico delle specie Enterococcus durans,
Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis e lo stesso valga per la capacità di
produrre PUT ed E. faecalis.
2.4 Ammine biogene negli alimenti
Le AB maggiormente presenti negli alimenti sono: HIS, PUT, CAD, TYR, 2PHE, SPM e SPD (Shalaby, 1996), la cui struttura chimica è mostrata in figura 2.
Fig. 2. Struttura chimica delle ammine biogene maggiormente presenti negli alimenti.
2 Le ammine biogene
Affinché si possano formare grandi quantità di AB negli alimenti è necessaria la presenza di amminoacidi liberi, di microorganismi in grado di decarbossilarli e di condizioni che permettano la crescita batterica, la sintesi degli enzimi decarbossilasici e la loro attività (Silla-Santos, 1996).
La quantità totale formata delle diverse ammine dipende fortemente dalla natura dell'alimento e dai microorganismi presenti. Per esempio, la carne dei pesci della famiglia Scombridae contiene alti livelli di istidina libera che può essere convertita dalla flora microbica presente, specialmente in caso di abuso termico, in HIS (ten Brink et al., 1990) ed è questo il motivo per cui l'intossicazione da HIS o “sindrome sgombroide” è solitamente associata al consumo di questi pesci. Sebbene le AB possano essere presenti praticamente in tutti i cibi che contengono proteine o amminoacidi liberi e che sono soggetti a condizioni che permettono l'attività microbica o biochimica, nei cibi non fermentati la presenza oltre un certo livello di AB è considerata come indicativa di una indesiderata attività microbica (Silla-Santos, 1996); i microorganismi responsabili possono fare parte della naturale microflora o essere frutto di contaminazioni prima o durante il processo produttivo. Per questo motivo il contenuto di ammine è stato suggerito come indicatore della qualità degli alimenti, tanto da proporre formule che prendono in considerazione i loro livelli per calcolare indici (BAI, Biogenic
Amine Index) di freschezza e di qualità igienica (Mietz e Karmas, 1977).
Nel caso degli alimenti fermentati, questi vengono stagionati per giorni, settimane o mesi per raggiungere il giusto grado di maturazione e, specialmente all'inizio di questa fase del processo produttivo, molti microorganismi possono trovare condizioni favorevoli alla crescita. Pertanto AB sono state rilevate in formaggi, vegetali fermentati, prodotti fermentati a base di carne, prodotti ittici fermentati, vino e birra.
Le colture starter possono avere un effetto sulla produzione delle ammine, sia diretto che indiretto, tramite l'interazione con la flora batterica naturale o contaminante (ten Brink et al., 1990); per questo è importante, per la produzione
2 Le ammine biogene
di alimenti fermentati, l'impiego di colture batteriche che non siano in grado di produrre AB.
2.5 Ammine biogene nei formaggi
Il formaggio è una matrice ideale per la formazione di ammine per la presenza di amminoacidi liberi, dovuti alla proteolisi, e del cofattore piridossal fosfato, oltre che per le condizioni di maturazione e conservazione che permettono la crescita di batteri decarbossilasi-positivi (Stratton et al., 1991; Loizzo et al., 2013).
Infatti, dopo il pesce, il formaggio è l'alimento più comunemente implicato in intossicazioni da HIS: il primo caso riportato in letteratura è avvenuto in Olanda nel 1967 e riguardava un formaggio gouda (Stratton et al., 1991). Inoltre la TYR, che è l'ammina più comunemente riscontrata nei formaggi, è, come già ricordato, responsabile della cosiddetta cheese reaction.
Nel corso degli anni sono stati condotti in tutto il mondo molti studi per valutare la presenza delle varie AB nei diversi tipi di formaggio, così come sono state pubblicate rassegne, anche recenti (Linares et al., 2011; Loizzo et al. 2013). Da queste emerge come le AB più presenti nei formaggi siano TYR, HIS, PUT, CAD, 2PHE e TRP e come il loro contenuto vari molto nei diversi tipi di formaggio, soprattutto in relazione con le condizioni igieniche del latte e la tecnologia di lavorazione (Loizzo et al., 2013), ma anche all'interno della stessa varietà di formaggio (Stratton et al., 1991, Linares et al., 2011) e persino tra sezioni diverse della stessa forma (Novella-Rodríguez et al., 2003).
I formaggi con un contenuto più elevato di AB sono: i formaggi erborinati in cui la presenza di ammine è correlata con la forte attività proteolitica connessa alla particolare tecnologia di lavorazione e i formaggi a lunga stagionatura (Loizzo et
al., 2013).
2.5.1 AB nei formaggi – AB nei formaggi pecorini
2 Le ammine biogene
sul contenuto di AB del formaggio ottenuto; Lanciotti et al. (2007) hanno riportato, in caseificazioni sperimentali con latte bovino ed ovino, un livello di AB nei pecorini notevolmente più alto di quello delle caciotte prodotte con latte bovino.
Maggiore è invece il numero di studi, in Italia e all'estero, nei quali è stato valutato il contenuto di AB di uno o più tipologie di formaggio prodotto con latte ovino.
In Spagna Fernández-García et al. (1999) hanno studiato il contenuto di AB in formaggio Manchego prodotto sperimentalmente con latte ovino crudo, con aggiunta o meno di proteasi, utilizzando diverse quantità di starter (0,1%, 1%): in questo studio in tutti i formaggi sono state rilevate TYR e HIS, presenti maggiormente in quelli prodotti con proteasi neutra rispetto a quelli prodotti con cisteina proteasi o senza proteasi e nei formaggi in cui è stata impiegata una maggiore quantità di starter; il contenuto massimo di TYR e HIS dopo 90 giorni di maturazione era, rispettivamente, di 356 mg/kg e 284 mg/kg.
Pinho et al. (2001) hanno studiato il contenuto di AB in formaggio Azeitão prodotto con latte ovino crudo in Portogallo, valutando anche l'influenza della temperatura di trasporto e di conservazione: HIS, TYR, CAD erano le ammine più presenti e il contenuto totale di ammine dopo il trasporto (2 giorni) a 4 °C e 25 °C era rispettivamente di 838 mg/kg di materia secca e 1078 mg/kg di materia secca, mentre il corrispettivo livello di HIS era 458 mg/kg di materia secca e 566 mg/kg di materia secca; dopo 28 giorni di conservazione (14 giorni a 4 °C e 14 a 25 °C) sono stati rilevati aumenti significativi solo di TYR e PUT, tanto da fare proporre queste due AB, da parte degli Autori, come indicatori di cambiamenti di temperatura durante la conservazione dei formaggi stagionati. Sempre in Portogallo, il contenuto di AB del formaggio Terrincho prodotto con latte ovino crudo è stato studiato da Pinho et al. (2004), che riportano un aumento del livello di ammine durante i 60 giorni di stagionatura al termine dei quali le ammine più presenti erano, in ordine, CAD, PUT e TYR e il contenuto totale di
2 Le ammine biogene
AB era superiore a 900 mg per kg di materia secca.
In Portogallo il formaggio Terrincho è stato oggetto anche di un altro studio (Pintado et al., 2008) in cui sono stati analizzati formaggi stagionati per 2 mesi prodotti da 5 caseifici diversi: in questo caso nel complesso le ammine più presenti erano, in ordine, PUT, CAD, etilammina e TYR, ma con forti differenze tra un caseificio e un altro, tanto che la TYR era in un caso l'ammina più presente, mentre in 2 casi non è stata affatto rilevata; il contenuto totale di AB variava da un minimo di 428 mg/kg di materia secca a un massimo di 922 mg/kg di materia secca.
Per ciò che riguarda i pecorini italiani, il contenuto di AB del Pecorino Abruzzese è stato studiato nel 2005 da Martuscelli et al. in pecorini sperimentali prodotti con latte crudo e senza starter oppure con latte pastorizzato e l'aggiunta di starter; in tale studio sono state rilevate etilammina, TYR, PUT, HIS, CAD, TRP, 2PHE, SPM e SPD con una prevalenza di HIS, TYR e PUT e un contenuto totale medio di AB di 600-700 mg/kg nel pecorino a latte crudo, mentre nel formaggio prodotto con latte pastorizzato le ammine prevalenti erano 2PHE, TYR, etilammina e PUT e il contenuto totale medio di AB superava i 1000 mg/kg. Del Signore e Di Giacomo (2008) hanno valutato l'influenza di vari fattori (tempo di stagionatura, temperatura, presenza di antimuffa sulla superficie) sul contenuto di AB e sulle caratteristiche organolettiche di formaggi pecorini, evidenziando una maggiore presenza di AB nel caso di periodi di maturazione più lunghi e temperature più alte, sebbene le concentrazioni finali siano state in tutti i casi non elevate con un contenuto massimo di 112,7 mg/kg di AB totali e di 51,70 mg/kg di TYR, che era l'ammina più presente.
Più recentemente Mercogliano et al. (2010) hanno condotto uno studio sul contenuto di AB nel Pecorino di Carmasciano durante la sua maturazione; contrariamente a quanto normalmente riportato (Loizzo et al., 2013) il contenuto di TYR e HIS era maggiore il giorno della caseificazione (473,5 mg/kg di TYR, 137,81 mg/kg di HIS) rispetto a fine maturazione a 201 giorni (136,41 mg/kg di
2 Le ammine biogene
TYR, 65,5 mg/kg di HIS) e la SPM era l'ammina maggiormente presente a fine stagionatura (348,4 mg/kg).
Uno studio condotto nel 2011 da Schirone et al. su 10 Pecorini di Farindola prodotti in altrettanti stabilimenti e maturati per 90 giorni ha confermato l'ampia variabilità del contenuto di AB anche tra formaggi dello stesso tipo (contenuto totale di AB minimo: 209,0 mg/kg; contenuto totale massimo: 2393 mg/kg); in questo caso l'ammina più presente era la TYR, ma sono state rilevate anche PUT, CAD, etilammina, 2PHE, SPD e HIS.
Per ciò che riguarda i formaggi prodotti in Toscana, Forzale et al. (2011a) hanno studiato 15 pecorini prelevati dal commercio, 8 a pasta molle e 7 a pasta semidura, riscontrando un'elevata variabilità nel contenuto di AB, tanto da rendere non significativa la notevole differenza tra i valori medi per le due categorie (307,61 mg/kg per i pecorini a pasta semidura, 78,59 mg/kg per i pecorini a pasta molle); in questo studio le ammine maggiormente presenti erano TYR e PUT seguite, in misura minore, da CAD, 2PHE, TRP e HIS.
Bavazzano et al. (2011) hanno condotto un'indagine sulla prevalenza delle ammine biogene nel Pecorino Toscano D.O.P. stagionato, analizzando a 2, 4, 6 e 8 mesi di stagionatura formaggi prodotti in 3 caseifici diversi: le ammine principalmente presenti erano TYR, PUT, CAD e HIS e il loro livello è aumentato con il progredire della maturazione sebbene si sia mantenuto a valori contenuti, con un valore mediano massimo di 267,5 mg/kg di AB totali, di cui 122,5 mg/kg di TYR e 52,6 mg/kg di HIS.
In uno studio sul “Pecorino del Parco di Migliarino – San Rossore” Forzale et al. (2011b) hanno monitorato il contenuto di AB, sia nella parte centrale del formaggio sia nel sottocrosta, fino al quinto mese di stagionatura evidenziando livelli significativamente più elevati nella porzione centrale e, anche in questo caso, un andamento in crescita nel corso del tempo; le ammine maggiormente presenti erano TYR e PUT, seguite in quantità minore da HIS e CAD. In questo studio, inoltre, sebbene al terzo mese di stagionatura (termine consueto della
2 Le ammine biogene
maturazione) il contenuto totale di AB fosse di 591,92 mg/kg, al quinto mese il livello totale di AB raggiungeva nella porzione centrale il valore di 1578,72 mg/kg, rappresentato in maggioranza da TYR (1300,05 mg/kg).
2.5.2 AB nei formaggi – trattamenti del latte
Poiché la pastorizzazione del latte è il trattamento più comunemente usato nella produzione di formaggio per ridurre il numero di microorganismi patogeni o contaminanti, il suo effetto sulla formazione di AB nei formaggi è stato studiato da diversi Autori e questo trattamento termico è generalmente considerato uno strumento efficace per la riduzione del contenuto di AB nei formaggi (Novella-Rodríguez et al., 2004).
In diversi studi condotti su formaggi commerciali è stato riscontrato, nei prodotti realizzati con latte pastorizzato, un basso contenuto di AB (Novella-Rodríguez
et al., 2003; Fernández et al., 2007; Andic et al., 2010).
Pattono et al. (2002) hanno studiato l'effetto di diversi parametri sul contenuto di AB in formaggi prodotti sperimentalmente, riportando il ruolo fondamentale della pastorizzazione nel ridurre le AB, soprattutto per ciò che riguarda PUT e CAD. Novella-Rodríguez et al. (2004) hanno ottenuto livelli significativamente più alti di AB in formaggi di capra prodotti sperimentalmente con latte crudo rispetto a quelli a latte pastorizzato, rilevando nei formaggi a latte crudo un contenuto di TYR 30 volte superiore.
Al contrario Martuscelli et al. (2005) non riportano alcuna differenza significativa nel contenuto totale di AB in Pecorino Abruzzese prodotto sperimentalmente con latte crudo senza starter e con latte pastorizzato e uso di starter, mentre Lanciotti et al. (2007) hanno riportato livelli significativamente più alti di AB in formaggi prodotti sperimentalmente con latte bovino e ovino termizzato rispetto a quelli a latte crudo. Gli stessi Autori riportano però un decremento del contenuto di AB nei formaggi prodotti con latte sottoposto a trattamento di omogeneizzazione ad alta pressione (100 MPa). Il trattamento del
2 Le ammine biogene
latte con alte pressioni è stato studiato anche da Novella-Rodríguez et al. (2002) in formaggi prodotti sperimentalmente con latte caprino senza rilevare differenze significative tra quelli a latte pastorizzato e quelli realizzati con latte trattato con alte pressioni (500 MPa), tale studio non prevedeva però un confronto con formaggi prodotti con latte crudo.
2.5.3 AB nei formaggi – maturazione del formaggio
La stagionatura ha un forte effetto sul contenuto di AB nei formaggi. Il periodo di maturazione è un fattore critico per l'accumulo di AB dato che la proteolisi che avviene all'interno del formaggio aumenta la disponibilità di amminoacidi, che possono quindi essere decarbossilati dagli enzimi microbici (Novella-Rodríguez
et al., 2003).
Nei formaggi non stagionati le AB non sono presenti o lo sono solo in piccole quantità e ciò suggerisce che la presenza di elevate quantità di AB in questo tipo di formaggi sia da considerarsi la conseguenza di una cattiva qualità igienica del latte (Loizzo et al., 2013).
Nei formaggi stagionati, molti studi sull'evoluzione del profilo amminico durante la maturazione hanno mostrato come il contenuto di AB aumenti nel corso della stagionatura (Galgano et al., 2001; Rodríguez et al., 2002; Novella-Rodríguez et al., 2003; Pinho et al., 2004; Martuscelli et al., 2005; Fernández et
al., 2007; Lanciotti et al., 2007; Komprda et al., 2008; Forzale et al., 2011b).
Pochi studi sono stati effettuati sull'effetto delle diverse condizioni di stagionatura. Mascaro et al. (2010) hanno studiato il contenuto di AB nel Formaggio di Fossa, valutando il contenuto di 3 forme infossate per 90 giorni: in tali formaggi il contenuto totale di AB (2557,69 mg/kg) era molto più elevato rispetto ai formaggi di controllo (71,07 mg/kg) maturati in stabilimento ed era formato per più della metà da CAD; altre ammine presenti erano PUT, TYR, 2PHE, HIS e SPM.
2 Le ammine biogene
2.5.4 AB nei formaggi – aspetti microbiologici
La formazione di AB nei formaggi può essere attribuita a vari microorganismi con attività decarbossilasica: batteri lattici starter, batteri lattici non-starter e altra microflora spontanea, sebbene in molti casi l'accumulo di ammine sia stato attribuito principalmente all'attività della microflora non starter (Loizzo et al., 2013).
Altri Autori ritengono che i principali produttori di AB nei formaggi siano i batteri Gram-positivi e che HIS e TYR si formino soprattutto per azione dei batteri lattici (Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus) presenti nella microflora del latte, a causa di contaminazione prima, durante o dopo la lavorazione, o ancora facenti parte di colture starter (Linares et al., 2011). Di fatto, anche se sono meno attivi nella decarbossilazione degli amminoacidi, il contributo dei batteri lattici all'accumulo di AB nei formaggi non può essere sottovalutato, alla luce delle alte popolazioni che questi microorganismi raggiungono nel formaggio per i lunghi periodi necessari alla maturazione (Andic
et al., 2010).
Inoltre è ipotizzabile un ruolo indiretto dei batteri lattici, in quanto le loro peptidasi, rilasciate anche dopo la loro lisi, potrebbero essere essenziali per fornire gli amminoacidi precursori delle ammine (Schirone et al., 2011). Un altro esempio dell'importanza dell'interazione tra microorganismi diversi (starter e microflora naturale/contaminante) può essere la formazione di PUT, alla luce del fatto che l'ornitina, non essendo presente nel latte deve essere sintetizzata prima della produzione di PUT, e che diverse specie presenti negli starter, come ad esempio la maggior parte dei lattobacilli eterofermentanti sono in grado di convertire l'arginina in ornitina con la via enzimatica dell'arginina deidrolasi (ten Brink et al., 1990).
La produzione di CAD e PUT è stata invece spesso correlata principalmente con la presenza di batteri Gram-negativi, specialmente Enterobacteriaceae (ten Brink
2 Le ammine biogene
indicatore di scarsa igiene o cattive pratiche di lavorazione.
Marino et al. (2000), studiando la capacità delle Enterobacteriaceae di produrre AB in formaggi erborinati, hanno correlato la presenza di conte elevate di questi microorganismi con maggiori quantità di CAD, tanto da suggerire specificatamente questa ammina come indicatore della qualità igienica delle caseificazioni, mentre attribuiscono la presenza di altre ammine (come HIS e TYR) alla contemporanea attività di altri microorganismi.
3 Introduzione alla parte sperimentale
Il lavoro sperimentale ha visto il susseguirsi di due fasi di lavoro. Poiché l'ideazione e la progettazione della seconda fase sono state il risultato dell'analisi dei dati della prima, le due fasi sperimentali verranno riportate separatamente: dapprima i materiali e metodi e i risultati della prima e di seguito i materiali e metodi e i risultati della seconda.
Nella prima fase di lavoro sono state eseguite le seguenti attività:
1. Messa a punto di una metodica HPLC per la determinazione del contenuto di AB nei formaggi sulla base di quella descritta da Innocente et al. (2007).
2. Indagine sul contenuto di AB in 4 tipologie di formaggio a base di latte ovino a media-lunga stagionatura prodotte in un caseificio della provincia di Pisa.
3. Allestimento di una scheda di valutazione utilizzabile per l'analisi sensoriale descrittiva di campioni di formaggio pecorino a media-lunga stagionatura.
La seconda fase del lavoro sperimentale è stata incentrata su un progetto di caseificazione sperimentale e ha comportato le seguenti attività:
1. Progettazione e messa in opera di una caseificazione sperimentale per esaminare l'influenza di alcuni parametri tecnologici sul contenuto di AB nei formaggi: tipo di latte utilizzato (crudo o pastorizzato) e tipo di stagionatura (in stabilimento o in grotta). Queste prove sono state realizzate su un solo tipo di formaggio pecorino: quello che, dai risultati della prima fase, presentava il contenuto di ammine più elevato.
2. Parallelamente sono state utilizzate tecniche di analisi sensoriale discriminativa e descrittiva, per valutare l'influenza dei medesimi
3 Introduzione alla parte sperimentale
parametri tecnologici sulle caratteristiche organolettiche dei formaggi a fine stagionatura.
3. Analisi microbiologica dei campioni prelevati nell'ambito della caseificazione sperimentale e screening dell'attività decarbossilasica, e quindi della capacità di produrre AB, dei microorganismi isolati.
4 Fase 1 - Materiali e metodi
4.1 Sostanze chimiche e reagenti
2-feniletilammina (2PHE) cloridrato, cadaverina (CAD) dicloridrato, istamina (HIS) dicloridrato, putrescina (PUT) cloridrato, sperimidina (SPD) tricloridrato, spermina (SPM) tetracloridrato, triptamina (TRP) cloridrato, tiramina (TYR) cloridrato, 1,7-diamminoeptano, dansil-cloruro, L-prolina, L-arginina cloridrato, L-fenilalanina, L-istidina cloridrato-monoidrato, L-lisina cloridrato, L-ornitina cloridrato, sale disodico di L-tirosina monoidrato, L-triptofano sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Inc. (Saint Louis, MO, USA); l'acido cloridrico (HCl), il bicarbonato di sodio (NaHCO3), l'idrossido di sodio (NaOH), l'acetone e
l'etere etilico sono stati reperiti presso Carlo Erba Reagenti S.p.A. (Milano, Italia). L'acetonitrile per HPLC (ACN) è stato acquistato da Panreac Quimica S.A.U. (Barcellona, Spagna). Per tutte le soluzioni e come eluente nelle analisi HPLC è stata utilizzata acqua ultrapura proveniente da un sistema Millipore Milli-Q (Millipore, Milano, Italia).
4.2 Metodica HPLC per la determinazione di AB in
formaggi
Per la quantificazione del contenuto di AB in formaggi è stata usata come base la metodica descritta da Innocente et al. (2007) che permette la quantificazione di otto ammine biogene 2PHE, CAD, HIS, PUT, SPD, SPM, TRP, TYR utilizzando l'1,7-diamminoeptano come standard interno (SI), il dansil-cloruro (DCl) come agente derivatizzante dell'estratto acido, e l'analisi RP-HPLC-UV con una colonna C18 e un programma di eluizione in gradiente con una miscela acqua – acetonitrile (ACN).
Sono state effettuate prove per adattare il gradiente allo specifico apparato cromatografico utilizzato; è stata verificata la linearità delle rette di taratura delle
4 Fase 1 - Materiali e metodi
singole ammine e sono state valutate, per ciascuna ammina, la precisione
within-day e between-day e la percentuale di recupero nei formaggi.
4.2.1 Soluzioni standard di ammine
Sono state allestite soluzioni standard (10 mg/ml) in HCl 0,1 M di ciascuna ammina e dello SI e conservate a -20 °C fino al momento del loro utilizzo. A partire da queste sono state preparate le soluzioni di lavoro a concentrazioni da 1 µg/ml a 125 µg/ml, utilizzate per l'identificazione dei picchi cromatografici, il calcolo delle curve di taratura e le prove di recupero. In particolare, a partire dalla soluzione standard di ciascuna ammina è stata allestita una miscela a 500 µg/ml di ciascuna delle otto ammine in HCl 0,1 M e quindi diluizioni seriali con HCl 0,1 M alle concentrazioni seguenti: 250 µg/ml; 125 µg/ml; 100 µg/ml; 75 µg/ml; 50 µg/ml; 25 µg/ml; 12,5 µg/ml; 7,5 µg/ml; 5 µg/ml; 2,5 µg/ml e 1 µg/ml.
4.2.2 Derivatizzazione
A 2 ml di ciascuna soluzione standard è stato aggiunto 1 ml di soluzione satura di NaHCO3; utilizzando un pHmetro GLP 21 (Crison Instruments S.A., Barcellona,
Spagna) il pH è stato aggiustato a 11,5 con NaOH 5 M, come indicato da Moret
et al. (1996).
In seguito 2 ml dell'agente derivatizzante DCl (5 mg/ml in acetone, preparato il giorno stesso e mantenuto al buio) sono stati aggiunti alla miscela, che è stata poi lasciata per 60 minuti a 40 °C agitandola ogni 10 minuti. Successivamente 400 µl di L-prolina (100 mg/ml) sono stati addizionati al campione per rimuovere il DCl in eccesso e lasciati reagire per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Sono poi state fatte 2 estrazioni liquido-liquido in serie, utilizzando ogni volta 2 ml di dietil-etere e aiutando la separazione delle fasi con una leggera centrifugazione (2000 g per 2 minuti).
Le fasi organiche sono state combinate e portate a secco in flusso di azoto a temperatura ambiente; il residuo è stato quindi nuovamente disciolto in 1 ml di
4 Fase 1 - Materiali e metodi
ACN, risultando pronto per l'iniezione nell'apparato cromatografico.
4.2.3 Apparato e condizioni cromatografiche
Per le analisi cromatografiche, eseguite presso il Laboratorio di Fisiologia Veterinaria del Dipartimento di Scienze Veterinarie, è stato utilizzato un apparecchio HPLC Jasco (Jasco Corporation, Giappone) dotato di 2 pompe per gradiente (PU-1580), un'unità mixer (HG-2080-03) e un rilevatore UV (870-UV); l'iniezione avveniva in loop da 20 µl.
La fase stazionaria era costituita da una colonna a fase inversa Gemini C18 (250 mm × 4,60 mm, 5 µm) (Phenomenex, Torrance, CA, U.S.A.). La fase mobile, contenente una miscela in gradiente di acqua e ACN, era eluita con un flusso di 0,8 ml/min.
Il rilevatore UV è stato impostato ad una lunghezza d'onda di 254 nm e l'acquisizione dei dati è stata effettuata mediante software JASCO-BORWIN, versione 1.50 (Jasco Corporation, Giappone).
4.2.4 Gradiente di eluizione
Per un'efficace separazione dei picchi cromatografici, in particolare dei picchi di TYR e SPM che con la metodica di Innocente et al. (2007) erano parzialmente sovrapposti a picchi di disturbo, sono stati testati gradienti di eluizione diversi. È stata modificata la composizione della miscela ACN/H20 nell'ultima parte del
programma di eluizione, dato che la TYR e la SPM sono tra le AB eluite per ultime.
In un primo test (Gradiente n.2) è stato allungato il tempo di passaggio dall'80% al 90% di ACN nella fase mobile da 2 a 3 minuti e il passaggio dal 90% al 100% da 4 a 6 minuti; in un secondo test (Gradiente n.3), la composizione della fase mobile è stata mantenuta all'80% di ACN per 4 minuti per raggiungere il 100% di ACN nei successivi 7 minuti.
4 Fase 1 - Materiali e metodi
La tabella I mostra in dettaglio i tempi e la composizione di ciascun gradiente testato.
Tab. I. Schema dei tempi e della composizione dei gradienti testati. Gradiente n. 1
(Innocente et al., 2007)
Gradiente n. 2 Gradiente n. 3
Minuto % ACN % H20 Minuto % ACN % H20 Minuto % ACN % H20
0 65 35 0 65 35 0 65 35 1 65 35 1 65 35 1 65 35 10 80 20 10 80 20 10 80 20 12 90 10 13 90 10 14 80 20 16 100 0 19 100 0 21 100 0 23 100 0 27 100 0 30 100 0
4.2.5 Curve di taratura
Utilizzando il gradiente di eluizione individuato nelle prove precedenti, sono state costruite le curve di taratura per le singole ammine, facendo una correlazione lineare tra la concentrazione della soluzione analizzata e il fattore di risposta, calcolato come il rapporto tra l'area del picco dell'ammina e l'area del picco dello SI, ottenuti dal corrispettivo cromatogramma. Per ogni ammina sono state usate le seguenti concentrazioni: 1 µg/ml; 2,5 µg/ml; 5 µg/ml; 7,5 µg/ml; 12,5 µg/ml; 25 µg/ml; 50 µg/ml; 75 µg/ml; 100 µg/ml; 125 µg/ml e 250 µg/ml, tutte con un'aggiunta di soluzione standard di SI (10 mg/ml) pari ad una concentrazione finale di SI equivalente a 20µg/ml, e sono stati calcolati l'equazione della retta di taratura e il relativo valore di R2.
4.2.6 Precisione within-day e between-day
La precisione within-day e between-day è stata valutata con repliche delle iniezioni e dell'analisi cromatografica di miscele di AB a diverse concentrazioni. Per la precisione within-day sono state fatte 5 repliche nello stesso giorno per una
4 Fase 1 - Materiali e metodi
concentrazione bassa, una media e una alta (1 µg/ml, 12,5 µg/ml, 100 µg/ml) e sono stati calcolati i relativi coefficienti di variazione delle concentrazioni, così come ricalcolateutilizzando le rette di taratura precedentemente determinate. Per la precisione between-day sono state fatte 4 repliche in giorni consecutivi per le concentrazioni utilizzate per la curva di taratura (1 µg/ml; 2,5 µg/ml; 5 µg/ml; 7,5 µg/ml; 12,5 µg/ml; 25 µg/ml; 50 µg/ml; 75 µg/ml; 100 µg/ml e 125 µg/ml) e sono stati calcolati i relativi coefficienti di variazione delle concentrazioni, così come ricalcolateutilizzando le rette di taratura precedentemente determinate.
4.2.7 Estrazione delle ammine biogene da campioni di
formaggio
L'estrazione e la derivatizzazione da campioni di formaggio è stata fatta secondo la metodica descritta da Innocente et al. (2007) con alcune modifiche. Per ogni campione, a 10 g di formaggio triturato sono stati aggiunti 20 ml di HCl 0,1 M e 100 µl di SI (10 mg/ml) e sono stati poi omogeneizzati con uno Stomacher Lab-Blender 80 (PBI International, Milano, Italia) per 2 minuti. Dopo centrifugazione a 12.000 g per 20 minuti a 4 °C e la rimozione dello strato di grasso in superficie, è stata prelevata la fase acquosa; il residuo è stato estratto nuovamente ripetendo la stessa procedura. I due estratti acquosi sono stati quindi combinati e portati ad un volume di 50 ml usando HCl 0,1 M.
La derivatizzazione, la preparazione all'iniezione nell'apparato cromatografico e l'analisi cromatografica sono state eseguite con le stesse modalità descritte per le soluzioni standard di AB (paragrafi 4.2.2 e 4.2.3).
4.2.8 Percentuale di recupero
Per le prove di recupero sono stati analizzati campioni di formaggio in doppio: una volta tal quali e una volta addizionati di 200 µl di soluzione standard di ciascuna ammina (10 mg/ml) in modo da ottenere nell'estratto, per ciascuna AB una concentrazione finale aggiunta nota (40 µg/ml).
4 Fase 1 - Materiali e metodi
La percentuale di recupero è stata calcolata usando la formula: [BA]add – [BA]orig
Recupero (%) = ―–―–―–―–―– X 100 40
dove:
[BA]add = Concentrazione di AB rilevata nel campione con aggiunta
[BA]orig = Concentrazione di AB rilevata nel campione senza aggiunta
4.3 Indagine sul contenuto di AB in pecorini prodotti in
provincia di Pisa
Per valutare il contenuto di AB nei diversi tipi di formaggio a latte ovino prodotti in Toscana è stata condotta un'indagine preliminare su prodotti diversi di uno stesso caseificio.
4.3.1 Campionamento dei formaggi
Sono stati esaminati 4 tipi di formaggio a pasta semidura a base di latte ovino tutti prodotti da un caseificio della provincia di Pisa. Per ogni tipo sono stati fatti 2 campionamenti, analizzando ogni volta 3 campioni dello stesso lotto.
Tutti i formaggi sono stati prodotti in caseificazioni condotte su circa 1500 litri di latte, con aggiunta di colture starter mesofile commerciali e utilizzando caglio commerciale di vitello in polvere (1:125.000; chimosina 96%, pepsina 4%; Caglificio Clerici, Cadorago, Como, Italia); la cagliata è stata tagliata in granuli delle dimensioni di una nocciola e messa in forme di plastica; dopo la stufatura i formaggi sono stati salati a secco e poi inviati alle celle di maturazione (temperatura: 7 °C, umidità relativa: 92%).
Il primo tipo di formaggio (Tipo1) è un pecorino prodotto con latte pastorizzato e una coltura starter commerciale di lattococchi mesofili e lattobacilli omofermentanti (Fiore Sardo, Centro Sperimentale del Latte SpA, Zelo Buon
4 Fase 1 - Materiali e metodi
Persico, Lodi, Italia); subisce una prima fase di maturazione di 60 giorni in cella e un successivo periodo di 90 giorni di maturazione in una grotta naturale della Garfagnana in Toscana, a temperatura e umidità non controllate (temperatura: approssimativamente 7 – 8 °C in inverno, 20 – 22 °C in estate; umidità relativa: approssimativamente 85 – 90%). Il prodotto finito pesa circa 2,5 kg.
Per il secondo tipo di pecorino (Tipo2) vengono usati latte crudo e una coltura starter commerciale formata da Lactococcus lactis lactis e L. lactis cremoris (Lyofast MO 0.31, Sacco s.r.l., Cadorago, Como, Italia). Alla fine del periodo di maturazione in cella, della durata di 60 giorni, i formaggi del Tipo2 pesano circa 2,2 kg.
Il terzo tipo di formaggio (Tipo3) è fatto con latte pastorizzato usando la stessa coltura starter del Tipo1. Dopo 90 giorni nella cella di maturazione, i formaggi del Tipo3 vengono maturati per ulteriori 90 giorni in una “fossa” tradizionale a Sogliano al Rubicone (FC), in Emilia-Romagna, a temperatura e umidità non controllate (valori approssimativi di temperatura e umidità relativa: 16 °C e 85 - 90%, rispettivamente). I formaggi del Tipo3 pesano approssimativamente 1 kg.
Il quarto tipo di pecorino (Tipo4) viene prodotto con latte crudo e la stessa coltura starter del Tipo2; dopo un periodo di maturazione di 60 giorni in cella, il formaggio viene ricoperto di paglia e fatto maturare per altri 90 giorni in una grotta di tufo del 18° secolo situata nella provincia di Pisa, anch'essa a temperatura e umidità non controllate (valori approssimati: 13 - 14 °C in inverno, 17 - 18 °C in estate; umidità relativa maggiore del 90%). I formaggi del Tipo4 pesano circa 2,4 kg.
4.3.2 Preparazione dei campioni per l'analisi cromatografica
L'estrazione dei campioni, la derivatizzazione, la preparazione all'iniezione nell'apparato cromatografico e l'analisi cromatografica sono state eseguite con le stesse modalità descritte nel paragrafo 4.2.7.
4 Fase 1 - Materiali e metodi
L'analisi è stata svolta in doppio per ciascun campione ed è stata ritenuta valida se il coefficiente di variazione percentuale associato era inferiore al 15%.
4.4 Allestimento di una scheda per l'analisi sensoriale
descrittiva di formaggi pecorini
Nell'ambito di uno stage di studio e ricerca presso il Dipartimento di Tecnologia degli Alimenti, Bromatologia e Nutrizione dell'Università di Murcia (Spagna), sono stati eseguiti test sensoriali preliminari per l'allestimento di una scheda per l'analisi sensoriale di campioni di formaggio pecorino a media-lunga stagionatura, utilizzando, per la valutazione degli attributi, una scala grafica lineare non strutturata lunga 10 cm.
A tale scopo sono state effettuate le seguenti prove:
• 3 prove di assaggio commentate dei 4 tipi di formaggio campionati durante l'indagine descritta nel paragrafo 4.3 finalizzate all'identificazione delle caratteristiche organolettiche principali e alla definizione di un vocabolario comune per descriverle e valutarle; in tali prove sono state utilizzate anche diluizioni di aromi in latte come ausilio nell'addestramento del panel;
• 10 prove di assaggio, in cieco e in ordine casuale, su ciascuno dei 4 tipi di pecorino, utilizzando schede create a partire dai dati raccolti negli assaggi commentati; i panel erano composti da un numero di assaggiatori compreso tra 5 e 10.
Per le sedute di assaggio sono stati usati campioni di formaggio tagliati a cubetti di circa 1 cm per lato e codificati anonimamente con numeri casuali di 3 cifre. Agli assaggiatori venivano forniti acqua e grissini non salati per pulire la bocca tra un campione e l'altro.
Inizialmente sono stati presi in considerazione 24 attributi sensoriali: 2 attributi di aspetto, 6 di aroma, 10 di gusto e 6 relativi alla consistenza. I 2 attributi di
4 Fase 1 - Materiali e metodi
aspetto erano: colore bianco, distribuzione degli occhi. I 6 attributi di aroma erano: latte di pecora, acido lattico – yogurt, latte scaldato/cotto, stalla, muffa/ funghi, odori estranei. I 10 attributi di gusto erano: latte di pecora, salato, acido, dolce, amaro, piccante/pungente, astringente, muffa/funghi, animale/stalla, sapori estranei. I 6 attributi relativi alla consistenza erano: durezza, fragilità, aderenza, granulosità, succosità, carattere grasso.
4.5 Analisi statistiche
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate con il software R (R Core Team, 2013), versione 3.0.2. I test sono stati considerati significativi se associati ad un valore di probabilità p < 0,05.
Per le rette di taratura è stata usata una regressione lineare semplice ed è stato calcolato il quadrato del coefficiente di correlazione lineare di Pearson (R2).
Per il confronto dei 4 tipi di campioni dell'indagine preliminare su pecorini prodotti in Toscana, la significatività delle differenze nelle concentrazioni delle singole ammine e del totale è stata testata con il test non parametrico di Kruskal-Wallis e con il test di Tukey HSD sui ranghi dei dati per i confronti post-hoc.
5 Fase 1 - Risultati
5.1 Metodica HPLC per la determinazione di AB in
formaggi
5.1.1 Gradiente di eluizione
In figura 3 è mostrato il confronto tra le porzioni contenenti i picchi di TYR, SPD e SPM dei cromatogrammi ottenuti con i diversi gradienti testati per valutare la separazione di una miscela di ammine (100 µg/ml).
Il gradiente originale proposto da Innocente et al. (2007) non permetteva una efficace separazione dei picchi di TYR e SPM da due picchi di disturbo. Con il Gradiente n. 2 si otteneva già una parziale separazione dei picchi, che risultava
Fig. 3. Confronto tra porzioni dei cromatogrammi di una miscela di ammine biogene (100µg/ml) ottenuti con diversi gradienti. a, Gradiente n. 1 (Innocente et al., 2007); b, Gradiente n. 2; c, Gradiente n. 3.
5 Fase 1 - Risultati
completa con l'uso del Gradiente n. 3.
Per tutte le analisi successive (costruzione delle curve di taratura, valutazione dei parametri di validazione del metodo, analisi dei campioni) è stato quindi utilizzato il Gradiente n. 3.
5.1.2 Curve di taratura
In figura 4 sono rappresentati, a confronto, due cromatogrammi relativi a miscele a concentrazioni diverse (1 µg/ml e 25 µg/ml) di soluzioni standard di ammine, usati per la costruzione delle curve di taratura iniziali; queste sono state utilizzate per verificare per ciascuna ammina la linearità della risposta rilevata nell'analisi cromatografica rispetto alla sua concentrazione nella miscela analizzata.
La figura 5 mostra, per ciascuna ammina, i grafici dei punti sperimentali e delle rette di regressione lineare calcolate, mentre la tabella II elenca i corrispondenti parametri delle rette di regressione.
Fig. 4. Confronto fra due cromatogrammi di miscele di soluzioni standard di ammine biogene usati per il calcolo delle rette di taratura. A; 1 µg/ml, B; 25 µg/ml.
1, triptamina; 2, 2-feniletilammina; 3, putrescina; 4, cadaverina; 5, istamina; 6, standard interno; 7, tiramina; 8, spermidina; 9, spermina.
5 Fase 1 - Risultati
Fig. 5. Punti sperimentali e rette di taratura di ciascuna ammina.
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina; F, fattore di risposta.
5 Fase 1 - Risultati
Tab. II. Parametri delle rette di regressione lineare del fattore di risposta in funzione della concentrazione della ammina.
Ammina Intercetta Pendenza R2
Triptamina -0,01673 0,02181 0,9987 2-feniletilammina 0,02251 0,02245 0,9997 Putrescina 0,12028 0,03464 0,9961 Cadaverina 0,06005 0,03545 0,9994 Istamina 0,17535 0,01973 0,9610 Tiramina 0,03101 0,03890 0,9996 Spermidina 0,24478 0,03067 0,9756 Spermina 0,23521 0,02307 0,9732
5.1.3 Precisione within-day e between-day
Per ciascuna ammina e concentrazione reale della soluzione analizzata la tabella III riporta i valori del coefficiente di variazione della concentrazione ricalcolata, ottenuti nelle prove per valutare la precisione within-day della metodica.
Tab. III. Coefficiente di variazione within-day delle concentrazioni di ammine ricalcolate sulla base dell'analisi cromatografica.
Ammina
Coefficiente di variazione within-day (%) (n=5) Concentrazione analizzata (µg/ml) 1 12,5 100 Triptamina 2,144 3,455 1,616 2-feniletilammina 3,474 4,282 1,601 Putrescina 1,781 6,507 1,305 Cadaverina 0,916 4,891 1,267 Istamina 10,957 4,004 1,158 Tiramina 7,531 2,794 6,096 Spermidina 0,696 4,823 1,734 Spermina 2,647 7,780 2,989
5 Fase 1 - Risultati
Tutti i valori sono risultati ampiamente inferiori al 15%, con un valore massimo di 10,957% per l'HIS alla concentrazione più bassa (1 µg/ml), e solo 4 valori su 24 erano superiori al 5%.
Per ciascuna ammina e concentrazione reale della soluzione analizzata, la tabella IV riporta i valori del coefficiente di variazione della concentrazione ricalcolata, ottenuti nelle prove per valutare la precisione between-day.
Tab. IV. Coefficiente di variazione between-day delle concentrazioni di ammine ricalcolate sulla base dell'analisi cromatografica.
Coefficiente di variazione between-day (%) (n=4) Concentrazione analizzata (µg/ml) 1 2,5 5 7,5 12,5 25 50 75 100 125 TRP 5,856 5,714 6,233 3,769 4,470 4,170 5,555 2,967 1,821 0,465 2PHE 3,461 3,313 2,239 2,704 2,147 1,056 2,786 2,679 2,703 0,915 PUT 1,720 4,738 3,593 1,842 5,123 1,990 4,252 2,320 2,362 3,921 CAD 5,293 3,740 3,690 1,042 4,473 1,616 3,507 2,278 2,619 0,224 HIS 9,516 7,870 6,808 1,067 4,080 2,353 5,770 3,461 2,450 0,443 TYR 5,655 1,224 1,372 1,284 2,659 4,666 7,429 5,940 8,196 0,574 SPD 3,614 3,051 3,166 3,166 5,910 2,410 3,874 2,345 2,430 0,798 SPM 4,397 3,570 2,212 1,909 6,355 0,827 5,857 2,588 2,482 0,895
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina.
Nelle prove between-day tutti i valori sono risultati inferiori al 10%; il valore massimo è stato di 9,516% per l'istamina a concentrazione più bassa (1 µg/ml) e sono risultati superiori al 5% 17 valori su 80.
5.1.4 Percentuale di recupero delle AB da campioni di
formaggio
La figura 4 mostra un esempio di cromatogramma relativo ad un campione di estratto di formaggio a confronto con un cromatogramma di una miscela di soluzioni standard di ammine, mentre la tabella V mostra per ciascuna ammina la
5 Fase 1 - Risultati
percentuale di recupero media ottenuta da campioni di formaggio.
Tab. V. Percentuale di recupero delle singole ammine da campioni di formaggio.
Ammina Percentuale di recupero
(media ± deviazione standard)
Triptamina 103,13 ± 9,25 2-feniletilammina 86,14 ± 4,90 Putrescina 83,17 ± 9,61 Cadaverina 83,75 ± 4,55 Istamina 66,24 ± 5,41 Tiramina 96,03 ± 3,35 Spermidina 71,22 ± 7,90 Spermina 74,38 ± 9,55
Solo per l'HIS è stata riscontrata una percentuale di recupero media inferiore al
Fig. 6. Cromatogrammi di una soluzione standard di ammine (A) e di un campione di formaggio (B).
1, triptamina; 2, 2-feniletilammina; 3, putrescina; 4, cadaverina; 5, istamina; 6, standard interno; 7, tiramina; 8, spermidina; 9, spermina.
5 Fase 1 - Risultati
70%; la percentuale di recupero media della TYR, principale ammina presente nei formaggi, è stata del 96,03%.
5.2 Indagine sul contenuto di AB in pecorini prodotti in
provincia di Pisa
Le concentrazioni medie delle singole ammine, la loro concentrazione totale e la composizione percentuale in ammine per ciascuno dei quattro tipi di formaggio analizzati sono dettagliate nella tabella VI e mostrate graficamente nella figura 7.
Tab. VI. Concentrazioni (mg/kg, media ± deviazione standard) e composizione percentuale delle ammine biogene singole e totali nei quattro tipi di formaggio analizzati.
Tipo1 Tipo2 Tipo3 Tipo4
TRP 11,10 ± 2,55a (2,17 %) 11,76 ± 2,77 a (4,29 %) 11,89 ± 6,51 a (0,93 %) 88,14 ± 38,96 b (4,08 %) 2PHE 55,76 ± 70,56a,b (10,88 %) 23,98 ± 17,48 a (8,76 %) 127,12 ± 64,78 b (9,91 %) 143,65 ± 75,84 b (6,65 %) PUT 21,72 ± 47,29a (4,24 %) 54,03 ± 52,18 a (19,73 %) 39,14 ± 34,38 a (3,05 %) 512,14 ± 69,18 b (23,70 %) CAD 1,95 ± 2,37a (0,38 %) 36,79 ± 4,52 b (13,43 %) 54,38 ± 77,69 b (4,24 %) 261,88 ± 101,81 c (12,12 %) HIS NRa - NR a - 10,07 ± 15,74 a,b (0,78 %) 23,36 ± 20,84 b (1,08 %) TYR 420,36 ± 477,64a (82,03 %) 147,34 ± 70,25 a (53,79 %) 1039,65 ± 483,35 b (81,00 %) 1131,55 ± 247,59 b (52,37 %) SPD NRa - NR a - NR a - NR a -SPM 1,54 ± 2,94a (0,30 %) NRa -1,13 ± 2,78a (0,09 %) NRa -Tot 512,43 ± 589,96a (100 %) 273,90 ± 127,37 a (100 %) 1283,39 ± 635,06 b (100 %) 2160,72 ± 434,02 b (100 %)
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina; Tot, totale; NR, non rilevata. Lettere diverse nella stessa riga indicano differenze statisticamente significative.
5 Fase 1 - Risultati
formaggi più della metà delle AB totali (minimo 52,37%, massimo 82,03%). Anche PUT, CAD, 2PHE e TRP erano presenti in diversa misura. È stato possibile rilevare la presenza di HIS solo nel formaggio di Tipo4, mentre SPD e SPM erano presenti solo in tracce o al di sotto della soglia di rilevabilità.
I risultati erano sempre associati ad un'alta deviazione standard, evidenziando una grande variabilità nel contenuto di AB anche all'interno dello stesso tipo di formaggio.
I quattro tipi di formaggio avevano concentrazioni totali di AB molto diverse; in
Fig. 7. Contenuto in ammine biogene singole e totali nei 4 tipi di formaggio analizzati (medie e deviazioni standard).
TRP, triptamina; 2PHE, 2-feniletilammina; PUT, putrescina; CAD, cadaverina; HIS, istamina; TYR, tiramina; SPD, spermidina; SPM, spermina.
5 Fase 1 - Risultati
particolare i formaggi di Tipo3 e di Tipo4 hanno mostrato un contenuto di TYR e di AB totali significativamente più alto. In entrambi questi tipi di formaggio, inoltre, la concentrazione media di TYR superava i 1000 mg/kg (1039,65 ± 483,35 mg/kg per il Tipo3 e 1131,55 ± 247,59 mg/kg per il Tipo4); di conseguenza, anche il contenuto totale faceva lo stesso e raggiungeva valori superiori ai 2000 mg/kg nel pecorino di Tipo4.
Sebbene inferiori, anche nel formaggio pecorino di Tipo1 i livelli di TYR erano piuttosto elevati (420,36 ± 477,64 mg/kg), ma il contenuto totale medio di AB era comunque inferiore ai 1000 mg/kg (512,43 ± 589,96 mg/kg).
5.3 Allestimento di una scheda per l'analisi sensoriale
descrittiva di campioni di pecorino
A seguito degli assaggi commentati, dei 24 attributi sensoriali inizialmente presi in considerazione ne sono stati rimossi 5: i 2 attributi di aspetto (colore bianco, distribuzione degli occhi), perché si è ritenuto che nel futuro utilizzo della scheda per la valutazione di campioni non evidenziassero differenze importanti, e l'attributo di aroma di acido lattico, l'attributo di sapore acido e l'attributo di succosità relativo alla consistenza, perché non considerati pertinenti al tipo campioni in esame. Sono invece stati aggiunti ai parametri da considerare 11 attributi indicati dal panel come potenzialmente caratteristici o pertinenti per i futuri campioni: 6 di aroma (intensità di stagionatura, burro, caglio, frutti secchi, tostato, “sensazione di acidità”) e 5 di gusto (burro, caglio, frutti secchi, tostato, “sensazione di acidità”). In particolare l'aroma di intensità di stagionatura è stato considerato come quello più caratterizzante e quindi si è deciso di inserirlo come primo parametro da valutare. Per gli aromi e i gusti estranei è stato deciso di togliere le specifiche voci lasciando invece una riga indicata con “...” in cui gli assaggiatori, addestrati in tal senso, potessero indicare sia la natura dell'aroma o gusto estraneo percepito (se riuscivano ad identificarlo), sia la sua intensità. Gli assaggi non commentati successivi hanno permesso di individuare, tra quelli presi in considerazione, parametri non pertinenti o poco caratterizzanti, che sono
5 Fase 1 - Risultati
stati rimossi dagli attributi da valutare: l'aroma e il sapore di muffa/funghi, l'aroma e il sapore di caglio e di tostato, il sapore astringente, il sapore di salato e l'aderenza.
La scheda di valutazione risultante è mostrata in figura 8. Essa prevede l'uso di una scala grafica lineare non strutturata lunga 10 cm per la valutazione di 19 attributi sensoriali: 7 attributi di aroma, 8 relativi al gusto e 4 di consistenza. I 7 attributi di aroma sono: “Intensità di stagionatura”, definito come l'insieme degli aromi comunemente associati ad un formaggio stagionato; “Odore di latte di pecora”; “Animale/Stalla”; “Burro”; “Latte cotto/scaldato”; “Frutti secchi”; “Sensazione di acidità”, definito come un odore acido lattico fermentato irritante. Gli 8 attributi di gusto sono: “Latte di pecora”; “Amaro”; “Dolce”; “Piccante”; “Animale/Stalla”; “Frutti secchi”; “Burro”; “Sensazione di acidità”, definito come un retrogusto acido lattico fermentato irritante.
I 4 attributi di consistenza sono: “Durezza”; “Fragilità”; “Granulosità”; “Carattere grasso”, tutti definiti secondo la norma ISO 5492:2008.
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Fig. 8. Scheda di valutazione usata per l'analisi sensoriale descrittiva dei campioni di formaggio.
