Analisi Molecolari: RNA sequencing

Per quanto riguarda le analisi molecolari sono state eseguite analisi trascrittomiche mediante sequenziamento di RNA (RNA sequencing) che hanno permesso di avere una panoramica su tutto il trascrittoma. L'espressione genica è stata valutata dopo 24 ore e dopo 7 giorni di trattamento sia nelle piantine del controllo che nelle plantule coltivate con 500 mg/L di TiO2 (NP). In particolare sono state preparate otto librerie di DNA complementare (cDNA) isolato

da RNA purificato da radici di piante di pomodoro; sono state ottenute otto librerie in quanto per ciascun esperimento sono state prese due repliche e gli esperimenti saggiati sono stati il controllo e il trattamento con 500 mg/L di TiO2 (NP) a uno e a sette giorni dall’inizio dei trattamenti. Con

l’RNA sequencing complessivamente sono state generate 116.5 milioni di sequenze reads Illumina, ognuna lunga 50 nt, che equivalgono a 5,8 Giga-basi. Ogni campione (sia di piante controllo che di piante trattate con NP di TiO2) è stato rappresentato da oltre 2 milioni di reads (Tabella 3), una

copertura sufficiente per compiere analisi quantitative di espressione genica (’t Hoen et al., 2008).

Tabella 3. Milioni di reads Illumina ottenute nelle otto librerie di cDNA.

Giorni trascorsi dall’inizio del trattamento

1 7

Controllo 14.1 7.9 15.3 19.1

4.3.1 Analisi Molecolari: espressione di geni coinvolti nello sviluppo radicale

Per cercare di fare luce sui meccanismi molecolari implicati nella risposta di piante di pomodoro trattate con NP di TiO2, sono stati scelti geni coinvolti nello sviluppo radicale. In

particolare, basandoci su dati trovati in letteratura e in base ad omologie di sequenza, all’interno di database NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) sono state selezionate 46 sequenze di cDNA di pomodoro putativamente ortologhe a geni di Arabidopsis espressi nel corso della formazione di peli radicali, oppure in condizioni di carenza minerale o in condizioni di anossia.

Sono stati saggiati 46 geni (Tabella 2), di questi sono stati considerati quelli significativamente espressi ovvero quelli in cui è stata allineata almeno una reads illumina per kilobase di sequenza ogni milione di reads (RPKM>1). Per ognuno è stato calcolato l’RPKM, ed infine di questi è stata valutata l’espressione differenziale tra piante trattate con NP e piante di controllo. In Figura 15 sono riportati i livelli di RPKM solo dei geni con espressione differenziale (indotti o repressi in seguito al trattamento con NP) (p< 0.05), mentre per gli altri geni considerati i livelli di espressione tra piante stressate e di controllo non sono differiti in modo significativo.

Tra i geni coinvolti nella risposta a carenza da minerali, quelli differenzialmente espressi tra piante trattate e piante di controllo codificano per proteine coinvolte nella trasduzione del segnale (FER, MPK3, Nitf, MEK1, 14-3-3, Dwarf1), nel trasporto di metalli (Zip9, LeFRO1, LeIRT1, LeIRT2, LePT1, LeNAS) e nel metabolismo (Enolase) (Tabella 2, Figura 15). L’espressione di geni codificanti proteine legate al trasporto di metalli è risultata superiore in piante trattate per 24 ore rispetto al controllo, mentre in piante trattate per 7 giorni l’espressione dei geni Zip9, LeIRT1, LeIRT2 è risultata repressa.

Riguardo a geni legati all’azione di auxina ed etilene, AXR2, MTK, LeETR1 sono risultati repressi in piante trattate dopo 7 giorni (Tabella 2, Figura 15).

Infine riguardo a geni coinvolti nella formazione e sviluppo di peli radicali, sono risultati differenzialmente espressi RHS15, MRH1 e XTH9 codificanti rispettivamente per una permeasi di membrana, una kinasi e un enzima coinvolto nel metabolismo della parete cellulare (Tabella 2, Figura 15).

Figura 15 – Istogrammi relativi ai livelli di espressione (espressi in RPKM) di geni differenzialmente espressi

in radici di piante allevate con sospensioni di NP di TiO2 rispetto a piante di controllo dopo 24 ore e dopo 7

giorni di trattamento. I geni sono stati suddivisi in tre gruppi: espressi in condizioni di carenza da minerali, coinvolti nell’azione di auxina o etilene, coinvolti nella formazione di peli radicali. Gli asterischi indicano differenze di espressione statisticamente significative (p<0.05).

CARENZA DA MINERALI

ORMONI

4.3.2 Analisi Molecolari: espressione degli elementi trasponibili

Al fine di analizzare l’espressione di elementi trasponibili (TEs), le reads illumina di ciascuna libreria sono state allineate al set di sequenze ripetute di pomodoro presenti nel database

TIGR_Solananum_Repeats.v3.2 (ftp://ftp.plantbiology.msu.edu/pub/data/TIGR_Plant_Repeats /TIGR_Solanum_Repeats.v3.2), utilizzando il software CLC BIO Genomic Workbench.

Successivamente è stato calcolato il numero di reads allineate (mappate) alle diverse sequenze del database per chilobase di lunghezza delle sequenze per milione di reads mappate (Reads Per Kilobase per Million, RPKM) ovvero una misura normalizzata che consente di confrontare livelli di trascrizione di tutti i trascritti di un campione e anche tra campioni diversi. Per valutare il livello di espressione di sequenze ripetute, sono stati determinati i valori di RPKM anche per 12 geni house-keeping codificanti actina, che vengono spesso utilizzati come standard comparativi in analisi di trascrizione. Per le analisi sono state considerate solo le sequenze trascritte ad alti livelli, ovvero solo quelle che hanno mostrano valori di RPKM superiori al gene codificante actina più espresso. Delle 6.486 sequenze ripetute di pomodoro presenti nel database, solo meno dell’1%, appartenenti solo a cinque categorie, sono risultate fortemente espresse nelle radici di piante di controllo o di piante trattate con 500 mg/L di NP di TiO2 (Tabella 4). Tra queste la

categoria più rappresentata è risultata quella dei retrotrasposoni LTR Ty1-Copia; questa categoria ha, tra l’altro, mostrato un maggior numero di elementi fortemente espressi nelle piante trattate rispetto a piante di controllo. Un’espressione differenziale (cioè un’induzione o una repressione rispetto ai controlli) è stata osservata solo per cinque sequenze ripetute in piante trattate per 1 giorno e per nove sequenze in piante trattate per 7 giorni (Tabella 4). L’espressione differenziale si è manifestata in particolare nei retrotrasposoni Copia (Tabella 4). Anche in questo caso i risultati sono particolarmente evidenti in piante trattate per 7 giorni.

Analisi BLAST effettuate sugli elementi trasponibili differenzialmente espressi hanno mostrato che le seguenti sequenze di retrotrasposoni Copia attivati, identificate da specifici numeri di accessione, presentavano elevata omologia di sequenza con retrotrasposoni conosciuti di Solanaceae come Tto1 e Tnt1 (Grandbastien et al., 2005): PRSgTERT00100256, PRSgTERT00100760, PRSgTERT00100970, PRSgTERT00101052, PRSgTERT00101284.

Infine è interessante notare che la stessa sequenza ripetuta, appartenente alla categoria di trasposoni non classificati, risulta indotta sia dopo 1 giorno che dopo 7 giorni di trattamento (Tabella 4).

Tabella 4 - Numero e tipo di sequenze ripetute presenti nel database TIGR di pomodoro significativamente

altamente espresse in radici di piante di controllo o in radici di piante trattate per 1 o 7 giorni con 500 mg/L di NP di TiO2. È riportato anche il numero di sequenze ripetute differenzialmente espresse (p<0.05) nei

trattati rispetto ai controlli.

Tipo di sequenze

ripetute N°

Espresse dopo 1 giorno Espresse dopo 7 giorni

Controllo Trattato Indotte Represse Controllo Trattato Indotte Represse Ripetizioni non classisicate 1,857 5 5 - 2 4 4 1 - Retrotrasposoni Copia 1,333 7 11 1 1 11 13 6 1 Retrotrasposoni Gypsy 331 - - - - LINE 626 - - - - 1 1 - - SINE 170 - 1 - - - - Retrotrasposoni non classificati 941 - - - - Transposoni a DNA 22 - - - - Transposoni non classificati 995 1 2 1 - 3 1 1 - Totale 6,473 13 19 2 3 19 19 8 1