Dal nostro lavoro di ricerca abbiamo potuto constatare che, se disperse nella soluzione nutritiva, entrambe le NP testate, sia quelle di Fe3O4 che quelle di TiO2, sono in grado di ricoprire
l’epidermide radicale formando aggregati nanostrutturati. La formazione di questi aggregati sulla superficie radicale avviene rapidamente, tuttavia è possibile che piccoli aggregati o NP singole possano comunque risultare biodisponibili. In effetti questi aggregati non sembrano creare degli ostacoli a fenomeni di assorbimento di NP, poichè analisi al microscopio elettronico hanno mostrato che entrambe le NP (Fe3O4 e TiO2) sono state assorbite dalle radici e traslocate
all’ipocotile, ma non fino alle foglie.
Nel corso dei nostri esperimenti le piante trattate con NP di Fe3O4 o TiO2 a diverse
concentrazioni non hanno riscontrato evidenti differenze morfologiche o alterazioni nella crescita rispetto alle piante di controllo, dimostrando che tali NP non sembrano avere effetti tossici ai livelli di concentrazione utilizzati. Risultati simili sono stati ottenuti da Zhu et al., (2008) su piante di zucca (Cucurbita maxima), utilizzando come nel nostro esperimento, condizioni di allevamento in idroponica e le stesse concentrazioni di Fe3O4 (NP). Nello stesso esperimento gli autori hanno
osservato che un gran numero di particelle era stato accumulato sulla superficie radicale e alcune NP erano state assorbite dalle radici e traslocate agli organi epigei (incluse le foglie), ma ciò non era accaduto in piante di Phaseolus limensis, dove le NP di Fe3O4 non erano state assorbite. Nei
nostri esperimenti, al contrario, nessuna NP è stata osservata nelle foglie, dimostrando che diverse specie di piante o diversi stadi di sviluppo possono dare risposte alternative, soprattutto per quanto riguarda la capacità di assorbire e traslocare le NP.
Per quanto riguarda le NP di TiO2, in un recente studio è stato dimostrato che possono
essere accumulate e traslocate all’interno dei germogli in piante di Arabidopsis thaliana (Kurepa et
al., 2010). Tuttavia tali studi sono basati principalmente su analisi elementari che prendono in
considerazione la forma ionica del metallo incorporato dalle piante, senza tenere di conto della presenza del metallo in forma di NP né la distribuzione spaziale. Ad oggi, in un solo articolo è stato studiato l’assorbimento e il conseguente trasferimento delle NP di TiO2 all’interno delle radici o
dalle radici al germoglio in piante esposte ad una soluzione contenente TiO2 (Larue et al., 2011). Gli
in coltura idroponica e sottoposto a soluzioni nutritive contenenti NP di TiO2, dimostrando che tali
particelle vengono assorbite dalle piante senza alterarne in modo significativo la germinazione e l’allungamento delle radici. Dopo 7 giorni di esposizione, NP di TiO2 sono state osservate nel
parenchima radicale del grano e anche all’interno del suo cilindro vascolare, dimostrando che queste NP possono essere trasferite dalla sospensione ai tessuti vegetali esposti. I nostri esperimenti sulle piante di pomodoro trattate con NP di TiO2 avvalorano questi risultati,
confermando che le radici sono in grado di assorbire il biossido di titanio in forma nanometrica e da qui, quest’ultimo, può essere traslocato agli organi aerei della pianta. Nei nostri studi non sono stati osservati sintomi di effetti tossici né sui germogli né sulla crescita delle radici. Ciò è in accordo con le osservazioni di Larue et al. (2012) effettuate sul grano, ma è in contrasto con i risultati descritti da Feizi et al. (2012) che hanno dimostrato come le NP di TiO2 siano in grado di migliorare
la crescita di plantule di grano rispetto al controllo non trattato o con i risultati descritti da Zheng
et al. (2005) che hanno segnalato la promozione della germinazione, della fotosintesi e della
crescita di piante di spinacio da parte dello stesso tipo di NP.
Risultati diversi ottenuti utilizzando lo stesso tipo di NP non sono sorprendenti, infatti occorre considerare che le NP possono esplicare la loro azione a seconda delle dimensioni e/o della forma delle particelle, ma anche in base alle concentrazioni applicate, alle condizioni specifiche degli esperimenti, alle specie vegetali utilizzate e al loro meccanismo di assorbimento (Ruffini Castiglione et al., 2011). Anche se i nostri esperimenti e altri studi simili rappresentano probabilmente scenari quasi impossibili da ritrovare nella realtà (si tratta infatti di piante coltivate in un mezzo liquido contenente alte concentrazioni di NP), essi sono tuttavia in grado di fornire una prova convincente su un aspetto fondamentale legato al rischio ecologico arrecato dalle NP: l'assorbimento di queste da parte di alcune piante coltivate a scopo alimentare, implica un potenziale rischio di accumulo di tali NP nella catena alimentare.
Concentrazioni relativamente elevate di NP di TiO2 (500 mg/L) nella soluzione nutritiva
inducono un chiaro effetto sulla morfogenesi dell’apice radicale comportando un’abnorme proliferazione di peli radicali rispetto a piante di controllo o a piante esposte ad altri trattamenti (Figure 7-11). Questa risposta dipende dalla concentrazione delle NP in sospensione e dalle caratteristiche chimico-fisiche delle stesse, infatti solo NP di TiO2 ad elevate concentrazioni hanno
Tuttavia, resta ancora da chiarire se tale fenomeno sia il risultato di:
1. Una perturbazione meccanica (tigmomorfogenesi);
2. Una carenza di ossigeno o un mancato assorbimento di alcuni minerali, dovuto ad una specie di “soffocamento” causato dalla deposizione esterna di NP. Le aggregazioni di NP osservate a ridosso dell'epidermide a seguito dei trattamenti potrebbero limitare la capacità di assorbimento delle radici, limitando di fatto la superficie utile per l’ingresso delle sostanze nutritive o di ossigeno.
3. Una risposta all’assorbimento di NP di TiO2.
Qualsiasi sia la spiegazione del fenomeno, resta da capire perché solo le NP di TiO2
determinano la risposta morfologica mentre quelle di Fe3O4, nonostante possano creare una
perturbazione meccanica, creare aggregati sulla superficie radicale e venire assorbite dalle radici, non determinano questo tipo di risposta. Evidentemente le differenti caratteristiche chimico- fisiche delle NP di TiO2 e Fe3O4 determinano differenti risposte morfologiche.
L’ipotesi al momento più probabile, anche se le altre ipotesi non possono essere escluse, è che la proliferazione di peli radicali sia dovuta ad una risposta adattativa nata in seguito alla deposizione delle NP sulla superficie esterna: una risposta dovuta quindi ad una ridotta capacità di assorbimento radicale, sia in termini idrici che di sostanze nutritive o ossigeno.
I peli radicali sono escrescenze polarizzate di cellule epidermiche specializzate (tricoblasti) che aumentano l'area di assorbimento della radice. La loro iniziazione e la successiva crescita (allungamento) sono regolate da diversi gruppi di geni e sono sensibili ad alcune sostanze ormonali (in particolare auxina ed etilene) e ad alcuni fattori ambientali (per esempio carenza di nutrienti) (Schiefelbein, 2000). ). In Arabidopsis una bassa biodisponibilità di alcuni macro e micro-elementi, in particolare ferro, fosforo e manganese, induce cambiamenti morfogenetici nelle radici che portano ad un maggiore rapporto superficie/volume e ad un ampliamento della superficie di assorbimento grazie ad un aumento della durata di vita e del numero di peli radicali (Schmidt and Schikora, 2001; Yang et al., 2008).
In seguito ad analisi di sequenziamento di RNA sono stati inizialmente selezionati 46 geni coinvolti nello sviluppo radicale. I dati hanno confermato il coinvolgimento dell’azione di ormoni come auxina ed etilene nella formazione di peli radicali in risposta ai trattamenti effettuati, infatti
trascritti di geni come AXR2, MTK, LeETR1, rispettivamente codificanti per un fattore di trascrizione legato all’azione dell’auxina, per un enzima della biosintesi di etilene, e per un recettore dell’etilene, (Schmidt e Schikora, 2001, Yang et al., 2010, Zuchi et al., 2009) hanno mostrato una espressione differenziale.
Inoltre anche geni coinvolti nell’omeostasi di metalli a livello radicale che codificano per proteine coinvolte nella trasduzione del segnale (FER, MPK3, Nitf, MEK1, 14-3-3, Dwarf1) e nel trasporto di metalli (Zip9, LeFRO1, LeIRT1, LeIRT2, LePT1, LeNAS) (Brumbarova e Bauer, 2005, Wang et al. 2002, Zuchi et al., 2009, Yang et al., 2010) hanno mostrato una espressione differenziale, indicando che il trattamento effettuato con NP di TiO2 determina probabilmente
alterazioni nell’assorbimento o trasporto di nutrienti metallici. I nostri risultati sembrano concordare con i risultati ottenuti in tabacco trattato con NP di Al2O3, in cui gli autorihanno trovato
un’espressione differenziale di 3 miRNA che giocano un ruolo chiave nella carenza di nutrienti e nella resistenza alla siccità (Burklew et al., 2012).
Infine l’espressione differenziale di tre geni di pomodoro, ortologhi ai geni RHS15, MRH1 e XTH9 coinvolti nella formazione di peli radicali in Arabidopsis, indica che per queste due specie esistono meccanismi molecolari simili che controllano la morfogenesi dei tricoblasti.
Attraverso analisi trascrittomiche di RNA-seq è stata valutata anche l’espressione di elementi trasponibili (TEs). Si è potuto osservare che delle 6.486 sequenze ripetute di pomodoro presenti nel database TIGR solo una minima parte è risultata espressa ad alti livelli, confermando dati riscontrati in letteratura secondo cui la maggioranza degli elementi trasponibili è sotto stretto controllo trascrizionale (Lisch, 2009). La categoria più rappresentata è risultata quella dei retrotrasposoni LTR Ty1-Copia; questa categoria ha, tra l’altro, mostrato un maggior numero di elementi fortemente espressi nelle piante trattate rispetto a piante di controllo. Un’espressione differenziale tra piante trattate e piante di controllo è stata osservata solo per cinque sequenze ripetute in piante trattate per 1 giorno e per nove sequenze in piante trattate per 7 giorni (Tabella 4). Tale differenza, evidenziatasi in funzione del tempo trascorso dall’inizio del trattamento, fa ipotizzare che l'attivazione delle sequenze ripetute non faccia parte di una pronta risposta alla presenza di NP. L’espressione differenziale si è manifestata in particolare nei retrotrasposoni Copia e particolarmente in piante trattate per 7 giorni.
Tra gli elementi trasponibili differenzialmente espressi in risposta ai trattamenti con NP, 5 retrotrasposoni Copia hanno presentato omologia di sequenza con retrotrasposoni conosciuti di
Solanaceae come Tto1 e Tnt1 (Grandbastien et al., 2005) risultati inducibili da stress in altre
solanacee come tabacco. Ciò indica che anche lo stress indotto dai nostri trattamenti è in grado di attivare trasposoni appartenenti alla medesima famiglia di elementi ripetuti, confermando che una stessa famiglia di retrotrasposoni può essere attivata in condizioni di stress differenti e in specie differenti (Grandbastien et al., 2005).
L’attivazione di elementi trasponibili può determinare profondi riarrangiamenti nel genoma se meccanismi di controllo messi in atto da parte delle piante non riescono a neutralizzare i loro trascritti (Lisch, 2009). In questo senso effetti genotossici come aberrazioni cromosomiche sono stati osservati in meristemi radicali di mais e Vicia narbonensis esposti a NP di TiO2 (Ruffini
Castiglione et al., 2011), ed è noto che l’attivazione di elementi trasponibili può causare riarrangiamenti cromosomici (Zhang et al., 2011).
6.CONCLUSIONI
In piante di pomodoro allevate in condizioni idroponiche con NP di TiO2 o Fe3O4 disperse
nella soluzione nutritiva, le NP sono in grado di ricoprire l’epidermide della radice formando aggregati nanostrutturati.
Entrambe le NP utilizzate inoltre sono in grado di essere assorbite attraverso le radici e possono essere traslocate alle parti aeree delle piante come nell’ipocotile. Anche se non sono state trovate NP nelle foglie di piante trattate, la verifica dell’avvenuto trasporto di NP attraverso le parti aeree di una pianta orticola, indica la possibilità di un potenziale rischio di contaminazione della catena alimentare.
NP di TiO2 (e non di Fe3O4) disperse nella soluzione nutritiva a relativamente alte
concentrazioni (500 mg/L) inducono una chiara risposta morfologica a livello degli apici radicali stimolando un’anormale proliferazione di peli radicali. Ancora non è chiaro se tale risposta sia dovuta a una perturbazione meccanica dovuta a deposizione esterna di NP sull’epidermide radicale, o sia dovuta all’assorbimento di NP all’interno della radice. Inoltre resta da capire perché solo NP di TiO2 (e non quelle di Fe3O4) sono in grado di determinare la risposta morfologica. Una
ipotesi è che la anormale proliferazione di peli radicali sia una risposta adattativa delle piante alla deposizione di NP sulla superficie degli apici radicali che ridurrebbe la capacità di assorbimento di minerali o ossigeno. In altri termini aumentando la crescita di peli radicali le piante aumenterebbero la superficie di assorbimento di nutrienti che era stata ridotta dalla deposizione esterna di NP.
In futuro si prevede di ripetere l’esperimento con NP di TiO2 e di misurare il contenuto
minerale delle plantule di pomodoro attraverso analisi di Assorbimento Atomico per verificare se il trattamento determini o meno carenze di assorbimento minerale. In questo senso sono previsti nuovi esperimenti in cui piante di pomodoro saranno sottoposte a carenza di specifici minerali o ossigeno per verificare se tali condizioni determinano una risposta morfologica analoga rispetto a quella causat da NP di TiO2.
Analisi molecolari della risposta di plantule di pomodoro trattate con NP di TiO2 sono state
preliminari condotte su 46 geni coinvolti nello sviluppo della radice e coinvolti nella risposta a differenti condizioni ambientali, hanno mostrato l’espressione differenziale di geni legati al differenziamento di peli radicali, all’azione di auxina ed etilene e all’omeostasi di metalli indicando che il trattamento effettuato con NP di TiO2 determina probabilmente alterazioni
nell’assorbimento o trasporto di metalli che portano alle alterazioni morfologiche osservate.
In futuro occorrerà allargare le analisi di espressione all’intero trascrittoma per meglio comprendere i meccanismi molecolari legati alla risposta di radici di pomodoro trattate con sospensioni di NP di TiO2, per esempio occorrerà valutare l’espressione differenziale di geni
codificanti enzimi antiossidanti che in uno studio recente sono risultati coinvolti nel primo meccanismo di difesa in risposta allo stress ossidativo causato dalle NP a livello cellulare (Kim et
al., 2012).
Infine attraverso le analisi trascrittomiche è stato possibile verificare che il trattamento con sospensioni di NP di TiO2 determina alterazioni dell’espressione di alcuni elementi trasponibili,
indicando che tali trattamenti possono produrre condizioni stressanti in grado di causare ripercussioni in termini di alterazioni della struttura del genoma. In futuro sarà importante verificare se nella progenie di piante trattate con NP si siano ereditate alterazioni del genoma in termini di inserzioni o delezioni di sequenze legate all’azione di elementi trasponibili (Grandbastien et al., 2005, Vukich et al.,, 2009).
Il lavoro di ricerca conferma quanto osservato in studi precedenti secondo cui alcune NP possono essere assorbite dalle radici e traslocate alle parti aeree e che l'efficienza di assorbimento e traslocazione sembra dipendere dalla specie vegetale, dalla modalità di somministrazione, dalle dosi e dalle caratteristiche delle NP (composizione chimica, dimensioni e proprietà di superficie). Trattamenti con NP possono influenzare la crescita e lo sviluppo delle piante, in particolare nel nostro lavoro è stato osservato che l'esposizione a NP può alterare alcuni processi fisiologici, influenzando la crescita e lo sviluppo degli apici radicali; inoltre tali trattamenti determinano profonde alterazioni dell’espressione genica, in alcuni casi riguardando sequenze trasponibili potenzialmente in grado di determinare riarrangiamenti nel genoma.