La localizzazione mitocondriale di FOXG1 e le alterazioni mitocondriali osservate nei pazienti affetti da Sindrome di Rett (Cornford et al., 1994; De Felice et al., 2012); (Eeg- Olofsson et al., 1990; Dotti et al., 1993)ci hanno indirizzato verso uno studio morfometrico di questi organuli nei modelli murini oggetto di questa tesi. La misurazione del numero e dell’area dei mitocondri nella corteccia del topo wt di controllo rispetto al topo FOXG1 +/-
, effettuata su immagini ottenute tramite microscopia elettronica (Figura 20, pannello A,B), non evidenzia differenze o alterazioni come mostrato dal grafico (Figura 22, pannello A,C). Dall’analisi statistica effettuata sul numero di mitocondri non si evidenzia una variabilità numerica statisticamente significativa (N° mitocondri/campo wt 6,37 ± 0,28 vs HT 5,95 ± 0,25) il p value 0,27. Inoltre su queste immagini sono state contate le sinapsi cellulari per valutare eventuali modificazioni di plasticità neuronale, sempre a livello corticale.
61 Figura 21: corteccia di topo Foxg1 +/- . (m: mitocondri; s: sinapsi).
Questo studio preliminare dà indicazione di un lieve aumento del numero di sinapsi nel mutante FOXG1 +/- rispetto al topo di controllo wt (Figura 22, pannello B). Numero di sinapsi/campo 2,15 ± 0,19 WT vs 2,75 ± 0,20 HT il p value 0,03. Il dato, seppur preliminare, mostrerebbe un aumento del numero di sinapsi nella forma FOXG1 +/- rispetto alla forma WT.
62 Figura 22: Analisi nel numero medio di sinapsi e mitocondri. A: numero di mitocondri per campo. B: numero di sinapsi per campo C: distribuzione di funzione delle aree dei mitocondri.
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Discussione
La sindrome di Rett (RTT) è un disordine del neurosviluppo che rappresenta una delle cause più comuni di ritardo mentale nelle bambine (1 su 10.000 bambine nate). Nella RTT classica le pazienti nascono apparentemente sane e il loro sviluppo nei primi 6-18 mesi di vita non presenta particolari difetti. Nei mesi successivi, lo sviluppo psicomotorio subisce un arresto e una progressiva regressione, fino alla perdita del linguaggio e della deambulazione. L’insorgenza di questa sindrome è correlata a singole mutazioni del gene
MeCP2, CDKL5 o FOXG1.
Quest’ultimo gene FOXG1 è un repressore trascrizionale, filogeneticamente conservato appartenente alla famiglia delle proteine con dominio forkhead ed è essenziale nello sviluppo encefalico, nella migrazione cellulare e nell’organizzazione della corteccia cerebrale. La relazione tra il gene FOXG1 e la sindrome di Rett è di recente scoperta e risale solo al 2008 (Ariani et al 2008). I quadri clinici dei pazienti affetti da sindrome di Rett con mutazione del gene FOXG1 sono molteplici, e apparentemente non sembrano avere una relazione lineare tra la tipologia della mutazione e la gravità della patologia.
Il progetto di ricerca a cui ho preso parte, ha come obiettivo indagare nel dettaglio la funzione di FOXG1 in relazione alla sindrome di Rett. Partendo dal presupposto che FOXG1 è un fattore di trascrizione, il dominio di legame al DNA è importante per svolgere il suo ruolo, se viene modificato potrebbero verificarsi alterazioni nei pathways in cui FOXG1 stesso è coinvolto. Pertanto è stata inizialmente studiata una delle mutazioni puntiformi di FOXG1 (R244C) localizzata appunto nel dominio di legame al DNA e osservata per la prima volta in un paziente affetto da RTT da le Guen (la Guen et al. 2010) valutando l’ affinità di FOXG1 per la cromatina tramite la metodica biofisica strip-FRAP. Per poter attuare quanto finora esposto è stato necessario creare una proteina di fusione in cui la porzione C-terminale di FOXG1 è legata ad una molecola di GFP, che permette di studiare la dinamicità della proteina stessa in vivo. Gli esperimenti eseguiti evidenziano una diminuzione di affinità per la cromatina e una diminuzione della stabilità del legame da parte di FOXG1 R244C-GFP, rispetto alla forma non mutata. Tuttavia, la diminuzione nell’ affinità di legame al DNA (per R244C), non rappresenta un indice di correlazione con la gravità del fenotipo dei pazienti RTT. Infatti si osserva ugualmente una diminuzione
64 dell’affinità per la cromatina in quei pazienti con fenotipo mite, in cui una mutazione nulla, altera completamente (Q46X) o in parte (Y400X) la struttura della proteina (De Filippis et al 2012). Possiamo dedurne che l’integrità della proteina è importante nel legame al DNA. Durante questo progetto di tesi è stato inoltre evidenziato, tramite microscopia confocale, che la proteina FOXG1 R244C-GFP è localizzata anche a livello mitocondriale, per cui è stato intrapreso uno studio morfologico e biochimico di questi organuli. L’idea di intraprendere questo studio è supportato dal fatto che i pazienti affetti da RTT mostrano alterazioni riconducibili al funzionamento dei mitocondri, come per esempio elevati livelli di acido piruvico o lattico, che potrebbero essere spiegati da un difetto nella catena respiratoria. Inoltre i pazienti con sindrome di RTT evidenziano sintomatologie (microcefalia, disabilità intellettuale) comuni a quelle dovute a patologie mitocondriali. Quindi ci siamo chiesti se le diverse mutazione di FOXG1 si riflettano in modo diverso sulla patologia, invece che in relazione al legame al DNA, proprio su questi compartimenti subcellulari.
Pertanto abbiamo eseguito analisi biochimiche (western blot) su campioni ottenuti da subfrazionamenti prima in vitro sulle cellule della linea cellulare HN9.10e e NIH3T3 e poi
ex vivo nei subfrazionamenti della corteccia cerebrale di modelli murini. Ciò che si è
osservato in vitro, è stato un processamento della proteina, messo in evidenza da bande immunoreattive non solo al peso molecolare atteso, cioè 58 kDa ma anche a pesi molecolari inferiori, in particolare si evidenziano bande a 45 e 25 kDa. Quest’ultima banda (25 kDa) si localizza sopratutto nei mitocondri. Successivamente è stato interessante valutare se il processamento riproduce una condizione fisiologica e quindi se si osserva anche ex vivo. Il risultato ha evidenziato la presenza della proteina nei mitocondri al peso di 25 kDa, solo allo stadio P1, cioè dopo che la proliferazione del neuroepitelio subisce un rallentamento; al contrario durante lo stadio embrionale E12, cioè durante quella finestra temporale in cui si va incontro all’evaginazione telencefalica e in cui è presente un elevato tasso di proliferazione neurogenica, FOXG1 si localizza nei mitocondri al peso molecolare di 58 kDa. Questa differenza nel processamento, in relazione allo sviluppo neurogenico suggerisce la possibilità di ruoli diversi di FOXG1 nei vari compartimenti subcellulari. È stato importante capire come FOXG1 si interfacci con i mitocondri e dove, nello specifico, si localizzi in questo organello. Per fare questo i mitocondri sono stati trattati con tripsina, o tripsina addizionata ad un detergente (SDS o Triton-X), per valutare quale
65 forma di FOXG1 fosse quella esposta all’azione proteolitica dell’enzima. Fintanto che i mitocondri rimangono intatti, solo la forma a 58 kDa viene degradata, suggerendo che le altre due (45 e 25 kDa) invece si trovino all’interno. Grazie alla collaborazione nata tra il laboratorio in cui ho svolto la tesi e il Mitochondrial Biology Unit (Medical Research Council, Cambridge, UK) del Prof. Aurelio Reyes e Prof. Massimo Zeviani, è stato possibile effettuare nei loro laboratori, esperimenti volti alla comprensione del trasporto della proteina nei mitocondri stessi. Per farlo, hanno sintetizzato e purificato una proteina marcata con 35S, incubata con estratti di mitocondri da fegati di ratto. Le soluzioni così preparate sono state trattate come prima con tripsina e triton-x, e poi anche con il disaccoppiante FCCP, osservando che in assenza del gradiente protonico nessuna forma proteica viene rivelata, la proteina è rimasta esposta alla tripsina e degradata. In conclusione possiamo dire che la forma a 58 kDa prende contatto con la membrana esterna mitocondriale, entra nei mitocondri sfruttando il potenziale di membrana e subito viene processata nelle forma a 45 e 25 kDa. La questione ad oggi, rimane ancora aperta su quale sia il ruolo che FOXG1 svolge nei mitocondri.
Per cercare di rispondere a questo interrogativo, uno dei primi aspetti da analizzare, riguarda la morfologia, la struttura o eventuali alterazioni nel numero dei mitocondri. Si sono confrontati campioni di corteccia provenienti da un topo wt e da un topo Foxg1 +/-. La stessa analisi è già stata condotta in topi affetti da sindrome di Rett, knock-out per MeCP2 (Kraucionis et al. 2006) che presentavano difetti mitocondriali. Allo stato attuale tuttavia, non si evidenziano differenze ne’ per il numero di mitocondri, ne’ nella distribuzione delle aree tra l’animale patologico e l’animale wt. I dati provenienti da studi preliminari, di cui è previsto un ampliamento del numero campionario, danno un esito negativo a questa indagine. Attualmente suggeriscono di dover ricercare il ruolo che ha FOXG1 nei mitocondri, in aspetti diversi da quelli strutturali.
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