I primi esperimenti di FRAP ( Fluorescence Recovery After Photobleaching) sono stati effettuati negli anni ’70 utilizzando fluorofori lipofilici o idrofilici (come la fluoresceina) per lo studio della mobilità delle proteine associate alla membrana cellulare. La popolarità di questa tecnica è poi aumentata notevolmente a seguito dell’isolamento delle proteine fluorescenti e dello sviluppo di tecniche quali il clonaggio e la mutagenesi. Parallelamente, lo sviluppo del microscopio confocale ha permesso di spostare questo tipo di indagine all’interno delle cellule viventi, per affrontare da un punto di vista quantitativo i problemi
39 della dinamica molecolare. In questo modo la misura di FRAP è diventata in breve il sistema d’elezione nello studio dei processi diffusivi cellulari.
Il fluoroforo GFP, usato anche in questa tesi, ha un’elevata resistenza all’inattivazione se stimolato con un impulso laser di bassa intensità: questa caratteristica consente, per esempio, di visualizzare una chimera di GFP espressa all’interno di una cellula per diverse ore, senza alterarne in modo sostanziale le proprietà di fluorescenza. In questo modo si può studiare, anche con alta risoluzione spaziale, la distribuzione di una proteina in cellule viventi. In un tipico esperimento di FRAP le molecole fluorescenti presenti in una regione definita della cellula vengono irraggiate con un laser ad alta intensità che ne inattiva i fluorofori causandone quindi il fotospegnimento (photobleaching)in maniera permanente. Si osserva poi il recupero nel tempo della fluorescenza nella regione irraggiata; essendo il photobleaching irreversibile, il recupero della fluorescenza deriva dal movimento delle molecole fluorescenti esterne verso la regione studiata. Rendendo invisibile una frazione dei fluorofori presenti, la misura di FRAP altera il segnale di fluorescenza all’interno di una cellula ma non interferisce con i processi biologici in cui la proteina di fusione è coinvolta e non crea gradienti di concentrazione. L’intensità e la frequenza dell’impulso laser utilizzato per il fotospegnimento dei fluorofori tipicamente non arrecano danni significativi all’ambiente cellulare: questa procedura è quindi compatibile con i limiti fisiologici di sopravvivenza delle cellule in coltura.
In conclusione la FRAP ci permette di valutare la motilità nei vari compartimenti cellulari di una qualsiasi proteina fusa con un fluoroforo. Da qui appare chiaro come questa tecnica riesca a fornici importanti dati sulla dinamicità all’interno della cellula vivente del legame fra Foxg1 e la cromatina.
Nella tecnica della FRAP la forma e la dimensione dell’area fotospenta varia in base alle informazioni che vogliamo ottenere. Nel nostro caso abbiamo scelto una variante della FRAP chiamata Strip FRAP. In questa metodica il fotospengimento è causato da un laser ad alta intensità che attraversa il nucleo lungo una linea (detta linea di bleaching), fotospengendo contemporaneamente sia l’eucromatina che l’eterocromatina che incontra. Successivamente, grazie al software che controlla il microscopio, il recupero di fluorescenza viene analizzato quantitativamente e viene calcolata la Frazione Immobile (IF) ovvero la frazione di fluorescenza non recuperata a causa della porzione di proteina legata stabilmente nella finestra temporale che analizziamo e il t1/2 ovvero il tempo
40 necessario per raggiungere la metà della fluorescenza finale. La IF è indice della quantità di proteina non interscambiabile e quindi della stabilità del complesso formatosi con il DNA, mentre il t1/2 è una misura della mobilità della proteina legata reversibilmente. In questa maniera sarà possibile valutare eventuali differenze di motilità sia in zone diverse della cromatina che tra cellule esprimenti proteine di fusione con mutanti patologici.
Sonde ottiche in cui Foxg1 era fuso all’ N-terminale con la Green Fluorescent Protein (GFP-Foxg1) sono state sviluppate recentemente (De Filippis et al., 2012) per valutare se mutanti patologici di FOXG1 riscontrati in alcune bambine Rett, presentavano una alterazione di affinità per la cromatina. Tuttavia, ad oggi nessuno ha valutato l’efficienza di
sonde ottiche in cui il fluoroforo è presente al C terminale di Foxg1 (Foxg1-GFP). La valutazione di tali sonde è stata un aspetto importante della mia tesi.
Figura 9: Grafico di recupero della fluorescenza nel tempo. Effettuando il fitting del recupero con una curva esponenziale è possibile stimare la frazione mobile ed immobile della proteina d’interesse e il tempo necessario per raggiungere la metà della fluorescenza finale detto t2.
Per la tecnica strip FRAP è stato utilizzato il microscopio confocale LEICA DM IRE2 nella configurazione invertita, con un obiettivo ad immersione ad olio 40X/1,25. Il microscopio è dotato di una cameretta chiusa, all’interno della quale viene adagiata l’apposita piastra WillCo mantenuta ad una temperatura di 37°C e al 5% di CO2.Il costrutto di fusione con la
GFP viene stimolato da un laser con lunghezza d’onda a 488 nm. L’acquisizione delle immagini tramite il Leica Confocal Software, con i seguenti parametri:
Pinhole: 600 µm2
Format: 512x512 pixel
41 Il prebleaching è la valutazione della la fluorescenza prima che il laser inattivi la GFP, in modo tale da poter sia normalizzare i valori che calcolare il recupero dello fluorescenza dopo lo spegnimento (post bleaching).
prebleaching bleaching postbleaching
N° lines 64 64 12000
ΔT (sec) 0,0025 0,0025 0,0025 Tempo tot (sec) 0,16 0,16 30
Laser (Hz) 400 Al massimo 400
Tabella 6: Parametri utilizzati per tecnica strip FRAP.
L’acquisizione dei dati è finalizzata all’analisi quantitativa con il software Origin 8, con il software Leica ,che controlla il microscopio confocale utilizzato in questo progetto, si sono selezionate sia la linea lungo cui effettuare il fotospegnimento che le regioni di interesse (ROI): la ROI1 attraversa il nucleo della cellula in oggetto e la ROI2 che attraversa una porzione vuota del campo (background). La fluorescenza nelle ROI è stata valutata prima del fotospegnimento (64 acquisizioni, tempo totale 0,16 sec.) durante lo stesso (64 acquisizioni, per un tempo totale 0,16 sec.) e dopo il fotospegnimento (12000 acquisizioni, per un tempo totale 30 sec.)(Tabella 6: Parametri utilizzati per tecnica strip FRAP. e Figura 10)
42 Figura 10: Tecnica del photobleaching. Un esempio di immagine FRAP in cui è mostrato il nucleo di una cellula rappresentativa che esprime Foxg1-GFP. A) sono state selezionate due regioni: in verde la ROI 1 (region of interest 1), che comprende il nucleo e in blu la ROI2 da cui si estrapolano i dati del background. B) il nucleo della cellula dopo il photobleaching. Si osserva come la regione colpita dal fascio laser ad alta intensità riduca la sua fluorescenza.
I dati provenienti dalla ROI1 devono:
1. essere corretti secondo il background sottraendo, per ciascuna acquisizione, il valore di fluorescenza registrato nella ROI contenente il nucleo (ROI1) a quello registrato nella ROI contenente il background (ROI2);
2. essere normalizzati sulla corrispondente base line, dividendo ciascun valore registrato nella ROI1 dopo il photobleaching (e corretto sottraendogli il background) per la media dei valori di fluorescenza (corretti per il background) registrati nella ROI1 prima del photobleaching;
3. essere corretti per il photobleaching dovuto alle acquisizioni: in ogni acquisizione, infatti, la cellula subisce un lieve fotospegnimento dovuto al laser che effettua la scansione. Per tenere conto di questo si valuta la fluorescenza media (corretta per il background) di tutta la cellula prima del bleaching (Fluo(t0)-backg(t0)) e quella dopo il bleaching alla fine dell’esperimento (Fluo(tfin)-backg(tfin)); i valori ottenuti grazie ai calcoli precedenti per la ROI1 vengono moltiplicati per un coefficiente così ottenuto: [𝐹𝑙𝑢𝑜(𝑡0)−𝐵𝑎𝑐𝑘𝑔(𝑡0)]
[𝐹𝑙𝑢𝑜(𝑡𝑓𝑖𝑛)−𝐵𝑎𝑐𝑘𝑔(𝑡𝑓𝑖𝑛)] .
Le curve del recupero vengono fittate usando una doppia funzione esponenziale da cui si andrà ad estrapolare:
la frazione immobile (I.F) : la percentuale di proteine che rimanendo adese al proprio promotore, hanno impedito un recupero totale della fluorescenza
43 dove Y0 : asintoto a cui tende il grafico
il t/2 : tempo impiegato a raggiungere il 50% della fluorescenza.