Analisi proteica dei trasformati primari

4.11.1 Estrazione di proteine totali da semi GAA e GCasi

I semi di riso trasformati sono stati sottoposti a sbramatura e, quando desiderato, a sbiancatura meccanica con apposita sbiancatrice Hercules (Baragioli, Vercelli).

Per la quantificazione del contenuto di enzima ricombinante nell’endosperma tramite analisi DAS-ELISA, le proteine totali sono state estratte da semi non sbiancati.

Per ottenere estratti di proteine totali da saggiare mediante DAS-ELISA è stato messo a punto un protocollo di estrazione che ha previsto le seguenti fasi:

 Raccolta di 1-2 pannocchie mature da ciascun individuo.

 Essiccazione delle pannocchie in locale asciutto e areato per circa 3 giorni fino al raggiungimento di una umidità relativa del seme pari al 14%.

 Campionatura casuale di 40 semi per ciascuna linea.

 Sbramatura dei semi con sbramino manuale da tavolo per riso.

 Macinazione del campione con mulino a sfere Retsch MM2 alla velocità 30 per 2 minuti nel caso di seme non sbiancato; 20 per 2 minuti nel caso di riso sbiancato.

 Prelievo di 70 mg della farina ottenuta.

 Omogeneizzazione in mortaio della farina con 1 mL di opportuno tampone di estrazione scelto in funzione della proteina di interesse da saggiare.

 Successiva diluizione con ulteriori 7 mL del medesimo tampone.  Incubazione in agitazione continua secondo le seguenti condizioni:

o 4°C per 1 h nel caso di estratti GCasi o 15 minuti a RT per i campioni GAA

82  Recupero della fase liquida contenente le proteine e conservazione a

-20°C.

I tamponi di estrazione sono stati i seguenti:

 Tris-HCl 50 mM, NaCl 0.5 M pH=7,0 per l’estrazione di proteine totali da semi GCasi

 Idrogenofosfato disodico 250 mM + NaCl 250 mM pH=7,4 per l’estrazione di proteine totali da campioni GAA.

4.11.2 Saggio immunoenzimatico (DAS-ELISA)

Il saggio DAS-ELISA si basa su un doppio riconoscimento immunologico. Un anticorpo specifico per la proteina che si vuole rilevare, chiamato capturing, viene ancorato al fondo dei pozzetti di una piastra di polistirene (reazione di coating). Terminata la reazione di coating, ciascun pozzetto viene messo a contatto con una soluzione di BSA per saturare la residua capacità legante del polistirene (blocking). Dopo una serie di lavaggi, i campioni che si suppongono contenere la proteina di interesse vengono seminati nei pozzetti. Dopo successivi lavaggi, un secondo anticorpo, specifico per la proteina di interesse, coniugato a un enzima in grado di catalizzare una reazione che permette di rilevare la presenza della proteina, viene dispensato in tutti pozzetti. Dopo i lavaggi, il complesso

capturing-proteina-coniugato viene rilevato tramite contatto con una

soluzione contenente un adeguato substrato cromogenico, come ad es. il 3,3´,5,5´-tetramethylbenzidine (TMB).

L’anticorpo di capturing è stato prodotto dalla purificazione su proteina A dell’antisiero di coniglio anti-Myozyme® o dalla purificazione per affinità dell’antisiero di coniglio anti-Cerezyme® a seconda che la proteina di interesse da rilevare fosse rispettivamente GAA o GCasi. Entrambi gli anticorpi sono stati prodotti dalla ditta Davids Biotechnologie.

L’anticorpo policlonale anti-GCasi o anti-GAA coniugato alla perossidasi di rafano (HRP) è stato pure fornito dalla ditta Davids Biotechnologie.

83  Coating: vengono dispensati in ciascun pozzetto 100 μL di PBS diluito 1:5, sodio azide 0,01% + anti-Myozyme® o anti-Cerezyme® purificato a una concentrazione finale rispettivamente di circa 4 ng/μL e 2 ng/ μL. La piastra è incubata O/N a 4°C.

 Blocking: vengono dispensati in ciascun pozzetto 300 μL PBS + BSA 2,5% + sodio azide 0.01% e ivi mantenuti per almeno 20 minuti a RT prima di procedere al passaggio successivo.

 I campioni (estratti proteici grezzi contenenti GAA o GCasi) sono opportunamente diluiti in tampone di diluizione (PBS + Tween20 0,1% + BSA 1%). Una volta diluiti, i campioni sono seminati nel volume di 50 μL nei pozzetti e incubati per 30 min a 37°C in agitazione.

 Dopo successivi lavaggi, l’anticorpo anti-Myozyme^® o anti-Cerezyme®

coniugato a HRP viene opportunamente diluito in tampone di diluizione (stesso tampone utilizzato per i campioni) e seminato (50 μL) nei pozzetti. Dopo 30 minuti di incubazione a 37°C in agitazione, si procede con i lavaggi e con la rilevazione del segnale.

 Sviluppo del segnale: si impiega il substrato TMB, tetrametilbenzidina (Ultra-TMB, Pierce oppure SureBlue, Kpl) (100 μL per pozzetto) bloccando la reazione con 100 μL HCl 1 M, dopo circa 5 min di incubazione. L’assorbanza viene misurata a 450 nm utilizzando il lettore di piastra Modulus II (Promega) oppure Tecan.

Per calcolare la concentrazione della proteina di interesse nei campioni, in ciascun saggio è stata costruita una curva di taratura con concentrazioni note di Myozyme® o Cerezyme®.

Per l’elaborazione dei dati si è proceduto all’immissione dei valori di assorbanza nel software Curve Fitting Data Analysis (Promega) e all’assegnazione dei valori di concentrazione nota degli standard. I valori di concentrazione dei campioni ottenuti come output del software utilizzando una curva lineare a quattro parametri sono stati successivamente elaborati considerando il fattore di diluizione adottato al fine di ottenere le concentrazioni reali degli estratti.

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4.11.3 Validazione del saggio DAS-ELISA

Allo scopo di verificare la validità del metodo DAS-ELISA in termini di specificità e selettività , sia per GAA sia per GCasi, sono stati allestiti tre distinti test ELISA, ciascuno con il medesimo estratto proteico saggiato a tre diverse diluzioni. A ciascuna diluizione è stato successivamente aggiunto lo standard alla concentrazione nota di 0.8 ng/μL (Myozyme o Cerezyme a seconda che la molecola da quantificare fosse α- o β-glucosidasi). Il metodo DAS-ELISA è stato validato quando i risultati relativi ai campioni con aggiunta dello standard sono ricaduti all’interno dell’intervallo di validità stabilito, corrispondente a +/- 15% del valore atteso.

4.11.4 Determinazione del livello di espressione del gene reporter

Il livello di espressione del gene reporter è stato determinato mediante analisi di un campione costituito dal prodotto di macinazione di 40 semi T₂ prelevati da ciascun trasformato primario (T₁). Nel primo ciclo sperimentale il numero di piante saggiate è stato volutamente limitato a venti individui PCR-positivi, scelti a caso. Nelle altre due sessioni è stato misurato il livello di espressione di tutti gli individui PCR-positivi, che avessero dato almeno 40 semi. Ne deriva che le popolazioni saggiate sono numericamente diverse da promotore a promotore. Gli estratti relativi a ciascun trasformato primario sono stati diluiti 1:10 nel caso del reporter GAA e 1:5 nel caso di GCasi. Con questo rapporto di diluizione il segnale ELISA è sempre caduto entro l’intervallo di affidabilità del saggio. Quasi tutte le piante trasformate hanno dato un livello espressione rilevabile di proteina reporter.

4.12 Analisi di tessuto-specificità e profilo