Perdite dopo sbiancatura
5.7.18 Quantificazione in ELISA di GCasi nei prodotti di sbiancatura
Tabella 43. Distribuzione di GCasi nelle varie frazioni provenienti dal processo di sbiancatura. sgl=seme sbramato; sb= seme sbiancato; far=farinaccio (residuo di sbiancatura).
Promotore Fraz. µg/mL g tex µg GCasi %
C-Glb sgl
0,17 8,4 17,42
sb0,20 7,0 17,30 1%
far0,02 1,27 0,28 2%
GluC sgl0,10 8,18 10,38
sb0,11 6,8 9,16 12%
far0,02 1,34 0,32 3%
C-B4 sgl0,33 8,57 35,17
sb0,27 7,4 25,39 28%
far0,05 1,12 0,73 2%
Glb-B4 sgl0,33 8,36 34,03
sb0,35 7,0 30,99 9%
far0,06 1,23 0,89 3%
P16-Glb sgl0,13 8,93 14,94
sb0,16 7,5 15,24 0%
far0,07 1,18 1,07 7%
Glb sgl0,24 7,72 23,25
sb0,22 6,5 17,79 24%
far0,10 1,14 1,37 6%
C-Glb-B4 sgl0,19 8,34 19,41
sb0,21 6,7 17,98 7%
far0,10 1,25 1,57 8%
B1-Glb sgl0,09 7,72 9,15
sb0,12 6,6 10,02 0%
far0,03 1,13 0,47 5%
B1-B4 sgl0,13 7,23 11,90
sb0,12 5,9 9,16 23%
far0,09 1,23 1,39 12%
GluB4 sgl0,26 7,63 24,61
sb0,23 6,3 18,00 27%
far0,12 1,21 1,75 7%
163
6 DISCUSSIONE
In questa tesi sono stati presi in considerazione gli elementi che concorrono alla creazione di un sistema integrato di sviluppo di un promotore sintetico con profilo di espressione specifico per l’endosperma di riso. In particolare, sono stati approfonditi sia gli aspetti riguardanti il flusso di attività necessarie alla costruzione e alla valutazione delle prestazioni di nuovi candidati sintetici, sia quelli più specificatamente legati all’attività di progettazione.
I promotori endosperma-specifici inducono l’espressione di una classe di proteine, in genere proteine di riserva, la cui sintesi avviene in maniera circoscritta nello spazio e nel tempo. La pianta sintetizza queste proteine solo nell’endosperma, durante la maturazione del seme. L’interesse nei confronti dei promotori di questa classe di proteine è dovuto alla loro applicabilità per l’espressione efficiente e circoscritta al seme di proteine eterologhe.
Il mercato biofarmaceutico è in continua espansione e l’industria sta ricercando nuove piattaforme produttive che superino i limiti dei sistemi batterici e allo stesso tempo abbattano i costi dei sistemi di espressione animali. Una piattaforma basata sull’espressione stabile in pianta, seppur promettente in linea di principio, ha finora dimostrato alcuni limiti dovuti alla bassa resa di proteina ricombinante sulla biomassa. Con l’uso di promotori seme-specifici, negli ultimi 10 anni il problema delle basse rese è stato notevolmente attenuato. Non solo il seme è un organo naturalmente deputato all’accumulo di proteine, ma i promotori che inducono l’espressione in questo tessuto hanno permesso di raggiungere livelli promettenti di produzione di proteine ricombinanti. L’espressione nell’endosperma ha poi dimostrato di essere un ottimo modo per aggirare problemi dovuti alla fitotossicità della proteina eterologa nei confronti dell’organismo ospite (Patti et al., 2012).
Il riso è fra le specie più promettenti per applicazioni biotecnologiche. La scelta di sviluppare una strategia di sintesi nell’endosperma di riso è motivata da diverse caratteristiche favorevoli riguardanti la pianta nel suo
164 complesso e il possibile sito di accumulo. In effetti, il riso presenta indubbi vantaggi a livello agronomico ma anche aspetti favorevoli legati a fattori di tipo genetico-molecolare; tra i primi vi sono: la brevità del ciclo biologico (140-170 gg), un sistema di unioni essenzialmente fondato sulla cleistogamia, elevate rese per ettaro (7 t/ha), una tecnica colturale semplice e scarsamente bisognosa di manodopera, considerato che molte operazioni agronomiche sono meccanizzabili. Tra i vantaggi legati alla possibilità di ingegnerizzarlo geneticamente vi sono: la disponibilità di efficienti protocolli di trasformazione, un genoma completamente sequenziato, l’esistenza di un parco varietale ampio comprendente varietà adatte alla sola utilizzazione industriale e dotate di marcatori genetici legati alla cariosside. Inoltre, a differenza di altre specie vegetali come ad es. il tabacco, il seme di riso può essere processato in modo da separare le componenti metabolicamente attive del seme, quali l’embrione, da quelle inerti, come l’endosperma. Tale aspetto risulta fondamentale nella produzione di proteine eterologhe fitotossiche; le proteine di interesse possono infatti essere accumulate in modo specifico nell’endosperma evitando possibili interferenze con il metabolismo della pianta e, in particolare, dell’embrione. Inoltre, nell’endosperma le proteine ritrovano un ambiente naturalmente predisposto al loro accumulo e a quello delle sostanze di riserva in una biomassa altamente conservabile e ricca di compartimenti subcellulari (Takaiwa et al., 2007). In questo senso numerosi sforzi sono attualmente rivolti ad aumentare il livello di espressione di transgeni in endosperma di riso.
Qualunque sia la specie o il tessuto, i due principali fattori che influenzano l’accumulo di una proteina sono la velocità di sintesi e la velocità di degradazione. La velocità di sintesi è prevalentemente influenzata dalla velocità di trascrizione. Il rateo di trascrizione è fortemente determinato dall’efficienza del promotore. Questi presupposti fanno capire quanto sia importante la scelta del promotore nella creazione di una piattaforma tecnologica basata su piante transgeniche. I promotori più utilizzati in passato per l’espressione di proteine eterologhe in endosperma di riso sono quello della glutelina A2 e quello della globulina 26kDa (Yang et
165 l’attività di dottorato, si è invece puntato sul promotore del gene codificante la glutelina B4 in quanto esso induce l’espressione unicamente nell’endosperma interno, e a un livello superiore a quello raggiunto dagli altri promotori seme-specifici (Qu e Takaiwa, 2004). Allo stato dell’arte il promotore GluB4 sembra cioè essere la scelta migliore per l’espressione di una proteina eterologa in endosperma, ma l’ottenimento di rese ancora più elevate renderebbe il sistema riso definitivamente competitivo nei confronti delle più consolidate strategie di produzione attualmente in uso a livello industriale. E’ in questo contesto che si inserisce il progetto a cui fa capo questo dottorato. Poiché non risultano disponibili sequenze di promotori naturali atte ad aumentare ulteriormente il livello di trascrizione di transgeni, si è deciso di ricorrere allo sviluppo di sequenze artificiali, con lo scopo di superare le prestazioni offerte dagli analoghi naturali.
L’intento di progettare un promotore che funzioni meglio di promotori analoghi naturali è piuttosto ambizioso e comporta la necessità di comprendere, per lo meno a grandi linee, i meccanismi che sottendono la regolazione dell’espressione genica. Per comprendere il meccanismo che regola l’espressione delle proteine di riserva del seme, vari autori si sono impegnati nell’individuazione di motivi altamente conservati in diversi promotori seme-specifici. Gli elementi regolatori putativi sono stati verificati mediante mutazioni puntiformi, delezioni (loss-of-function) o utilizzo di questi elementi in promotori sintetici (gain-of-function) (Wu et al., 1998; Washida et al., 1999; Wu et al., 2000; Hwang et al., 2001). Sono stati individuati 4 motivi responsabili dell’espressione specifica in endosperma: GCN4, AACA, AAAG e ACGT. Il motivo GCN4 appare un elemento chiave di regolazione nel promotore GluB1. Il motivo ACGT è diffuso in numerosi promotori di proteine di riserva del seme ma anche in molti promotori di geni che mediano alla varie risposte, come stimoli luminosi, fito-ormoni e vari stress biotici e abiotici (Izawa et al., 1993). E’ stato appurato che l’attivazione specifica per l’endosperma sia dovuta al contesto in cui ACGT è inserito (Nakase et al., 1997). Il motivo AACA è un elemento regolatore negativo al di fuori del seme, ma nel seme agisce in combinazione con GCN4 per dirigere l’espressione specifica nell’endosperma (Takaiwa et al., 1996, Yoshihara e Takaiwa, 1996). Il motivo AAAG, detto anche
Prolamin-166
box, è un elemento molto diffuso nei promotori delle proteine di riserva.
Spesso una copia di questo elemento si trova a breve distanza da GCN4, con cui ha un’azione sinergica (Yamamoto et al., 2006).
Il meccanismo di attivazione dei promotori seme-specifici è stato meglio compreso caratterizzando i fattori di trascrizione responsabili dell’espressione delle proteine di riserva nel seme. Il cDNA di un fattore di trascrizione, inserito in un vettore di espressione, consente di eseguire gli esperimenti utili a determinare quali sono i motivi riconosciuti all’interno di un promotore, qual è la sequenza necessaria al riconoscimento, quali elementi cis-regolatori e quali promotori il fattore è in grado di attivare in coltura di protoplasti e infine qual è l’azione combinata di due fattori di trascrizione (Suzuki et al., 1998; Onodera et al., 2001; Yamamoto et al., 2006).