179 Quasi tutti i parametri hanno mostrato una deviazione percentuale inferiore al 15%. Gli unici valori che eccedono questo limite sono quelli che si riferiscono al massimo e alla media del primo quartile nelle due popolazioni ottenute con B1-B4, fatto in parte prevedibile considerata l’ampiezza molto diversa delle due popolazioni. E’ comunque interessante notare che il livello medio di espressione si è mantenuto su valori paragonabili sebbene le due trasformazioni abbiano presentato tra loro differenze radicali in termini di numero di piante, produttività di seme e stato generale degli individui. Inoltre, nonostante il valore medio di espressione ottenuto per B1-B4 sia salito da 3,8 a 4,6 µg/g dalla prima alla seconda trasformazione, tale promotore ha confermato i suoi limiti. Ciò dimostra che il metodo di valutazione è sufficientemente solido da non essere influenzato da variabili esterne. In altre parole, questi dati consentono di validare il metodo di valutazione dei promotori utilizzato in questo lavoro.
6.5 Tessuto-specificità
Qualunque modifica alla sequenza di un promotore tessuto-specifico potrebbe, almeno in linea di principio, modificarne le caratteristiche di specificità. Nell’assemblare parti di diversi promotori endosperma-specifici è possibile che nella sequenza ottenuta manchino gli elementi responsabili della specificità. Questi elementi non sono noti con certezza, anche se l’ipotesi più accreditata è che la regolazione dell’espressione sia soprattutto positiva (Wu et al., 1998; Wu et al., 2000); infatti, l’unico elemento che appare coinvolto nella soppressione dell’espressione al di fuori dell’endosperma è AACA (Suzuki et al., 1998).
La proteina reporter utilizzata in questo lavoro è la beta-glucosidasi umana, un enzima lisosomiale che degrada i glucocerebrosidi che compongono il distrato lipidico della membrana cellulare. Questo enzima, se espresso nel tessuto vegetativo, mostra un chiaro effetto fitotossico; qualora espresso oltre un certo limite nel seme di tabacco, ha inoltre dimostrato di inibire la germinazione in modo irreversibile (Reggi et al., 2005). L’uso di GCasi come reporter per saggiare l’attività di promotori sintetici ha avuto proprio lo scopo di evidenziare eventuali perdite di
180 specificità. Giacché per tutti i promotori è stato possibile ottenere una popolazione di piante mature e per tutte le popolazioni analizzare la progenie di un congruo numero d’individui, è ragionevole concludere che nessuno dei promotori saggiati abbia indotto elevati livelli di espressione in tessuti diversi dall’endosperma. Ciò nonostante, il fatto che la produttività di seme non sia stata omogenea fra i vari promotori ha indotto a condurre ulteriori indagini con lo scopo di verificare se quanto rilevato fosse correlato a un effetto fitotossico.
L’osservazione di eventuali effetti fitotossici sui trasformati primari è resa complicata dal fatto che queste piante, anche in assenza di un effetto specifico, dimostrano spesso un fenotipo alterato e un rallentamento dello sviluppo, dovuti allo stress subito in fase di rigenerazione e di selezione in
vitro.
Le piante ottenute dalla trasformazione di febbraio 2012, coltivate in serra nel periodo che va da giugno a ottobre, non hanno manifestato alcun problema di produttività di seme a differenza di quelle ottenute dalla trasformazione di novembre 2011, le quali sono state coltivate in serra fra febbraio e giugno. Dal momento che alcune trasformazioni erano state replicate a febbraio 2012, è stato possibile un confronto diretto tra popolazioni di piante diversamente allevate. Le piante trasformate con il medesimo costrutto hanno spesso mostrato comportamenti contrastanti al variare delle condizioni di crescita, dimostrando che il costrutto non è l’elemento principalmente implicato nella ridotta capacità di produrre seme. A titolo di es. le piante trasformate con B1-B4 hanno prodotto una quantità sufficiente di semi nel 42% e 93% dei casi, se allevate nel periodo vernino-primaverile e primaverile-estivo, rispettivamente. Vale la pena ricordare che il secondo dato supera quello registrato per piante trasformate con i promotori naturali GluC e GluB4 (88% e 84%, rispettivamente). Queste evidenze hanno portato a concludere che la sola osservazione della produttività di seme non è sufficiente a stabilire un nesso causale fra la ridotta produttività e l’azione fitotossica di GCasi. Inoltre, all’interno della popolazione trasformata con C-Glb-B4 è stata valutata la correlazione fra livello di espressione in endosperma e produttività di seme. Assumendo che
181 siano proprio i migliori espressori a soffrire maggiormente dell’attività fitotossica della proteina reporter, sarebbe attesa una relazione di proporzionalità inversa fra contenuto di GCasi in seme e quantità di seme prodotto e ciò secondo una funzione iperbolica.
Grafico 11. La produttività di GCasi e di seme in piante appartenenti alla popolazione trasformata con il promotore C-Glb-B4.
La semplice osservazione del grafico 11 porta immediatamente a escludere che vi sia una stretta relazione tra livello di espressione e stato di sofferenza delle piante.
Per evidenziare un’eventuale minima espressione del transgene al di fuori dell’endosperma è stato deciso di procedere alla quantificazione della proteina reporter nel tessuto fogliare. In media la concentrazione di GCasi rilevata negli estratti di foglie di piante C-Glb-B4 è risultata 15 volte più elevata di quella rilevata in B1-B4. Va tuttavia osservato che in termini assoluti si tratta di un contenuto residuale di GCasi, tant’è vero che il valore è stato espresso in ppm sulla proteina totale estratta.
Per verificare se la concentrazione di GCasi rilevata in foglia è correlata alla concentrazione di GCasi in endosperma, e quindi sussiste effettivamente una perdita di tessuto-specificità del promotore, sono state analizzate singole piante C-Glb-B4. E’ ragionevole ritenere che, in caso di perdita di tessuto-specificità, i migliori espressori evidenzino un maggiore
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 Gr am m i d i se m e