L’analisi quantitativa cromatografica è basata sulla misura delle aree dei picchi, dal momento che esiste proporzionalità diretta tra la misura effettuata e la concentrazione che la determina (almeno in certi range).
Sono metodi comparativi cioè basati sulla relazione matematica tra il parametro misurato (risposta o segnale) e la concentrazione dell’analita.
Quindi richiedono la calibrazione mediante soluzioni standard.
Dopo opportuna elaborazione delle aree, si risale alla concentrazione percentuale dei componenti.
Il calcolo dell’area del picco viene fatta direttamente dal computer e viene stampata sul cromatogramma.
Alla base comunque ci sono delle regole per mezzo delle quali è possibile risalire alle aree dei picchi.
Necessità di determinare quantitativamente tutti i componenti di una miscela o solo alcuni o al limite uno solo (necessità quindi di avere risolti tutti i picchi, solo alcuni, uno solo).
massa picco massa 1 cm2 area picco Ritagliare il picco e pesarlo, confrontandolo con il peso di 1 cm2 della stessa carta. -Metodo laborioso -Precisione Metodi geometrici -Gaussiana -Triangolazioni Importante è la pulizia del picco (simmetria e mancanza di sovrapposizioni)
Si applica il metodo della gaussiana calcolando l’ampiezza del picco a metà altezza e considerando i due picchi come separati.
In questo caso l’ampiezza a metà altezza è ricavabile dalle semi-ampiezze.
L’integrazione elettronica ricostruisce la funzione matematica del picco maggiore, ne calcola l’area e la sottrae all’area totale (area del picco minore)
I metodi per la calibrazione possono essere divisi in due gruppi:
Uso di Standard Esterni (analizzati separatamente dal campione).
Uso di Standard Addizionati ad ogni campione (Standard Interni o aggiunti).
Standard esterni
Una serie di standard di questo tipo è costituita da unità che contengono quantità note e differenti di analita.
Si inietta un volume noto e preciso del campione e si registra il cromatogramma; poi, si prepara una soluzione a concentrazione nota del componente da determinare e si inietta lo stesso volume, registrando il cromatogramma.
-E’ importante fare in modo che le concentrazioni comparate (campione e standard) non differiscano troppo tra loro.
-Occorre una grande accuratezza e riproducibilità nel misurare il volume da iniettare.
-Iniezioni ripetute, sia del campione che dello standard, e poi fare
una media delle aree
-Le iniezioni vanno effettuate in un intervallo di tempo piuttosto
breve per evitare le deviazioni dovute a variazioni ambientali o strumentali.
Costruzione di rette di taratura o calibrazione
Si preparano diverse soluzioni (da 3 a 5) a concentrazioni note e crescenti dell’analita e si riportano su un grafico A/[] i valori letti sul cromatogramma; si dovrebbe ottenere una retta passante per lo zero (se ci sono deviazioni significative allora si aumenta il numero delle soluzioni standard).
Si inietta la soluzione campione e si registra il valore dell’area. Si interpola la concentrazione incognita del campione.
Le soluzioni standard devono simulare al meglio la matrice del campione, e quindi devono contenere tutti i reattivi (e nelle stesse concentrazioni) contenuti nella soluzione campione. Questo comporta ricontrollare le rette di taratura ogni volta che le soluzioni dei reattivi vengono preparate di fresco.
-Conoscenza della matrice
Standard aggiunti
Anche in questo caso possiamo distinguere due metodiche:
Metodo delle aggiunte standard o multiple
Consiste nel preparare soluzioni dell’analita contenenti volumi noti e crescenti di soluzione standard della stessa specie da analizzare. Vi sono diversi modi per attuare il metodo delle aggiunte:
a) Introdurre una certa quantità di soluzione incognita in più matracci (3-4), aggiungere in ogni matraccio volumi diversi di soluzione standard (a concentrazione da 10 a 100 volte maggiore) e poi portare a volume con la soluzione incognita. Quindi di riportano in un grafico A/[] i valori ottenuti dalle diverse soluzioni.
1 2 3 4
1 mL 2 mL 3 mL 4 mL
C agg A A0 A4 A3 A2 A1 C eff C1 C2 C3 C4 0 Cx 0 C1+Cx C2+Cx C3+Cx C4+Cx Y = mx Y = mx + q Cx sarà data dall’intercetta sull’asse delle x (differenza tra i due zeri) cambiata di segno e sarà inferiore rispetto alle concentrazioni degli standard.
In realtà il metodo, rapido e pratico, non è del tutto rigoroso, perché il contenuto di analita varia leggermente all’interno delle diverse soluzioni così come la concentrazione finale dello standard aggiunto.
Es. nel matraccio 1 abbiamo miscelato 99 mL a concentrazione Cx e 1 mL a concentrazione ad es 1000 ppm, mentre matraccio 4 abbiamo miscelato 96 mL a concentrazione Cx e 4 mL a concentrazione 1000 ppm. Quindi gli incrementi effettivi differiscono leggermente.
Infatti ammettendo che
Cx = 20 ppm e che 1 ppm = 1 mg/L = 1 g/mL allora Cx = 20 g/mL Quantità dell’analita X nei diversi matracci:
-20 g/mL . 99 mL = 1980 g = 1,98 mg -20 g/mL . 98 mL = 1960 g = 1,96 mg -20 g/mL . 97 mL = 1940 g = 1,94 mg -20 g/mL . 96 mL = 1920 g = 1,92 mg
Quantità dello standard aggiunto nei diversi matracci: 1000 g/mL . 1 mL = 1000 mg = 1,00 mg
1000 g/mL . 2 mL = 2000 mg = 2,00 mg 1000 g/mL . 3 mL = 3000 mg = 3,00 mg 1000 g/mL . 4 mL = 4000 mg = 4,00 mg
L’incremento in termini di massa ad es per il matraccio 1 è pari a 1 mg, ma in termini di concentrazione sarà:
(1,98+1,00) (mg)
(100) (mL) (1000) (mL/L) = 29,8 (mg/L o ppm) 29,8-20,0 = 9,8 ppm e non 10 ppm (1,00) (mL) 1000 (mg/L)
(100) (mL)
= 10,0 (mg/L o ppm)
Lo stesso ragionamento può essere applicato ad es al matraccio 4, il cui incremento in termini di concentrazione sarà:
(1,92+4,00) (mg)
(100) (mL) (1000) (mL/L) = 59,2 (mg/L o ppm) 59,2-20,0 = 39,2 ppm e non 40 ppm
Possiamo però calcolare lo scarto % e vedere che per ogni matraccio rimane costante: 9,8-10 10 100 = -2,0 % 39,2-40 40 100 = -2,0 % Matraccio 1 Matraccio 4
b) Per evitare l’approssimazione del metodo precedente, si può aggiungere in ogni matraccio un volume noto ed esatto Vx della soluzione dell’analita a concentrazione incognita Cx e aliquote (in mL) di soluzione standard crescenti indicate con n1, n2, n3, ecc…; alla fine si porta al volume finale Vt (ad es. 100 mL) con un solvente opportuno.
n1 + Vx n2 + Vx n3 + Vx n4 + Vx A = K Cni con K = b
Cni = concentrazione data dal campione e da un’aggiunta iesima dello standard.
A = K Vx Cx Vt ni Cs Vt + A A0 A4 A3 A2 A1 n1 n2 n3 n4 A = 0 A = K Cs Vt + ni VxCx Vt K Y = mx + q 0 = K Cs Vt + VxCx Vt K nx nX Cx = Vx Cs (-nx)
Metodo delle aggiunte standard Vantaggi e Svantaggi
Permette di effettuare l’analisi quantitativa in matrici complesse o incognite
Si può applicare a tutte le tecniche analitiche sia spettrofotometriche, elettrochimiche e cromatografiche E’ necessario un a curva di calibrazione per ogni analita da determinare
E’ necessario un volume maggiore rispetto a quello impiegato con la retta di taratura con standard esterno
E’ un metodo per estrapolazione, teoricamente meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di taratura con standard esterno
N.B.
Prima di effettuare la curva di taratura o di applicare il metodo delle aggiunte è necessario analizzare il bianco.
Il bianco ideale è costituito dalla soluzione conteente tutti i componenti il campione ad eccezione dell’analita stesso.
In questo modo si può ottenere il segnale relativo ad una “concentrazione zero” dell’analita.
E’ un metodo per estrapolazione, teoricamente meno preciso rispetto al metodo di interpolazione della retta di taratura con standard esterno
Metodo dello standard interno
Questo metodo viene usato prevalentemente in cromatografia. Consiste nel preparare una serie di soluzioni standard contenenti concentrazioni note e variabili dell’analita e le stesse quantità di un’altra sostanza (standard interno). Si costruisce una curva di calibrazione riportando in ascisse il rapporto ponderale o di concentrazione dell’analita e dello standard (Pa/Pis o [X]/[IS]) e in ordinate il rapporto delle aree (Aa/AIS).
Quindi si aggiunge la stessa quantità di standard interno alla soluzione a concentrazione incognita e si effettua la determinazione.
Dal rapporto delle aree si risale quindi tramite l’equazione della retta al rapporto dei pesi o delle
concentrazioni.
Conoscendo la quantità di standard interno
aggiunto, è possibile risalire alla quantità di analita. 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 PA/PIS 0 0, 5 1, 0 1 ,5 2, 0 AA/AIS [a]/[IS]
PA/PIS si ricava per interpolazione dal grafico
QIS è la quantità di standard interno aggiunta (in peso)
Esempio
Se la quantità di standard interno aggiunta è 200 mg e il rapporto tra le aree ottenuto dal cromatogramma è 1 per interpolazione dal grafico precedente si ricava che il rapporto PA/PIS risulta essere 1,25.
Quindi dalla relazione sopra citata ricaviamo che la quantità di analita sarà:
1,25 x 200 = 250 mg
Se poi vogliamo conoscere la concentrazione basta considerare il volume di campione a cui è stato aggiunto lo standard.
A C IS IS A
C
V
Q
•
P
P
Lo standard interno deve soddisfare certi requisiti:
-Non essere presente nella miscela da analizzare -Essere ben risolto dagli altri componenti
-Avere un tr diverso ma non troppo lontano da quello dell’analita
-Essere strutturalmente simile al composto da analizzare in modo che la risposta strumentale sia uguale o simile.
-Non contenere impurezze
Tipicamente i grafici dose/risposta approssimano una linea retta
Nella pratica, raramente tutti i dati sperimentali sono allineati perfettamente lungo una linea retta; per questo occorre trovare la retta
migliore che interpola i punti sperimentali attraverso un’analisi di
regressione lineare usando il metodo dei minimi quadrati.
Viene cioè calcolata l’equazione della retta che minimizza la somma dei quadrati delle distanze verticali tra i punti e la retta stessa.
L’equazione è chiamata equazione di regressione ed è del tipo y = mx + q dove m, il coefficiente angolare, è chiamato coefficiente di regressione.
Tale retta, considerata la migliore, passa anche per il centroide o centro di gravità che corrisponde al punto (Xmedio, Ymedio), valori corrispondenti ai valori medi di tutti i dati sperimentali xi e yi.
X Y
.
.
.
.
Per stabilire fino a che punto la retta trovata possa essere usata al fine di prevedere un valore di Y conoscendo un determinato valore di X, e viceversa, cioè per stabilire se la retta è realmente la migliore, si calcola il
coefficiente di determinazione o di correlazione lineare r2.
r2 può assumere valori in valore assoluto compresi tra 0 e 1.
Se r2 = 1 allora esiste una relazione lineare perfetta tra x e y, per cui ad ogni valore di x corrisponde uno e un solo valore di y.
Se r2 = 0 allora non esiste alcuna relazione lineare tra x e y.
Valori compresi tra 0 e 1 indicano la “bontà” dell’equazione di regressione calcolata.
Difficilmente le rette di calibrazione hanno valori di r2 inferiori a 0,98 e in ogni caso mai al di sotto dello 0,95.