Cromatografia Cromatografia

Cromatografia Cromatografia

Scrittura del colore Scrittura del colore

Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo

Le tecniche sono molto utilizzate, permettendo

l’analisi di miscele complesse come sono la

maggior parte dei campioni di natura organica

Cenni storici

 1903-1906: nascita “Cromatografia” grazie a un botanico russo (M. Tswett)

 1938: introduzione della T.L.C. e della cromatografia a scambio ionico

 1941: cromatografia di ripartizione liquido- liquido

 1944: cromatografia su carta

 1950: cromatografia a fase inversa

 1951: gas-cromatografia

 1959: cromatografia a permeazione di gel

 1965: cromatografia liquida ad alte

prestazioni

Principi della cromatografia

-la differente velocità di migrazione dei componenti costituenti una miscela (equilibrio dinamico)

-Fase mobile (MP), liquida o gassosa

-Fase stazionaria (SP), solida o liquida, stratificata su vetro o alluminio o impaccata in una colonna

Fase fissa A Fase mobile Fase fissa B Fase mobile Fase fissa C Fase mobile

-Spostamento della fase mobile determina

l’avanzamento del soluto in essa contenuto mentre le

molecole che sono distribuite nella fase stazionaria

resteranno momentaneamente ferme

X X

  X X

Soluto

Soluto X migrerà con una velocità proporzionale a X migrerà con una velocità proporzionale a K K

o coefficiente di distribuzione tra le due fasi o coefficiente di distribuzione tra le due fasi

(dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi) (dipendente dal tempo che X spende nelle due fasi)

m X s

[X]

K  [X]

Il coefficiente di distribuzione Il coefficiente di distribuzione del componente X è del componente X è definito come:

definito come:

Quale componente ha K maggiore?

A: il campione viene iniettato all’entrata della colonna

B  D: la fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase stazionaria

A B C D

Flusso del solvente

K_A ≠ K_B ^≠ K_C

V_A = 1

V_M + V_S K_A

[A]_S = 0 A non ha alcuna

affinità per la fase fissa e si muove

con il fronte della fase mobile

[A]_M = 0 A non ha alcuna affinità per la fase mobile per cui si distribuisce

completamente nella fase fissa senza spostarsi

Riportando il segnale in funzione del tempo si ottiene il cromatogramma

Se [X]

=0 allora V

è max e uguale alla V

e il Volume dell’eluente necessario a eluire X è pari al volume dello spazio interstiziale non occupato dalla fase fissa detto volume interstiziale o V

.

Se [X]

≠0 allora V

è < di V

e il Volume dell’eluente necessario a eluire X volume di ritenzione V

sarà maggiore del V

.

Allora V

-V

= V

’ o volume netto di ritenzione

Tempo di ritenzione

t_M = t₀ = tempo morto

t_R’ = t_R - t₀ = tempo netto di ritenzione, tempo trascorso da un dato soluto nella fase stazionaria

Il tempo di ritenzione t_R è il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector.

Relazioni che quantificano l’interazione di un dato soluto con la fase stazionaria

V_R = t_R . F V_m = t₀ . F F (velocità di flusso)

FATTORE di CAPACITA’

V = velocità lineare media di migrazione di un soluto = L/t_R U = velocità lineare media di flusso della fase mobile = L/t₀

V = u . (frazione di tempo che il soluto passa nella fase mobile) V = u . [C_M.V_M/C_MV_M+C_SV_S]

1

1 + C_SV_S/C_MV_M V = u .

L/t_R = L/t₀ . 1

1 + K V_S/V_M t_R = t₀ (1 + K V_S/V_M) = t₀ (1 + K’)

M M R

t t

K'  t 

distribuzione di massa

k’ dipende:

•dalla T°

•dalla natura delle fasi

•dalle caratteristiche dell’impaccamento

•dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria k’ non dipende:

•dalla lunghezza della colonna

•dal flusso

La selettivitàLa selettività quantifica l’entità della separazione fra due specie: quantifica l’entità della separazione fra due specie:

riguarda la capacità di un sistema cromatografico di

riguarda la capacità di un sistema cromatografico di distinguere distinguere fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa fra due componenti ed è dipendente dalla distribuzione relativa

delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (t

delle specie fra la fase mobile e quella stazionaria, con (t_RR))_BB> (t> (t_RR))_AA..

M A

R

M B

R A

B

t )

t (

t )

t ( '

k ' k



 





Usato per confrontare le prestazioni di colonne diverse a parità di eluente

Fattore di separazione o Ritenzione relativa

Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi.

Poiché in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi è possibilità di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico.

Più elevato è il numero di piatti teorici, più grande è la probabilità di una separazione (migliore è la capacità di separazione della colonna). N è proporzionale alla lunghezza della colonna.

Parametri che descrivono quantitativamente

Parametri che descrivono quantitativamente l’efficienzal’efficienza di una di una colonna (ampiezza dei picchi):

colonna (ampiezza dei picchi):

1)1) Altezza equivalente di piatto teorico HAltezza equivalente di piatto teorico H 2)2) Numero di piatti teorici N Numero di piatti teorici N

L = lunghezza colonna L = lunghezza colonna

H N  L

Si può dimostrare che

W = larghezza del picco

2 R

W 16 t

N 



 



  W

Separazione ottimale Separazione ottimale

a) separazione con scarsa risoluzione e basso N

b) migliora la

risoluzione ma è sempre basso N

c) ottima risoluzione e buono N

1 k

k N 1

4

R 1

B IB

 



 









 

Si può dimostrare che:

Si può dimostrare che:

risoluzione scarsa per scarsa risoluzione scarsa per scarsa efficienza e scarsa selettività efficienza e scarsa selettività buona risoluzione dovuta a buona risoluzione dovuta a

buona efficienza e buona buona efficienza e buona

selettività selettività

risoluzione scarsa dovuta ad una risoluzione scarsa dovuta ad una

basso selettività.

basso selettività.

buona risoluzione dovuta a buona buona risoluzione dovuta a buona

selettività, ma efficienza non selettività, ma efficienza non

troppo elevata troppo elevata

Una Una buona risoluzionebuona risoluzione può derivare sia da una può derivare sia da una buona efficienzabuona efficienza (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da (picchi molto stretti, elevato numero di piatti teorici) sia da una una buona differenziazione del comportamento dei soluti buona differenziazione del comportamento dei soluti ((selettivitàselettività).).

Interazione soluto-fasi Interazione soluto-fasi

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

• legami a idrogeno

• interazioni dipolo-dipolo

• interazioni dipolo-dipolo indotto

• forze di Van der Waals

• formazione di composti di interazione

• attrazione coulombiana

• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico

Meccanismi di separazione

•

•

•

•

•

Cromatografia

Fase mobile: liquida Fase mobile: gassosa

CROMATOGRAFIA LIQUIDA (L.C.)

GAS-CROMATOGRAFIA (G.C.)

Fase fissa: liquida

CROMATOGRAFIA di RIPARTIZIONE (L.L.C.)

Colonna Strato sottile

Carta

Fase fissa: solida

CROMATOGRAFIA di ASSORBIMENTO (L.S.C.)

Colonna/strato sottile

CROMATOGRAFIA a SCAMBIO IONICO (L.S.C.)

Colonna/strato sottile

GEL CROMATOGRAFIA

Colonna/strato sottile

CROMATOGRAFIA di AFFINITA’

Fase mobile: fluido supercritico

CROMATOGRAFIA LIQUIDA SUPERCRITICA (S.F.C.)

RIPARTIZIONE RIPARTIZIONE

La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte (gel di silice) o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili.

Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile.

≡Si-OH + R-SiCl₃ + 2 H₂O ≡Si-O-Si(OH)₂-R + 3 HCl

La cromatografia di ripartizione è chiamata in fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile, mentre è chiamata fase inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. Si tratta della tecnica più comunemente impiegata per la separazione di sostanze organiche

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DI RIPARTIZIONEdi RIPARTIZIONE (L.L.C.)

In fase normale

Fase stazionaria polare

≡Si-O-Si(R)₂-CN

≡Si-O-Si(R)₂-NH₂

Fase mobile a bassa polarità Solventi organici

Soluzioni acquose

(zuccheri, steroidi, amminoacidi, proteine e peptidi)

In fase inversa

Fase stazionaria apolare

≡Si-O-Si(CH₃)₂

≡Si-O-Si-CH₂-(CH₂)₆-CH₃

≡Si-O-Si-CH₂-(CH₂)₁₆-CH₃

Fase mobile molto polare Soluzioni acquose o tamponate Miscele acqua/metanolo/acetonitrile (ammine, vitamine, idrocarburi, analgesici)

ADSORBIMENTO ADSORBIMENTO

La fase stazionaria è un solido in polvere (gel di silice o allumina);

sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi (-OH) che possono stabilire legami deboli (reversibilireversibili!) con le molecole della miscela da separare (ma anche con le molecole d’acqua, disattivandolo). Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas- solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile.

Per sostanze molto polari è preferibile usare gel disattivati, mentre per sostanze con bassa polarità si preferiscono le silici non modificate.

Le fasi mobili più usate in ordine di polarità crescente e quindi di potere eluente sono:

Esano, isottano, cloroformio, acetonitrile, metanolo, acqua.

SCAMBIO IONICO SCAMBIO IONICO

La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte (resine sintetiche) contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili (gruppi funzionali acidi o basici), i cui contro-ioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. Si parla di cromatografia di scambio ionico (IEC)

La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la

separazione di sostanze ioniche o ionizzabili (amminoacidi, nucleosidi,

nucleotidi)

Resina a scambio cationico: -SO₃H, -COOH Resina a scambio anionico: -NH₂, -N(CH₃)₂

La fase mobile è un tampone anionico (acetato) o cationico (tris) contenenti ioni della stessa carica di quella dei campioni (capacità di spostamento, pH, t °)

Fase stazionaria: scambiatore cationico forte polistirene solfonato Fase mobile: tampone citrato/acido citrico

Eluizione con gradiente di pH e forza ionica, ad esempio citrato/acido citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na+ da 0,2 a 0,4M.

Gli aminoacidi vengono eluiti sequenzialmente quando i valori del pH si avvicinano al loro punto isoelettrico:

a pH basso: acidi (es. Asp, Glu) a pH neutro: neutri (es. Gly, Val) a pH basico: basici (es. Lys, Arg)

Un analizzatore di amminoacidi contiene un sistema continuo di registrazione dell'eluato: nel cromatogramma ad ogni picco corrisponde un amminoacido.

ESCLUSIONE DIMENSIONALE ESCLUSIONE DIMENSIONALE

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel di granulometria definita (acrilammide o sephadex) per cui i campioni vengono separati in base alla dimensione delle loro molecole.

Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi (la fase stazionaria si comporta da setaccio, intervallo di PM).

Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC)

oGel permeazione (GPC) Gel permeazione (GPC) per la separazione di sostanze insolubili in acqua

oGel ^Gel filtrazione filtrazione (GFC)(GFC) per la separazione di sostanze solubili in acqua La tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni (peptidi, proteine, polimeri)

AFFINITA’

AFFINITA’

In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche

reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria a cui è chimicamente legato un ligando specifico così da ottenere l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di cromatografia di affinità (AFC).

Ligandi tipici sono substrati di reazioni enzimatiche, inibitori, cofattori, recettori, basi di sequenza complementari, ormoni, anticorpi, ecc…

Le matrici più utilizzate sono l’agarosio, la poliacrilammide, il destrano, la cellulosa; scarse interazioni aspecifiche, buone proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili, stabilità a variazioni di pH e di temperatura.

La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico

Cromatografia classica su colonna Cromatografia classica su colonna

Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni secondo le esigenze.

Il riempimento della colonna può essere costituito da materiale solido adsorbente, finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con supporto granulare inerte, generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica.

Il solvente scelto, contenente la miscela da separare, viene fatto fluire attraverso la colonna.

Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta pressione è frutto dell’evoluzione tecnologica delle tecniche di cromatografia su colonna.

I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione, ma le fasi stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con materiali di granulometria molto fine (3-10 m) e controllata: in tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile e fase stazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo.

Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente diventa molto lento.

Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di 50-150 atm, diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi ragionevolmente brevi.

HPLC (High Performance Liquid

Chromatography)

HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica:

velocità, risoluzione e sensibilità superiori

A B C

A.A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d

= 100

= 100 m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)

B.B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 m, D = 1-3 mm, L = 50-m, D = 1-3 mm, L = 50- 100 cm)

100 cm)

C.C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L m, D = 2-6 mm, L

= 10-50 cm)

= 10-50 cm)

d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna

LC classica:

LC classica:

1) dimensione delle particelle e 1) dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto diametro interno della colonna molto

maggiori che nella HPLC maggiori che nella HPLC

2) velocità di flusso molto basse 2) velocità di flusso molto basse

3) tempi di analisi lunghi 3) tempi di analisi lunghi

HPLC:

HPLC:

1) impaccamento di dimensioni 1) impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in molto inferiori, compresso in colonne sottili

colonne sottili

2) contropressioni maggiori 2) contropressioni maggiori 3) tempi d’ analisi contenuti 3) tempi d’ analisi contenuti

Cercando di aumentare la velocità del Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e trasporto di massa nei pori profondi e

nei lunghi canali interparticellari.

nei lunghi canali interparticellari.

Per favorire il flusso della fase mobile è Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad quindi necessario l’uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di alta pressione. Efficienza aumentata di 10-100 e tempi di separazione 10-100 e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile).

stazionaria e della fase mobile).

La pressione dipende da diversi paramentri:

η = viscosità del solvente V = velocità lineare di flusso L = lunghezza della colonna

K = costante legata alle caratteristiche fisiche del riempimento della colonna

d = diametro della colonna

1 pascal = 1 newton/m² = 1x105 bar 1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm²

Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con diametro interno di 1-5 mm.

Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o da particelle o impurezze presenti nel campione e nel solvente. È per questo che è necessario proteggere l’ingresso della colonna principale con una pre-colonna che contiene la stessa fase stazionaria della colonna principale, ma è più corta e può venire periodicamente sostituita.

La fase stazionaria più comune è costituita da particelle microporose di silice ad elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area superficiale (alcune centinaia di m²/g). Questa fase stazionaria viene generalmente impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie della silice.

Fasi polari comuni Fasi non polari comuni R = (CH₂)₃NH₂ ammino R = (CH₂)₁₇CH₃ ottadecile R = (CH₂)₃CN ciano R = (CH₂)₇CH₃ ottile

La C18 (anche indicata con ODS) è la fase stazionaria di gran lunga più

utilizzata in HPLC

• riserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscela

• pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/min

• sistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campione

• colonna

cromatografica ed eventuale

precolonna

• rivelatore per monitorare gli eluati

• PC per gestire il sistema e i dati

Eluizione isocratica e a gradiente

Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante.

Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente è necessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.

SOLVENTE SOLVENTE DEBOLE DEBOLE

SOLVENTE SOLVENTE FORTE FORTE FORZA FORZA

INTERMEDIA INTERMEDIA GRADIENTE GRADIENTE DI SOLVENTE DI SOLVENTE

Sistemi di rivelazione

• Sensibilità adeguata al problema

• Buona stabilità e riproducibilità

• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

• Tempi di risposta rapidi

• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatore LOD (ng) Selettività Utilizzabile in gradiente?

Assorbimento UV 0.1-1 selettivo SI

Indice di rifrazione 100-1000 generale NO

Fluorescenza 0.001-0.01 selettivo SI

Elettrochimico 0.01-1 selettivo NO

Conduttimetrico 0.5-1 selettivo NO

Assorbimento IR 1000 selettivo SI

Spettrometro di massa 0.1-1 generale SI

GAS-CROMATOGRAFIA

In gascromatografia (Martin e Synge 1941 e poi James e Martin 1952) la fase mobile è un gas che fluisce in una colonna in cui è posta la fase stazionaria.

I meccanismi di separazione dei componenti la miscela sono determinati dalla fase stazionaria, poiché quella mobile funziona solamente da gas di trasporto(carrier).

Condizione indispensabile per operare un’analisi

gascromatografica su una miscela è che essa sia in

grado di passare in fase vapore alla temperatura di

lavoro.

VANTAGGI DELLA GC VANTAGGI DELLA GC

•Poco costosaPoco costosa

•Altamente sensibile (10Altamente sensibile (10^{-9 -9} - 10- 10^-13-13 g/mL)

g/mL)

•Robusta Robusta

•RiproducibileRiproducibile

•RapidaRapida

•Separazione di mix complesse Separazione di mix complesse (100 analiti in GC-capillare)

(100 analiti in GC-capillare)

SVANTAGGI DELLA GC SVANTAGGI DELLA GC

Non applicabile all’analisi di Non applicabile all’analisi di macromolecole, sostanze termolabili, macromolecole, sostanze termolabili, altamente polari o idrofile

altamente polari o idrofile

Cromatografia di adsorbimento gas-solidoCromatografia di adsorbimento gas-solido (fase stazionaria = (fase stazionaria = solido adsorbente)

solido adsorbente)

Cromatografia di ripartizione gas-liquido

Cromatografia di ripartizione gas-liquido (fase stazionaria = (fase stazionaria = liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato liquido che può essere supportato da un solido inerte o depositato sulle pareti della colonna)

sulle pareti della colonna)

A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo:

A differenza della LC, la fase mobile non ha effetto competitivo: il il gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i gas di trasporto o CARRIER serve solo per trascinare i componenti lungo la colonna.

componenti lungo la colonna.

Trattamento del campione

Derivatizzazione: usata per sostanze altobollenti

• Reagenti sililanti

HMDS esametildisilazano (zuccheri)

TMCS trimetilclorosilano (acidi carbossilici)

BSA bistrimetilsililacetamide (alcoli, ammine, acidi carbossilici, fenoli, steroidi, alcaloidi)

BSTFA bistrimetilsililtrifluoroacetamide (come BSA froma deivati poù volatili)

• Reagenti acilanti

TFAA anidride trifluorometansolfonica (alcoli, fenoli, ammine) PFPA anidride pentafluoropropionica (alcoli, fenoli, ammine) HFBA anidride eptafluorobutirrica (tioli)

• Reagenti alchilanti

TMPAH idrossido di trimetilanilinio (COOH, NH2, OH, barbiturici, sedativi, basi xantiniche, alcaloidi fenolici)

BF₃ in etanolo (acidi grassi dei trigliceridi)

PFBBr pentafluorobenzilbromuro (acidi, fenoli, tioli e solfonammidi)

He, Ar, N₂

SCHEMA DI UN GASCROMATOGRAFO

SISTEMA DI INIEZIONE

FUNZIONI:

- Introduzione del campione - Evaporazione del campione - Ingresso del gas di trasporto - Collegamento alla colonna

L’entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere l’evaporazione istantanea del campione e abbastanza grande da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro.

Nelle colonne impaccate

Nelle colonne impaccate, il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del , il campione (max 0,5 mL) viene introdotto direttamente nel flusso del gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della gas-carier atttarverso una camera di iniezione che assicura la immediata vaporizzazione della miscela (T° 50-100°C).

miscela (T° 50-100°C).

Nelle colonne capillari

Nelle colonne capillari, la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a , la quantità che arriva in colonna è invece notevolmente inferiore (fino a 100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole.

100 volte) e questo può essere realizzato con vari tipi di valvole.

COLONNE

Per gas-cromatografia

Le Le impaccate (acciaio, vetro o impaccate (acciaio, vetro o rame) contengono particelle rame) contengono particelle solide inerti di appropriata solide inerti di appropriata granulometria, eventualmente granulometria, eventualmente imbevute della fase stazionaria imbevute della fase stazionaria liquida (diametro = 0.75 - 4 mm;

liquida (diametro = 0.75 - 4 mm;

lunghezza = 6 m) lunghezza = 6 m) ..

Le Le capillari sono tubi molto più capillari sono tubi molto più sottili e lunghi (diametro = 0.1 - sottili e lunghi (diametro = 0.1 - 0.75 mm; lunghezza = 15-300 0.75 mm; lunghezza = 15-300 m) in cui la fase stazionaria è m) in cui la fase stazionaria è depositata sulle pareti interne.

depositata sulle pareti interne.

Queste ultime hanno un elevato Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche numero di piatti teorici (anche 300.000) grazie alla loro elevata 300.000) grazie alla loro elevata lunghezza.

lunghezza.

“canalicoli”

dell’impaccata

unico “canalone”

della capillare

WCOT= wall-coated-open-tubular

SCOT= support-coated-open-tubular

Le fasi stazionarie più usate in Le fasi stazionarie più usate in GC di adsorbimento sono:

GC di adsorbimento sono:

Gel di silice Gel di silice Allumina Allumina

Carbone attivo Carbone attivo

Carbone grafitizzato Carbone grafitizzato

Microparticelle sferiche di carbone Microparticelle sferiche di carbone Zeoliti

Zeoliti

Sali inorganici Sali inorganici

I supporti inerti più usati in GC di I supporti inerti più usati in GC di ripartizione sono:

ripartizione sono:

Terra di Diatomee Terra di Diatomee Teflon

Teflon

Microsfere di vetro Microsfere di vetro

Le fasi stazionarie più usate Le fasi stazionarie più usate (ancorate, legate) sono:

(ancorate, legate) sono:

Idrocarburi Idrocarburi

Esteri e poliesteri Esteri e poliesteri Polieteri

Polieteri

Ammidi, ecc….

Ammidi, ecc….

Influenza della temperatura sulla corsa cromatografica

• Normalmente la temperatura della colonna è regolata sul valore corrispondente alla media dei punti di ebollizione dei componenti della miscela.

• Per miscele particolarmente complesse con punti di ebollizione troppo distanti tra di loro la scelta della temperatura è problematica.

• Per tali miscele un temperatura troppo alta consentirebbe una buona separazione dei componenti

altobollenti ma ammasserebbe quelli più bassobollenti.

• Al contrario, una temperatura troppo bassa, non consentirebbe di separare quelli altobollenti.

Nei moderni strumenti la programmazione è di tipo lineare, e prevede le seguenti tappe:

Isoterma iniziale: indica quanto tempo si rimane a una determinata temperatura.

Fase di rampa: si stabilisce la temperatura da raggiungere e con quale velocità.

Isoterma finale: indica il tempo che si deve restare alla temperatura più alta.

Raffreddamento: si attua dopo la fine della registrazione del cromatogramma

45°

145

°

programma di T

Sistemi di rivelazione

• Sensibilità adeguata al problema

• Buona stabilità e riproducibilità

• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

• Tempi di risposta rapidi

• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatore Selettività

Termoconducibilità TCD Non selettivo

Insostituibile per l’analisi dei gas

Ionizzazione di fiamma Poco selettivo

Azoto-fosforo (NPD) o a fiamma alcalina selettivo

A Cattura di elettroni (ECD) Selettivo

Organofosforici, diossine, benzodiazepine

Spettrometro di massa generale

Limite di linearità

è la concentrazione massima al di là della quale il segnale non è più proporzionale alla concentrazione (con una tolleranza del 5%).

Intervallo di linearità range di concentrazioni compresa tra il limite di rivelabilità e il limite di

linearità. Intervallo di

risposta dinamico intervallo di concentrazioni entro il quale il

rivelatore risponde, anche se non in maniera

lineare

Limite di rivelabilità

è la

concentrazione minima che dà

una risposta doppia del rumore di fondo

Limite intervallo di risposta dinamico;

oltre questa concentrazione non si possono fare misure

Riassumendo

• analiti volatili o volatilizzabili, termicamente stabili, non ionici



Gascromatografia

• analiti non volatili o poco volatili, ionici,

ionizzabili o non ionici, termicamente instabili



Cromatografia liquida

La Radiazione Elettromagnetica è costituita da un campo magnetico e da un campo elettrico oscillanti su due piani perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda.

Parametri che descrivono la natura ondulatoria dell’onda:

-Lunghezza d’onda : distanza tra i due massimi o tra i due minimi.

-Ampiezza d’onda: in valore assoluto la distanza tra la direzione di propagazione dell’onda e il punto di max o di min.

-Frequenza : numero di onde che passano un dato punto nell’unità di tempo.

La descrizione quantitativa delle interazioni tra la radiazione e la materia è possibile solo se si considera la radiazione come formata da quantità discrete, chiamate FOTONI. L’energia dei fotoni è proporzionale alla frequenza della radiazione.

SPETTROSCOPIA

E’ la disciplina che studia l’INTERAZIONE delle radiazioni elettromagnetiche con gli stadi quantici di energia della materia.

In virtù di questa interazione, si determina una variazione dell’energia che può interessare nuclei, elettroni, atomi o molecole.

assorbire la radiazione > il suo contenuto energetico (SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO)

emettere la radiazione < il suo contenuto energetico (SPETTROSCOPIA di EMISSIONE)

diffondere la radiazione (SPETTROSCOPIA RAMAN)

Tutti questi tipi d’interazione possono avvenire solo per determinate l della radiazione incidente e quindi solo per determinate .

h = E’-E”

SPETTROSCOPIA di ASSORBIMENTO

Processo mediante il quale una sostanza rimuove selettivamente alcune frequenze dalla radiazione elettromagnetica.

Lo spettro non è altro che la rappresentazione grafica delle transizioni energetiche permesse (Regole di selezione) sotto forma di righe.

1. Transizioni elettroniche

E

= E

+ E

+ E

+ E

2. Transizioni vibrazionali 3. Transizioni rotazionali 4. Transizioni traslazionali

E_eⁿ

E_e¹

E_e⁰

E_vⁿ E_v² E_v¹

E_r⁰ E_rⁿ

, E



E_v⁰

Infrarosso lontano, microonde

TRANSIZIONI

Rotazionali Vibrazionali Elettroniche

Infrarosso

Visibile, Ultravioletto, Raggi X

Onde Radio

Variazioni di energia troppo deboli per essere osservate se non sotto un intenso

campo magnetico STATI di SPIN

INDOTTI

MAGNETICAMENTE EPR (elettroni)

NMR (nuclei)

La legge dell’assorbimento o Legge di Beer

E’ la legge sperimentale che descrive i fenomeni di assorbimento delle radiazioni elettromagnetiche in generale e con particolare riferimento alle soluzioni.

A =  . b . C

A = assorbanza o frazione di energia assorbita

b = cammino ottico (cm), spessore della soluzione attraversata dal raggio

c = concentrazione (mol/L) della specie in esame

 = assorbività o coefficiente di estinzione molare o di assorbimento molecolare (IUPAC), cioè l’assorbanza a concentrazione e spessore unitari.

(, dal solvente, dalla natura chimica della specie che assorbe; non dipende in generale dalla temperatura)

Se  è costante e b (cammino costante) allora l’equazione assume la forma A = kc e quindi del tipo y = mx.

Altro modo per descrivere il fenomeno dell’assorbimento consiste nell’usare la definizione di Trasmittanza

T = _ T = trasmittanza

I₀ = intensità della radiazione incidente

I = intensità della radiazione che esce dal campione

Questa grandezza è legata all’Assorbanza secondo la relazione:

A = log 1/T = log I₀/I Se T% = 100T

A = log 100/T% = 2-log T% oppure T% = 10^2-A A varia tra 0 e infinito mentre T% varia tra 0 e 100.

Fattori che possono determinare deviazioni dalla linearità:

-Concentrazione della soluzione (10^-2/10^-7), se troppo concentrata si può avere una variazione dell’indice di rifrazione e quindi di , così come si possono formare coppie ioniche o complessi o aggregati.

-Variazioni di pH, perché influenza l’equilibrio tra due forme della stessa sostanza, aventi  diverso ad una stessa .

-Temperatura, perché influenza sempre un eventuale equilibrio;

tuttavia variazione nell’ordine di ±5 °C non comportano particolari problemi.

-Solvente, perché la polarità del solvente influisce sulla distribuzione elettronica nella molecola analizzata. Ad es solventi polari o con alta costante dielettrica esercitano un effetto batocromo.

-Co-presenza di fenomeni di fluorescenza (emissione) e diffusione della radiazione.

-Fattori strumentali (ampiezza della banda passante)

Spettri di assorbimento e scelta della lunghezza d’onda per la misura dell’assorbanza

Una sostanza assorbe in modo diverso le varie radiazioni, cioè a diverse  corrispondono vari .

Lo spettro di assorbimento che si ottiene è uno spettro a bande caratterizzato dalla presenza di massimi (picchi di assorbimento) e minimi.

Ogni sostanza ha un suo spettro caratteristico ed è proprio individuando la posizione dei massimi caratteristici che si realizza l’analisi qualitativa.

L’analisi quantitativa viene invece fatta scegliendo un’opportuna , detta lunghezza d’onda analitica, scelta in modo che corrisponda ad un max o ad un min.

Transizioni elettroniche e cromofori L’assorbimento nel campo UV-

VIS è dovuto a transizioni elettroniche da orbitali di legame a orbitali di non-legame o di anti-legame a più alto contenuto energetico e questo è possibile solo se la radiazione possiede un’energia pari al E tra i due livelli.

π π*

n π*

Le prime sono caratteristiche dei sistemi insaturi e le seconde di eteroatomi con doppietti liberi; sistemi di questo tipo sono indicati come cromofori.

C=C, C≡C, C=O, C≡N, C=S, N=O, N=N, polieni, aromatici, ecc…

Effetto dei sostituenti

Effetto Batocromo: diminuisce il E della transizione, alzando il contenuto energetico dell’orbitale legante o diminuendo quella dell’orbitale anti-legante o non- legante. Il picco (l’assorbimento) viene spostato a  maggiori (sostituenti e- ricchi o donatori).

Effetto Ipsocromo: effetto opposto al precedente; aumenta il E e quindi diminuisce la  dell’assorbimento (sostituenti e- poveri o elettronegativi).

Effetto Ipercromico: risulta aumentato  o per aumento della probabilità che avvenga quella data transizione o per aumento della superficie del cromoforo;

aumenta l’assorbanza ma rimane costante la  a cui il composto assorbe.

Effetto Ipocromico: effetto opposto al precedente; diminuzione di  e quindi dell’assorbanza.

Rivelatore UV a  fissa

Vantaggi e svantaggi

Il principale vantaggio è il basso costo.

Inoltre l’elevata intensità della radiazione della lampada a Hg permette di ottenere elevata sensibilità per composti che assorbono a 254 nm.

Il principale svantaggio è determinato dalla scarsa selettività dovuta alla necessità di lavorare a  fissa.

Rivelatore UV a  variabile

Vantaggi

- Versatilità: possibilità di selezionare  da 190 a 800 nm.

- Elevata sensibilità: potendo scegliere la  ottimale (max assorbanza) per un analita.

- Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la

 in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti.

- Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una  alla quale la miscela solvente non assorbe.

Dopo un’ora

Separazione di una tossina proteica, della tossina coniugata con la biotina e dell’avidina (fattore antinutrizionale)

Avidina

Glicoproteina

dell’albume che impedisce

l’assorbimento della biotina

Biotina (IUPAC) Vitamina H o I (tedesca)

Vitamina B₇ (anglosassone) Vitamina B₈ (francese)

Lo spettrometro di massa può fornire informazioni qualitative e quantitative sui componenti della miscela analizzata mediante HPLC. Per ottenere uno spettro di massa, le molecole portate in fase gassosa, vengono ionizzate.

Gli ioni sono quindi accelerati per mezzo di un campo elettrico e vengono poi separati in base al loro rapporto massa/carica (m/z).

L’accoppiamento HPLC-MS è una tecnica relativamente “giovane” e sempre più utilizzata.

Lo MS in un sistema integrato HPLC-MS può servire come rivelatore universale (o comunque come un rivelatore che risponde ad un’estesa gamma di soluti) e sensibile.

L’accoppiamento HPLC/MS è stato tentato già molti anni fa (fine anni ’60), ma soltanto dalla metà degli anni ’70 appaiono le prime pubblicazioni scientifiche.

Le difficoltà di tutti i metodi HPLC-MS derivano dal fatto che in HPLC si utilizzano solventi molto diversi, in funzione del tipo di analisi, (es.

acqua, solventi organici, tamponi); inoltre i flussi in LC sono molto elevati rispetto a quelli richiesti per lo spettrometro di massa. Per accoppiare le 2 tecniche sono pertanto necessarie opportune interfacce che oltre a ridurre i flussi dovranno consentire anche la vaporizzazione degli analiti mediante riscaldamento.

Spettrometro di Massa

analita

Camera di ionizazione

fascio ionico

Campo elettrico acceleratore

Campo magnetico analizzatore

1) il sistema di entrata

2) la sorgente ionica, il cuore dello spettrometro, in cui le molecole neutre vengono trasformate in ioni e si frammentano

3) l’analizzatore, in cui gli ioni vengono separati in funzione del rapporto massa/carica (m/z)

4) il rivelatore, in cui gli ioni vengono raccolti ed i segnali inviati, dopo amplificazione, al registratore che converte le informazioni contenute nei segnali in uno spettro.

Spettrometro di Massa a Quadrupolo Iperbolico

1) M + e

M

+ 2e

M

M

2) M

M

M

, etc.

50 100 150 200 massa relativa

Abbondanza relativa

Ogni molecola ha una frammentazione unica e caratteristica che, come una vera e propria impronta digitale, ci permette di identificare e di risalire alla molecola madre.

Normalizzazione dei picchi

1) Formazione ione molecolare (parente) 2) Formazione ioni di frammantazione

3) Formazione di ioni di riarrangiamento (trasposizione)

AB + e- [AB]^+. + 2e- PM

[AB]^+. [A]⁺ + [B]^.

catione radicale

[A]⁺ [C]⁺ + [D]

catione molecola neutra

[AB]^+. [EF]^+. + [D]

ione radicale molecola neutra

Informazioni sulla struttura (identificazione dei

composti)

La presenza di picchi isotopici, aventi quindi rapporto m/z = M+ + 1 (o 2, 3, 4, ecc…)

con intensità proporzionale all’abbondanza isotopica naturale

Tre requisiti (necessari, ma non sufficienti) perché un picco sia effettivamente lo ione molecolare:

- Picco a massa più alta

- Ione ad elettrone dispari (ione radicalico)

- Spiegare tutti gli ioni più importanti nella zona delle masse alte dello spettro in base a perdite logiche di specie neutre.

Grado di insaturazione (n° di anelli + n° di = legami) = X – ½ Y + ½ Z + 1

C_xH_yN_zO_n

C₆H₆ 6 - 3 + 1 = 4 (1 anello + 3 = legami)

C₇H₅O 7 – ½ 5 + 1 = 5,5

CO

Regola dell’azoto

Ione molecolare pari = 0, 2, 4, …. n° di N Ione molecolare dispari = 1, 3, 5, ….n° di N

(azoto ha massa pari ma valenza dispari) Analisi dei picchi isotopici

- M+2: stessa intensità di M 1 atomo di Br - M+2: 33% intensità di M 1 atomo di Cl

- M+2: 4% intensità di M 1 atomo di S

- M+2, M+4, M+6,….. 2, 3,….atomi di Br, Cl,..

Frammentazione

Ioni neutri non vengono rivelati ma possono essere individuati indirettamente dalla differenza di massa tra

lo ione molecolare e lo ione frammento vicino.

Es.

- Perdite di 1, 2, 3 sono plausibili - Perdite tra 4-14 no

- Perdita di 15 palusibile (CH₃) - Perdite tra 21-25 no

Tipi di ionizzazione Elettronica (E.I.)

Chimica (C.I.)

I. di campo (F.I.)

Disassorbimento di campo (F.D.)