ESCLUSIONE DIMENSIONALE
La fase stazionaria è un solido poroso o un gel di granulometria definita (acrilammide o sephadex) per cui i campioni vengono separati in base alla dimensione delle loro molecole.
Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo; le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi (la fase stazionaria si comporta da setaccio, intervallo di PM).
Si parla di cromatografia di esclusione dimensionale (SEC)
o
Gel permeazione (GPC)Gel permeazione (GPC) per la separazione di sostanze insolubili in acquao
Gel Gel filtrazione filtrazione (GFC)(GFC) per la separazione di sostanze solubili in acqua La tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni (peptidi, proteine, polimeri)AFFINITA’
AFFINITA’
In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reazioni di tipo biochimico,
reversibili e molto specifiche
reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria a cui è chimicamente legato un ligando specifico così da ottenere l’eluizione selettiva di alcuni componenti della miscela. Si parla di
cromatografia di affinità (AFC).
Ligandi tipici sono substrati di reazioni enzimatiche, inibitori, cofattori, recettori, basi di sequenza complementari, ormoni, anticorpi, ecc…
Le matrici più utilizzate sono l’agarosio, la poliacrilammide, il destrano, la cellulosa; scarse interazioni aspecifiche, buone proprietà di flusso, gruppi chimici modificabili, stabilità a variazioni di pH e di temperatura.
La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di
molecole di interesse
Cromatografia classica su colonna
Cromatografia classica su colonna
Le colonne impiegate sono generalmente in vetro e possono essere di varie dimensioni secondo le esigenze.
Il riempimento della colonna può essere costituito da materiale solido adsorbente, finemente suddiviso, asciutto e scelto opportunamente in base alla separazione da effettuare (per LSC) oppure la colonna viene riempita con supporto granulare inerte, generalmente gel di silice, che viene impregnato con solvente opportuno e che costituirà la fase fissa (per LLC) o ancora una resina a scambio ionico per cromatografia ionica.
Il solvente scelto, contenente la miscela da separare, viene fatto fluire attraverso la colonna.
Il metodo strumentale della cromatografia liquida ad alta pressione è frutto dell’evoluzione tecnologica delle tecniche di cromatografia su colonna.
I principi sono sempre quelli dell’adsorbimento e della ripartizione, ma le fasi stazionarie sono impaccate in colonne chiuse, con materiali di granulometria molto fine (3-10 m) e controllata: in tal modo viene aumentata la superficie di contatto fra fase mobile e fase stazionaria e l’impaccamento diviene più omogeneo.
Utilizzando queste colonne è necessario che la fase mobile venga fatta fluire ad alta pressione perché, attraverso colonne con impaccamento a granulometria così fine, il flusso dell’eluente diventa molto lento.
Con l’impiego di pompe particolari, capaci di applicare pressioni di 50-150 atm, diventa possibile ottenere flussi di alcuni ml/min, sufficienti ad ottenere l’eluizione in tempi ragionevolmente brevi.
HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
HPLC - Vantaggi rispetto alla LC classica:
velocità, risoluzione e sensibilità superiori
A B C
A.
A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d = 100
= 100 m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm)m, D = 20-50 mm, L = 200-100 cm) B.
B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 m, D = 1-3 mm, L = 50-m, D = 1-3 mm, L = 50-100 cm)
100 cm)
C.
C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 m, D = 2-6 mm, L m, D = 2-6 mm, L
= 10-50 cm)
= 10-50 cm)
LC classica:
LC classica:
1) dimensione delle particelle e
1) dimensione delle particelle e
diametro interno della colonna molto
diametro interno della colonna molto
maggiori che nella HPLC
maggiori che nella HPLC
2) velocità di flusso molto basse
2) velocità di flusso molto basse
3) tempi di analisi lunghi
3) tempi di analisi lunghi
HPLC:
HPLC:
1) impaccamento di dimensioni 1) impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in molto inferiori, compresso in colonne sottili
colonne sottili
2) contropressioni maggiori 2) contropressioni maggiori 3) tempi d’ analisi contenuti 3) tempi d’ analisi contenuti
Cercando di aumentare la velocità del
Cercando di aumentare la velocità del
solvente, diminuiscono efficienza e
solvente, diminuiscono efficienza e
risoluzione a causa del limitato
risoluzione a causa del limitato
trasporto di massa nei pori profondi e
trasporto di massa nei pori profondi e
nei lunghi canali interparticellari.
nei lunghi canali interparticellari.
Per favorire il flusso della fase mobile è
Per favorire il flusso della fase mobile è
quindi necessario l’uso di pompe ad
quindi necessario l’uso di pompe ad
alta pressione. Efficienza aumentata di
alta pressione. Efficienza aumentata di
10-100 e tempi di separazione
10-100 e tempi di separazione
diminuiti (miglioramento nei termini di
diminuiti (miglioramento nei termini di
trasporto di massa della fase
trasporto di massa della fase
stazionaria e della fase mobile).
stazionaria e della fase mobile).
La pressione dipende da diversi paramentri:
η = viscosità del solvente V = velocità lineare di flusso L = lunghezza della colonna
K = costante legata alle caratteristiche fisiche del riempimento della colonna
d = diametro della colonna
1 pascal = 1 newton/m2 = 1x105 bar 1 bar = 0,9869 atm = 1,01 Kg/cm2
Le colonne per HPLC sono in acciaio o in plastica, lunghe 5-30 cm e con diametro interno di 1-5 mm.
Le colonne sono costose e vengono facilmente danneggiate da polvere o da particelle o impurezze presenti nel campione e nel solvente. È per questo che è necessario proteggere l’ingresso della colonna principale con una pre-colonna che contiene la stessa fase stazionaria della colonna principale, ma è più corta e può venire periodicamente sostituita. La fase stazionaria più comune è costituita da particelle microporose di silice ad elevata purezza, permeabili al solvente e con elevata area superficiale (alcune centinaia di m2/g). Questa fase stazionaria viene generalmente impiegata per cromatografia di adsorbimento. Più comunemente, si realizza la cromatografia di ripartizione impiegando
fasi stazionarie legate, ossia fissate covalentemente alla superficie
della silice.
Fasi polari comuni Fasi non polari comuni
R = (CH2)3NH2 ammino R = (CH2)17CH3 ottadecile R = (CH2)3CN ciano R = (CH2)7CH3 ottile
La C18 (anche indicata con ODS) è la fase stazionaria di gran lunga più
• riserva di solventi: uno o più solventi che possono essere utilizzati singolarmente o in miscela
• pompa con pressione fino a 400 Atm, flusso stabile tra 0.1 e 10 ml/min
• sistema di iniezione costituito da una valvola a più vie e da un circuito a volume fisso, o loop, nel quale si mette il campione • colonna cromatografica ed eventuale precolonna • rivelatore per monitorare gli eluati • PC per gestire il sistema e i dati