Analisi di Sequenza

La genotipizzazione è stata effettuata utilizzando la piattaforma ad alta processività "GenomeLab GeXP Genetic Analysis System" (Beckman) (Fig.3).

Figura 3: Sequenziatore automatico CEQ8800 (Beckman); SNPStart Primer Extension Kit ed esempio di picchi ottenuti.

Lo strumento è un analizzatore genetico automatizzato, capace di determinare la sequenza delle basi, o misurare e quantizzare i frammenti di DNA. I

30 frammenti di DNA corrono lungo un capillare e vengono rilevati, in modo automatico, attraverso una luce laser di lunghezza d'onda tale da eccitare la fluorescenza dei ddNTPs marcati ed aggiunti alla PCR di sequenza. Durante questa fase i fluorocromi legati al DNA vengono eccitati da un laser ed emettono luce a lunghezze d’onda specifiche per ciascun fluorocromo. Tale luce viene registrata da una camera in modo che tutti i tipi di fluorescenza (relativi ai differenti fluorocromi utilizzati) possano essere evidenziati contemporaneamente. La posizione del picco è indice del peso molecolare del frammento, l’altezza dei picchi è un indice grossolano della quantità del prodotto amplificato, il colore consente di distinguere i diversi nucleotidi. Per ogni campione analizzato vengono fatte due reazioni di PCR, una contenente l’Interrogation Primer F e l’altra con l’Interrogation Primer R.

La reazione di primer extension è stata effettuata nelle seguenti condizioni:

H2O 0-4.5 μl DNA Purificato 0.5-5.0 μl Interrogation Primer (0.2μM) 1.0 μl SNPStart Master Mix 4.0 μl Volume finale 10 μl

La quantità di DNA (in μl) e di H2O sono state calcolate sulla base della lettura del fluorimetro QubitTM.

Il programma di PCR è stato di 25 cicli così organizzati:

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 45°C per 20 secondi

La miscela di reazione è stata purificata con una mix composta da 0.25 μl di fosfatasi alcalina (SAP) (1U/μl), 1.30 μl di SAP Buffer e 1.45 μl di acqua sterile. I campioni sono stati incubati a 37°C per 30 minuti e poi a 65°C per 15 minuti per inattivare l’enzima SAP.

Dopo la purificazione, il campione è stato preparato per il caricamento di una piastra costituita da 96 pozzetti, in cui sono stati aggiunti 5 μl di miscela di reazione purificata, 0.5 μl di Size Standard 80 e 39.0 μl di Sample Loading Solution. Il CEQ Size Standard 80 conteneva due frammenti di 20 e 80 nucleotidi marcati con fluorocromo rosso, che sono stati utilizzati come riferimento per l’analisi dei picchi. L’ampiezza ottimale dei picchi ottenuti doveva infatti essere compresa tra gli standard, fattore essenziale per la convalida del dato. La piastra è stata poi inserita nel sequenziatore automatico; la durata della corsa dipendeva dalla quantità di campioni caricati. In media per 8 campioni la durata era di circa 1 ora e 30 minuti. L’analisi dei dati è stata effettuata attraverso l’utilizzo di un software specifico, SNP Software Update, inserendo parametri modificabili in base al tipo di polimorfismo studiato. Ad esempio, è stato possibile selezionare solo i picchi dei nucleotidi di interesse per una miglior lettura del dato.

Il protocollo completo di analisi degli SNP mediante la piattaforma ad alta processività CEQ8800 (Beckman) è schematizzato in Figura 4.

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DNA genomico

Prodotto PCR

Purificazione prodotto PCR

PCR con ddNTP marcati con fluorofori Uso degli Interrogative primers

Prodotto PCR marcato

Purificazione prodotto PCR con SAP (fosfatasi alcalina)

37 C 30 minuti 65 C 15 minuti

Preparazione piastra Analisi dati

PCR

PCR con ddNTPs marcati con fluorofori Uso degli Interrogation Primers

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3.5 Analisi Statistica

I valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD). L’analisi del Chi-quadro (χ2

) è stata utilizzata per confrontare i dati categoriali e per individuare deviazioni dall’equilibrio di Hardy-Weinberg. I dati continui sono stati confrontati utilizzando 0test a due code, cioè il t-test di Student per dati non appaiati e l’analisi della varianza quando sono stati confrontati più gruppi. Abbiamo effettuato uno studio di associazione di tipo caso-controllo in due sottoinsiemi dei soli casi, definiti da soglie di età di insorgenza della malattia cardiaca ischemica (cut-off età ≤50 anni per gli uomini ed età ≤60 anni per le donne, come da letteratura). In queste condizioni, dato un campione di 114 casi con insorgenza precoce di cardiopatia ischemica e 384 pazienti con insorgenza tardiva di cardiopatia ischemica (un rapporto caso-controllo 1:3) e SNP che mostrano una MAF> 10%, il nostro studio aveva una potenza > 80% di individuare associazioni significative. Inoltre, avendo effettuato uno studio di soli casi è stata ottenuta una potenza maggiore rispetto ad uno studio caso- controllo. Nello studio di associazione dei vari SNP con l’esordio di malattia, non è stata applicata la correzione di Bonferroni per test multipli, al fine di evitare errori di tipo II che possono anche contribuire a importanti bias di pubblicazione. Perciò un’associazione è stata considerata significativa se presentava un p-value inferiore a 0.05.

Ogni genotipo è stato valutato in base al modello genetico dominante (omozigote wild-type vs eterozigote e omozigote mutato), recessivo (omozigote wild-type e eterozigote vs omozigote mutato), o additivo (omozigote wild-type vs eterozigote vs omozigote mutato). L’analisi di regressione logistica è stata utilizzata per identificare gli SNP ed i fattori di rischio associati in maniera

34 indipendente con la comparsa precoce di cardiopatia ischemica. Il valore predittivo di una variabile è stato espresso come odds-ratio (OR) con un intervallo di confidenza al 95% (CI). Solo le variabili che mostravano una p<0.05 all’analisi univariata sono state incluse nei modelli di analisi multivariata. Per gli SNP che hanno mostrato un’associazione statisticamente significativa con la comparsa precoce di cardiopatia ischemica, è stato eseguito il test del rapporto di verosimiglianza (likelihood ratio test). Questo test è stato usato per determinare se i modelli di regressione logistica, basati sull’interazione tra lo SNP ed i fattori di rischio cardiovascolare, si adattavano in maniera significativamente migliore rispetto ai modelli di regressione logistica limitati o ai singoli SNP o ai soli fattori di rischio. In questo caso, la soglia di significatività è stata corretta attraverso la correzione di Bonferroni per 42 test multipli (7 fattori di rischio x 6 SNP = 42). La significatività statistica risultava per p = 0.05/42 = 0.0012.

Uno score di rischio genetico (GRS) è stato calcolato con i 6 SNP che mostravano un'associazione significativa (p<0.05) con la comparsa precoce di cardiopatia ischemica. Abbiamo ipotizzato che ogni SNP contribuisse in maniera uguale al rischio di insorgenza della patologia e abbiamo calcolato il GRS sommando il numero di alleli di rischio in ogni locus secondo un modello genetico additivo: abbiamo considerato 2 unità se il paziente era omozigote per l'allele ad alto rischio, 1 unità se il paziente era eterozigote e 0 se il paziente era omozigote per l'allele a basso rischio. Lo score genetico è stato analizzato come variabile continua ed è stato anche suddiviso in terzili. Infine, è stata effettuata un’analisi di regressione multivariata, considerando come end-point l’età, al fine di valutare il contributo indipendente di fattori clinici e genetici

35 sull'età di insorgenza della cardiopatia ischemica tra i pazienti arruolati per lo studio.

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4.

Risultati