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Effetto combinato di polimorfismi genetici ad alto rischio ed esordio precoce di cardiopatia ischemica in una coorte italiana di pazienti ischemici

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UNIVERSITÀ DI PISA

FACOLTÀ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

Corso di Laurea Magistrale in Biologia Molecolare e Cellulare

TESI DI LAUREA

Effetto combinato di polimorfismi genetici ad alto rischio ed esordio precoce di cardiopatia ischemica in una

coorte italiana di pazienti ischemici

Candidata: Arianna Bariti

ANNO ACCADEMICO 2012/2013 Relatori:

Dott.ssa Maria Grazia Andreassi

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INDICE

Riassunto pag.1

Abstract pag.3

1. Introduzione pag.5

1.1 La genetica dei tratti complessi: i polimorfismi genetici pag.7 1.2 La genetica della Cardiopatia Ischemica pag.8

1.2.1 APOC3 pag.10 1.2.2 CETP pag.11 1.2.3 NOS3 pag.11 1.2.4 SELE pag.12 1.2.5 MMP3 pag.12 1.2.6 FGB1 pag.13 1.2.7 MTHFR pag.13 1.2.8 IL6 pag.13 1.2.9 TNFα pag.14 1.2.10 Locus 9p21 pag.14

1.3 Score Multilocus di Rischio Genetico pag.15

2. Scopo della tesi pag.17

3. Materiali e Metodi pag.18

3.1 Popolazione di Studio pag.18

3.2 Estrazione del DNA totale pag.21

3.3 Valutazione quantitativa del DNA totale pag.21

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3.4.1 Analisi genetica per i polimorfismi dei geni: APOC3,

CETP, NOS3, SELE, MMP3, MTHFR, IL6, TNFα pag.22

3.4.1.1 Elettroforesi su gel d’agarosio pag.23

3.4.1.2 Digestione con enzimi di restrizione pag.24

3.4.2 Analisi genetica per il polimorfismo

del locus 9p21.3 pag.25

3.4.3 Analisi genetica per il polimorfismo

del gene FGB1 pag.26

3.4.3.1 Amplificazione genica pag.27

3.4.3.2 Purificazione del prodotto di PCR pag.28

3.4.3.3 Misura spettrofotometrica del prodotto di PCR pag.28 3.4.3.4 Analisi di Sequenza pag.29

3.5 Analisi Statistica pag.33

4. Risultati pag.36

4.1 Caratteristiche della popolazione di studio pag.36

4.2 SNP e Cardiopatia Ischemica ad esordio precoce pag.37

4.3 SNP determinanti per l’esordio precoce di Cardiopatia

Ischemica pag.39

4.4 Interazione tra SNP e fattori di rischio pag.40

4.5 Effetto combinato di SNP significativi pag.42

5. Discussione pag.45

6. Conclusioni pag.52

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1

Riassunto

La cardiopatia ischemica (CI) è una delle principali cause di mortalità nei paesi sviluppati. Lo stile di vita e i fattori ambientali giocano un ruolo importante nella fisiopatologia e nelle sue principali complicazioni anche se, i classici fattori di rischio comunemente associati con la malattia cardiovascolare (come il sesso maschile e l’abitudine al fumo), spiegano solo una piccola parte degli eventi cardiaci ischemici. La genetica sembra giocare un ruolo chiave nell’evento cardiaco ischemico soprattutto nelle sue manifestazioni precoci.

Diversi polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) sono stati identificati in studi di associazione genome-wide o in studi di associazione sui geni candidati, ma uno specifico genotipo di rischio deve essere ancora identificato. L'obiettivo di questo studio è stato quello di esaminare se 10 SNP, precedentemente indicati come ad alto rischio, erano associati all'insorgenza precoce di CI. Sono stati studiati 114 pazienti con esordio precoce di cardiopatia ischemica (93 maschi, 46.2 ± 5.1 anni) e 384 pazienti con insorgenza tardiva di CI (339 maschi, 60.7 ± 5.9 anni). Tutti i pazienti sono stati genotipizzati per i 10 SNP selezionati (APOC3 -482 C>T, CETP Taq1B G>A, NOS3 -786 T>C, FGB1 Ser189Ser, IL6 -572 G>C, MTHFR C677T, SELE G98T, MMP3 1171 5A>6A, TNFα -850 C>T, locus 9p21.3 C>G). Poi, sono state valutate le associazioni tra i singoli SNP e l’insorgenza precoce di cardiopatia ischemica. Infine, è stato costruito uno score multilocus di rischio genetico (GRS) per ogni marcatore di rischio genetico sommando il numero di alleli di rischio. I polimorfismi associati in maniera significativa con la cardiopatia ischemica ad esordio precoce erano: il polimorfismo -482 C>T del gene dell’Apolipoproteina C3 (APOC3, OR = 1.7

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2 95% CI 1.1-2.7, p = 0.02), il 1171 5A>6A del gene della Metallopeptidasi di matrice 3 (MMP3, OR = 1.8 95% CI 1.1-3.0, p = 0.01), G98T del gene della E-selectina (SELE, OR = 2.0 95% CI 1.0-4.3, p = 0.05), il C>G del locus9p21.3 (OR = 2.2 95% CI 1.2-4.2, p = 0.01).

Il test del rapporto di verosimiglianza (likelihood ratio test) ha mostrato una forte interazione tra la comparsa precoce di cardiopatia ischemica e la presenza del polimorfismo dell’APOC3 e del locus9p21.3 con ipertrigliceridemia (p = 0.0008 e p = 0.0011) e tra il polimorfismo del locus 9p21.3 e il fumo (p = 0.0010) dopo la correzione per test multipli. L'analisi logistica multivariata ha trovato un aumento di rischio di esordio precoce di CI pari a 1.3 volte (95% CI 1.1-1.6, p = 0.001) per unità di score di rischio genetico. Dopo suddivisione dei valori di GRS in terzili, i pazienti nel terzile più alto (III terzile) mostravano un aumento di 3.2 volte (CI 95 % 1.5-6.8; p = 0.001) del rischio di sviluppare precocemente cardiopatia ischemica rispetto a quelli nel terzile più basso (I terzile). Questi risultati suggeriscono che gli SNP identificati ad alto rischio possono costituire un biomarker additivo per eventi cardiovascolari ischemici. Inoltre, lo score di rischio genetico può aggiungere importanti informazioni sulla componente genetica della cardiopatia ischemica.

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Abstract

Ischemic heart disease (IHD) is the major cause of mortality in developed countries. The lifestyle and environmental factors play an important role in the pathophysiology and its major complications but, the classical risk factors commonly associated with cardiovascular disease (such as male sex, and smoking status) explain only a small proportion of cardiac ischemic events. Genetics appears to play a key role in cardiac ischemic event, especially in its early manifestations.

Several single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified in genome-wide association studies or association studies on candidate genes, but a specific risk genotype has yet to be identified. The objective of this study was to examine if 10 SNPs previously identified as high-risk were associated with early-onset IHD. We studied 114 patients with early onset ischemic heart disease (93 males, 46.2 ± 5.1 years) and 384 patients with late onset IHD (339 males, 60.7 ± 5.9 years). All patients were genotyped for the 10 selected SNPs (APOC3 -482 C>T, CETP Taq1B G>A, NOS3 -786 T>C, FGB1 Ser189Ser, IL6 -572 G>C, MTHFR C677T, SELE G98T, MMP3 1171 5A>6A, TNFα -850 C>T, locus 9p21.3 C>G). Then, I tested the associations between individual SNPs and the early onset of ischemic heart disease. Finally, one multilocus genetic risk score (GRS) for each marker of genetic risk by summing the number of risk alleles has been constructed. The SNPs significantly associated with IHD were: -482 C>T of Apolipoprotein C3 gene (APOC3, OR = 1.7 95% CI 1.1-2.7 , p = 0.02), 1171 5A>6A of Matrix metalloproteinase 3 stromelisine I gene (MMP3, OR = 1.8 95% CI 1.1-3.0, p = 0.01), G98T of E-selectin gene (SELE, OR = 2.0

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4 95% CI 1.0-4.3, p = 0.05), C>G of locus9p21.3 (OR = 2.2 95% CI 1.2-4.2, p = 0.01).

The likelihood ratio test showed a strong interaction for increasing risk of early IHD between the presence of APOC3 and locus 9p21.3 with hypertriglyceridemia (p = 0.0008 and p = 0.0011) as well as between locus 9p21.3 and smoking (p = 0.0010) after correction for multiple testing. The OR for premature IHD for GRS unit was 1.3 (95 % CI 1.1-1.6, p = 0.001) for GRS unit. After division of the score values in genetic tertiles, patients in the highest tertile (III tertile) of the GRS showed an increase of 3.2-fold (95% CI 1.5-6.8 , p = 0.001) in the risk of developing early coronary artery disease compared to those in the lowest tertile (I tertile). These results show that currently identified high-risk SNPs confer an additive biomarker for cardiovascular events. In addition, the genetic risk score can add important information on the genetic component of ischemic heart disease.

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5

1.

Introduzione

La cardiopatia ischemica rappresenta la principale causa di mortalità e morbilità nei paesi industrializzati e in quelli in via di sviluppo (Go et al., 2013). Con il termine cardiopatia ischemica si indicano malattie a diversa eziologia, in cui il fattore fisiopatologico unificante è rappresentato da uno squilibrio tra richiesta e apporto di ossigeno al miocardio. Questo squilibrio causa un’alterazione sia dell’attività elettrica sia della capacità contrattile delle zone colpite.

Le manifestazioni cliniche della cardiopatia ischemica sono fondamentalmente:

 l’angina pectoris in cui l’ischemia è di breve durata, reversibile e non provoca un danno anatomico permanente. Nel caso in cui l’ischemia miocardica non si associ a sintomi, si parla di ischemia silente;

 l’infarto del miocardio, che consegue ad un’ischemia miocardica protratta, e porta ad un danno cellulare irreversibile o a necrosi miocardica.

La cardiopatia ischemica è una patologia ad eziologia multifattoriale, derivante cioè dall’interazione tra fattori di rischio ambientali e genetici. Gli studi epidemiologici, tra cui il più recente INTERHEART Study, hanno chiaramente definito il ruolo dei fattori di rischio ambientali in popolazioni provenienti da differenti aree geografiche e di diverse etnie (Yusuf et al., 2004).

Lo stile di vita e i fattori ambientali giocano un ruolo importante nella patofisiologia della cardiopatia ischemica, anche se i classici fattori di rischio ad essa associati, come il fumo e il sesso maschile, riescono a spiegare solo una parte della patogenesi della malattia cardiaca di tipo ischemico (Yusuf et al., 2004).

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6 E’ noto che la familiarità per cardiopatia ischemica è un fattore di rischio indipendente e significativamente associato al rischio di infarto miocardico. Infatti, i fratelli di pazienti con infarto miocardico hanno un rischio da 2 a 11 volte più alto rispetto ai soggetti senza familiarità, così come la probabilità di sviluppare tale patologia è più alta nei gemelli monozigoti, che condividono lo stesso patrimonio genetico, rispetto ai gemelli dizigoti (Marenberg et al., 1994; Zdravkovic et al., 2002; Murabito et al., 2005).

Riconosciuta questa familiarità, nell’ultimo decennio sono stati effettuati numerosi studi, sia su geni candidati sia di analisi di linkage, per identificare varianti genetiche associate al rischio di infarto miocardico. I risultati sono stati poco incoraggianti, perché le varianti genetiche analizzate riescono a spiegare solo una minima parte (<1%) dei casi di malattia e le varianti genetiche più frequentemente rappresentate nella popolazione non sono state riprodotte in altri studi (Morgan et al., 2007). Questo probabilmente perché la cardiopatia ischemica, e l’infarto del miocardio in particolare, sono patologie complesse, cioè malattie comuni causate da più geni che interagiscono tra loro e con i fattori ambientali, creando un gradiente di suscettibilità genetica alla patologia. Per cui, anche se è noto che la componente genetica gioca un ruolo chiave e negli ultimi anni sono stati identificati diversi polimorfismi genetici a singolo nucleotide (SNP) associati a tale patologia - specialmente alle sue manifestazioni più precoci -, un unico pannello di geni associato ad un maggior rischio di sviluppare la malattia cardiaca ischemica deve essere ancora identificato.

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1.1 La genetica dei tratti complessi: i polimorfismi genetici

Quando si parla di malattie complesse, da un punto di vista genetico si parla sia di mutazione sia di polimorfismo genetico. La mutazione è un evento raro che causa la malattia, anche se con possibili variazioni nell’espressione del fenotipo, con frequenze nelle popolazioni inferiori allo 0.05%. Si definisce, invece, polimorfismo genetico una variazione con una frequenza nella popolazione superiore allo 0.05%. I polimorfismi genetici possono essere presenti sia all’interno di regioni codificanti che non codificanti e possono essere determinati da sostituzioni, delezioni o inserzioni di singole basi o di sequenze di DNA. Si stima che ci sia un polimorfismo genetico ogni 300 nucleotidi e che circa l’1% di questi non sia silente, ma si traduca in variazioni fenotipiche. In particolare, gli SNP possono essere responsabili di una modificazione (qualitativa o quantitativa) di proteine con una funzione nota che, se alterata, può spiegare la suscettibilità individuale verso lo sviluppo di una data patologia.

Nel corso degli ultimi anni, la conoscenza del genoma umano ha ampliato enormemente le informazioni sul corredo genetico individuale. Abbiamo appreso che ogni persona ha il 99.9% di identità genetica di una qualsiasi altra. È il restante 0.1% del nostro DNA che rappresenta la variabilità individuale, che, sostanzialmente, è dovuta alla presenza dei polimorfismi genetici.

Ad oggi, sono stati identificati circa 3 milioni di SNP, ma si calcola che ve ne siano almeno 10 milioni. È ormai riconosciuto che gruppi di queste piccole variazioni conferiscano una predisposizione o suscettibilità allo sviluppo di una patologia, che può manifestarsi in età precoce quando profili genetici a rischio “elevato” interagiscono con fattori ambientali o stili di vita particolari.

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1.2 La genetica della Cardiopatia Ischemica

La genetica del rischio cardiovascolare è particolarmente articolata, in quanto modelli sperimentali animali hanno identificato più di 100 geni che sembrano essere coinvolti nella progressione della malattia (Lusis et al., 2004a). D’altra parte sia i “tradizionali” fattori di rischio cardiovascolare, quali l’ipercolesterolemia, l’ipertensione, il diabete mellito e l’obesità, che i “nuovi” fattori di rischio indipendenti, quale la proteina C reattiva, il fibrinogeno, l’omocisteina e la lipoproteina(a) hanno una forte componente genetica (Lusis et al., 2004a). Vi è poi da considerare il fatto che i fattori di rischio genetico possono interagire tra loro, moltiplicando così il rischio globale e non semplicemente addizionandosi l’un l’altro. Un altro aspetto da tenere in considerazione è che alcuni sistemi enzimatici, che possono regolare il metabolismo di farmaci utilizzati nel trattamento delle malattie cardiovascolari (come il metaprololo e il warfarin), sono regolati geneticamente (Pillans, 2001; Mango et al., 2005). I sistemi più studiati sono quelli che classicamente sono considerati coinvolti nella patogenesi della cardiopatia ischemica: il metabolismo lipidico, la funzione endoteliale, il sistema emostatico, il metabolismo dell’omocisteina e il sistema renina-angiotensina (Tang et al., 2001). Tuttavia, ancora oggi non sono completamente conosciuti i geni che determinano un aumento del rischio di malattia cardiaca ed è ancora indispensabile acquisire ulteriori informazioni prima di ottenere strumenti utilizzabili nella prassi clinica.

Sono state identificate numerose varianti genetiche comuni associate alla cardiopatia ischemica. Già nel 1992, è stato identificato uno stretto legame tra il polimorfismo I/D nel gene dell’enzima di conversione dell’angiotensina 1 (ACE,

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9 angiotensin-converting enzyme) e l’infarto del miocardio, che ha dato inizio ad un’ampia area di ricerca (Cambien et al., 1992). Da allora altri studi hanno testato la rilevanza funzionale di questa variante, dimostrando un aumento di rischio dell’infarto del miocardio associato con la variante I/D dell’ACE (Schunkert et al., 1994; Schunkert et al., 1998; Holmer et al., 2003).

Molti altri geni o varianti sono stati esaminati, ma solo una piccola parte di essi viene riconfermata in modo significativo in tutti gli studi come variante/gene avente un ruolo chiave nella malattia coronarica o nella suscettibilità genetica ai suoi fattori di rischio (Fig.1) (Lusis et al., 2004c).

Figura 1: Alcuni dei geni candidati per la suscettibilità alla malattia coronarica e alcuni pathway che si pensa possano essere coinvolti

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10

nell’accrescimento e nella rottura delle lesioni aterosclerotiche negli stadi precoci della formazione della lesione. I geni con un’evidenza preliminare di associazione con la malattia coronarica sono mostrati in rosso (da Lusis et al., 2004c)

Altri studi di associazione hanno individuato altri polimorfismi in geni implicati in varie funzioni che potrebbero essere associati con l’insorgenza della patologia cardiaca ischemica (Lusis et al., 2004a; Lusis et al., 2004b; Chanock et al, 2007; Yamada et al., 2008). Tra questi ci sono: geni strettamente coinvolti nel metabolismo lipidico come l’APOC3 e il CETP; geni implicati nello sviluppo della placca aterosclerotica come il gene NOS3 e il gene SELE (codificante per la E-Selectina, una molecola di adesione cellulare espressa solo sulle cellule endoteliali); il gene MMP3 implicato nella sintesi di una proteina coinvolta nel rimodellamento della matrice extracellulare; geni strettamente implicati nella patologia trombotica come il FGB1 e l’MTHFR; geni coinvolti nella risposta infiammatoria come l’IL6 e il TNFα. Più recentemente studi di associazione genome-wide (GWA) hanno identificato il locus 9p21.3 come il locus genetico più strettamente legato alla cardiopatia ischemica (sia all’infarto miocardico che alla malattia coronarica aterosclerotica).

1.2.1 APOC3

L'Apolipoproteina C3 (APOC3) esercita un ruolo importante nel metabolismo dei lipidi, inibendo il metabolismo del triacilglicerolo ad opera dell'enzima lipoproteina lipasi, con conseguente incremento del livello di trigliceridi (ipertrigliceridemia). Vari polimorfismi di questo gene sono associati ad un

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11 aumentato rischio di ipertrigliceridemia e ad un elevato rischio di insorgenza di infarti, aterosclerosi e patologia cardiovascolare (Newman et al., 2004; Xu et al., 1994).

1.2.2 CETP

La CETP è coinvolta nel metabolismo dei lipidi, mediando lo scambio di lipidi tra lipoproteine, attraverso il trasferimento di esteri del colesterolo dalle HDL alle lipoproteine ricche di trigliceridi, con conseguente riduzione dei livelli di HDL. Il polimorfismo dell’introne 1 del gene CETP (Taq1B G>A) porta ad un’aumentata espressione del gene con conseguente riduzione dei livelli di HDL ed aumento di LDL e VLDL (Boekholdt et al., 2005; McCaskie et al., 2007). Recentemente uno studio condotto su una popolazione cinese ha evidenziato una stretta associazione tra il polimorfismo G>A, presente nell’introne 1 del gene, e l’aterosclerosi coronarica (Wang et al., 2013).

1.2.3 NOS3

Il gene NOS3 codifica per un enzima, l’ossido nitrico sintetasi 3 (o ossido nitrico sintetasi endoteliale), coinvolto nella produzione di ossido nitrico (NO), un radicale libero in grado di promuovere la vasodilatazione, regolando così il flusso sanguigno e la pressione arteriosa, e di conferire tromboresistenza e, più in generale, protezione sull’endotelio dei vasi sanguigni. Due polimorfismi di questo gene, il -786 T>C presente nel promotore e il Glu298Asp, sono stati studiati in popolazioni con malattia coronarica e sono stati trovati significativamente associati alla malattia coronarica indipendentemente dai

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12 classici fattori di rischio cardiovascolare (Rossi et al., 2003; Colombo et al., 2003).

1.2.4 SELE

Il gene SELE codifica per una proteina (la E-selectina) che lega i carboidrati e che è solitamente espressa sulle cellule endoteliali attivate e sulle piastrine (Tedder et al., 1995). La E-selectina facilita il legame tra cellule endoteliali e leucociti, portando alla patogenesi di malattie trombovascolari (Cherian et al., 2003). È stata rilevata la presenza di diversi SNP nel gene della E-selectina (Wenzel et al., 1999). anche se l’associazione tra questi polimorfismi e la cardiopatia ischemica risulta tutt’ora incerta, in particolare quando vengono considerate popolazioni di diversa etnia (Auer et al., 2003; Lynch et al., 2012; Shirakawa et al., 2012).

1.2.5 MMP3

La metallopeptidasi di matrice 3, nota anche come stromelisina 1, ha un’attività proteolitica su diverse macromolecole della matrice extracellulare, come differenti tipi di collagene, e facilita la conversione di altre metallopeptidasi di matrice, come la collagenasi-1 (MMP-1), dalla loro forma inattiva a quella funzionale (Jones et al., 2003; Newby, 2005; Ye, 2006; Kaplan et al., 2008). Nella zona del promotore del gene MMP3, in particolare a 1612 pb a monte del sito di inizio della trascrizione, è stato individuato un polimorfismo di tipo delezione/inserzione che influenza l’attività enzimatica di MMP-3 ed è stato visto essere associato con infarto del miocardio (Liu et al., 2003; Wu et al., 2009; Ghaderian et al., 2010).

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1.2.6 FGB1

La proteina codificata da questo gene è il componente beta del fibrinogeno, una glicoproteina ematica composta da tre coppie di catene polipeptidiche non identiche. Dopo un trauma vascolare, il fibrinogeno è scisso dalla trombina per formare fibrina, che è il componente più abbondante nei coaguli di sangue. Negli ultimi anni diversi studi hanno mostrato un’associazione tra vari SNP del gene FGB1 e infarto del miocardio (Jacquemin et al., 2008; Tousoulis et al., 2011).

1.2.7 MTHFR

Il gene MTHFR codifica per un enzima, la metilentetraidrofolatoreduttasi (MTHFR), coinvolto nella trasformazione del 5,10-metilentetraidrofolato in 5-metiltetraidrofolato, che serve come donatore di metili per la rimetilazione della omocisteina a metionina. Rare mutazioni in questo gene possono causare la deficienza grave di MTHFR, riducendo così la sua attività enzimatica fino al 20% e causando l’aumento di omocisteina nel sangue, un comune fattore di rischio per la malattia cardiovascolare (Trimmer, 2013). In diversi studi il polimorfismo C677T del gene MTHFR è risultato essere correlato con la malattia coronarica e con eventi avversi cardiaci maggiori (MACE) (Andreassi et al., 2003; Botto et al., 2004; Andreassi et al., 2012).

1.2.8 IL6

Il gene IL6 codifica per una citochina, l’interleuchina 6, che ha un ruolo nell'infiammazione e nella maturazione delle cellule B. L’interleuchina 6 ha dimostrato di essere un pirogeno endogeno capace di indurre febbre in persone

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14 con malattie autoimmuni o infezioni. È prodotta principalmente nei siti di infiammazione acuta e cronica, dove viene secreta nel siero e induce una risposta infiammatoria trascrizionale attraverso il suo recettore. Il funzionamento di questo gene è implicato in una grande varietà di stati patologici associati all'infiammazione, come la suscettibilità al diabete mellito e all’artrite reumatoide giovanile sistemica. Polimorfismi nel gene IL6 sono stati associati con la malattia coronarica e in particolare con la cardiopatia ischemica ad esordio precoce (Maitra et al., 2008; Fragoso et al., 2010; Tong et al., 2013).

1.2.9 TNFα

Il gene TNFα, fattore di necrosi tumorale α, codifica per una citochina coinvolta nell'infiammazione sistemica ed è membro di un gruppo di citochine che stimolano la reazione della fase infiammatoria acuta. Il TNF è coinvolto in numerosi processi come l’apoptosi, la proliferazione e il differenziamento cellulare, la cancerogenesi e la replicazione virale. Studi prospettici suggeriscono che livelli elevati di TNFα sono predittori indipendenti del primo evento di malattia cardiovascolare (Cesari et al., 2003). In particolare, sono stati studiati diversi polimorfismi presenti nel promotore del gene TNFα ed è stata rilevata un’associazione tra tali polimorfismi e l’infarto del miocardio (Bennet et al., 2006).

1.2.10 Locus 9p21

Nel 2007 quattro studi indipendenti hanno documentato, pressoché contemporaneamente, l’associazione fra alcune varianti genetiche ubicate in “linkage disequilibrium” tra loro nella regione cromosomica 9p21.3 e lo sviluppo

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15 di cardiopatia ischemica e infarto miocardico (Burton et al, 2007; Samani et al., 2007; Helgadottir et al., 2007; McPherson et al., 2007). Questi dati sono stati successivamente replicati in varie coorti di differente origine etnica (Assimes et al., 2008; Hinohara et al., 2008; Horne et al., 2008; Schunkert et al., 2008; Shen et al., 2008a; Shen et al., 2008b), a conferma della validità dei risultati ottenuti e sono stati validati in una recente meta-analisi (Palomaki et al., 2010). Il locus di rischio 9p21 si espande per 58000 paia di basi e contiene una sequenza antisenso non codificante, la cui funzione deve essere ancora chiarita.

1.3 Score Multilocus di Rischio Genetico

Dal momento che il rischio attribuibile ad ogni singola variante è ancora modesto, molti studiosi hanno pensato di combinare tra loro diversi loci (ognuno dei quali con modesto effetto) in uno score globale di rischio genetico (GRS), per identificare popolazioni ad alto rischio e per migliorare la valutazione del rischio individuale (Kathiresan et al., 2008; Anderson et al., 2010; Andreassi et al., 2012).

Diverse osservazioni hanno dimostrato una forte associazione tra lo score genetico e il rischio di incidenza della malattia cardiovascolare. Ad esempio in uno studio che includeva 13 SNP associati a malattia coronarica/infarto del miocardio, solo l’utilizzo del GRS permetteva di identificare il 20% degli individui di origine europea che avevano circa il 70% di rischio di avere un primo evento di malattia coronarica (Ripatti et al., 2010). In particolare, gli individui presenti nel quintile più alto del GRS avevano un rischio di sviluppare malattia coronarica 1.66 volte (95% CI 1.33-1.83, p = 7.3x10-10) maggiore rispetto agli

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16 p = 1.9x10-10) maggiore di incorrere nella malattia cardiovascolare e un rischio

1.46 volte (95% CI 1.15-1.86, p = 2.8x10-5) maggiore di avere infarto del

miocardio (Ripatti et al., 2010).

Uno score multilocus di rischio genetico, basato su varianti genetiche definite come fortemente associate al rischio di CI in popolazioni e campioni indipendenti, è stato associato con un aumento lineare del rischio di eventi cardiovascolari in due distinte popolazioni, migliorando la riclassificazione del rischio soprattutto nei soggetti con un rischio coronarico intermedio. In particolare, gli autori hanno mostrato che il GRS era associato in maniera lineare con l’incidenza di malattia coronarica in entrambi le coorti analizzate. Gli individui appartenenti al quintile più alto del GRS presentavano un rischio di malattia coronarica maggiore (di circa 1.5 volte) rispetto a quelli nel quintile più basso (Lluis-Ganella et al., 2012).

Recentemente Malik et al. hanno creato uno score multilocus di rischio genetico derivato da studi di associazione genome-wide su fattori di rischio noti per l’infarto miocardico e hanno trovato un aumento lineare di rischio di infarto attraverso i quintili del GRS (Malik et al., 2014).

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2.

Scopo della tesi

Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di valutare l'impatto, individuale e additivo, di varianti genetiche comuni definite “ad alto rischio” nell’insorgenza precoce di cardiopatia ischemica in una coorte italiana di pazienti con malattia (coronarica ischemica) documentata.

Per raggiungere questo scopo i principali obiettivi sono stati:

 identificazione e analisi genetica di 10 polimorfismi genetici (APOC3 -482 C>T, CETP Taq1B G>A, NOS3 -786 T>C, FGB1 Ser189Ser, IL6 -572 G>C, MTHFR C677T, SELE G98T, MMP3 1171 5A>6A, TNFα -850 C>T, locus 9p21.3 C>G) precedentemente associati allo sviluppo della malattia in una coorte italiana di pazienti con malattia coronarica ischemica documentata;

 analisi di associazioni tra gli SNP selezionati e l’insorgenza precoce di malattia;

 valutazione dell’effetto combinato dei polimorfismi a più alto rischio con l’insorgenza precoce di malattia.

(22)

18

3.

Materiali e Metodi

3.1 Popolazione di Studio

La popolazione oggetto di studio comprende 498 pazienti con diagnosi di cardiopatia ischemica: 114 con esordio precoce della malattia (età ≤50 anni per gli uomini ed età ≤60 anni per le donne) e 384 con esordio tardivo, afferenti all’Istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa. I criteri di inclusione per la scelta dei pazienti comprendevano: storia di infarto del miocardio o angina (considerata una manifestazione iniziale della cardiopatia ischemica), documentazione di ischemia miocardica o documentazione di almeno un vaso malato risultante da coronarografia (riduzione del lume >50%).

Di ogni paziente erano noti i fattori di rischio cardiovascolare: età, sesso, fumo, diabete (glicemia a digiuno> 120 mg/dl), ipercolesterolemia (colesterolo plasmatico> 220 mg/dl), ipertrigliceridemia (trigliceridi plasmatici> 160 mg/dl), obesità (indice di massa corporea> 30 kg/m2), ipertensione arteriosa (pressione

arteriosa sistolica> 140 mmHg e/o pressione diastolica> 90 mmHg) e storia familiare di cardiopatia ischemica. Questi parametri sono stati codificati in maniera dicotomica. Informazioni sulla funzione ventricolare sinistra sono state ottenute mediante ecocardiografia o angiografia ventricolare sinistra. In Tabella 1 vengono riportate le caratteristiche cliniche della popolazione di studio.

(23)

19

Tabella 1: Caratteristiche cliniche della popolazione di studio

Popolazione (n=498) Età (anni±DS) 57.4±8.3 Sesso maschile, n(%) 432 (87) Fumo, n(%) 317 (64) Diabete, n(%) 65 (13) Ipercolesterolemia, n(%) 348 (70) Ipertrigliceridemia, n(%) 143 (29) Obesità, n(%) 147 (29) Ipertensione (%) 224 (45)

Familiarità per CI, n(%) 270 (54)

Frazione di eiezione(%) 51.8±9.4 N° di vasi affetti 0, n(%) 55 (11) 1, n(%) 186 (37) 2, n(%) 169 (34) 3, n(%) 88 (18)

Ad ogni paziente è stato prelevato un campione di sangue venoso periferico (6mL) in EDTA che è stato usato per l’estrazione del DNA totale. Per ogni soggetto è stata valutata l’analisi dei seguenti polimorfismi genetici: APOC3 -482 C>T, CETP Taq1B G>A, NOS3 -786 T>C, FGB1 Ser189Ser, IL6 -572 G>C, MTHFR C677T, SELE G98T, MMP3 1171 5A>6A, TNFα -850 C>T, locus 9p21.3 C>G (Tab.2).

(24)

20

Tabella 2: Polimorfismi genetici analizzati e frequenze nella popolazione (da 1000 Genomes Project)

Frequenze Europa Frequenze Toscana

Polimorfismo (rs) Omozigote wild-type Eterozigote Omozigote mutato Omozigote wild-type Eterozigote Omozigote mutato APOC3 -482 C>T (rs2854117) C/C 45.6% C/T 48.3% T/T 6.1% C/C 45.9% C/T 48.0% T/T 6.1%

CETP Taq1B G>A

(rs708272) A/A 16.6% G/A 51.2% G/G 32.2% A/A 21.4% G/A 44.9% G/G 33.7% NOS3 -786 C>T (rs2070744) C/C 15.6% C/T 50.4% T/T 34.0% C/C 18.4% C/T 59.2% T/T 22.4% FGB1 Ser189Ser (rs6056) C/C 63.6% C/T 30.9% T/T 5.5% C/C 65.3% C/T 28.6% T/T 6.1% SELE G98T (rs1805193) T/T 0.5% G/T 18.7% G/G 80.7% T/T 0% G/T 21.4% G/G 78.6% MMP3 1171 5A>6A (rs3025058) -/- 21.1% -/A 49.3% A/A 29.6% -/- 24.5% -/A 41.8% A/A 33.7% MTHFR C677T (rs1801133) T/T 13.5% C/T 43.5% C/C 43.0% T/T 25.5% C/T 43.9% C/C 30.6% IL6 -572 G>C (rs1800796) C/C 0% C/G 9.5% G/G 90.5% C/C 0% C/G 9.2% G/G 90.8% TNFα -850 C>T (rs1799724) C/C 84.2% C/T 15.6% T/T 0.2% C/C 76.5% C/T 23.5% T/T 0% Locus 9p21.3 C>G (rs1333049) C/C 22.2% C/G 50.7% G/G 27.2% C/C 22.4% C/G 61.2% G/G 16.3%

Il Comitato Etico Locale (Comitato Etico Sperimentazione Farmaco - Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Italia) ha approvato lo studio e tutti i pazienti

(25)

21 hanno dato il loro consenso informato scritto. La ricerca è stata condotta secondo il principio della Dichiarazione di Helsinki.

3.2 Estrazione del DNA totale

Il DNA di ciascun paziente è stato estratto mediante l’utilizzo del Biorobot EZ1 (QIAGEN) che permette l’estrazione di DNA sia da sangue che da tessuto, in maniera automatica, di 6 campioni in un unico step che prevede:

1. lisi dei campioni

2. legame del DNA a particelle magnetiche 3. lavaggio ed eluizione del DNA

3.3 Valutazione quantitativa del DNA totale

La concentrazione di DNA è stata calcolata utilizzando il Fluorimetro QubitTM

(Invitrogen), sulla base della relazione tra i due standards usati nella calibrazione. Il fluorimetro QubitTM fornisce un valore in ng/μl, che corrisponde alla concentrazione del DNA campione dopo la diluizione, calcolata mediante la seguente formula:

C = QF x 100/X dove:

 QF = valore della lettura del fluorimetro Qubit

 X = numero di μl di campione aggiunti

(26)

22

3.4 Analisi Genetica

3.4.1 Analisi genetica per i polimorfismi dei geni: APOC3, CETP, NOS3,

SELE, MMP3, MTHFR, IL6, TNFα.

L’amplificazione dei frammenti di interesse per i vari polimorfismi è stata ottenuta mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR). Le sequenze relative dei primers specifici, ottenute da studi presenti in letteratura, le rispettive condizioni di PCR e l’ampiezza del frammento amplificato sono riportate in Tabella 3.

I primers per i polimorfismi 1171 5A>6A (MMP3) e -850 C>T (TNFα), risultavano avere una base modificata al 3’ (sottolineata) per creare un sito di riconoscimento specifico per gli enzimi di restrizione Tth111I e HincII, rispettivamente.

La soluzione di reazione, avente un volume finale di 50 μl, conteneva: 1x PCR Buffer, 100 ng di DNA, primers specifici, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs e 1.25

U di Hot Start Taq Polymerase (Euroclone, Milano, Italy). In alcuni casi sono stati aggiunti 8.7% di dimetilsulfossido (DMSO) e 0.6 nmol/ml di albumina sierica bovina (BSA). Il numero di cicli di reazione e la temperatura di "annealing" sono stati ottimizzati e programmati nel seguente modo: denaturazione iniziale a 94°C per 5 minuti, seguita da 35 cicli di amplificazione ciascuno composto da un ciclo di denaturazione a 94°C per 30 secondi, uno di annealing a temperature specifiche per 45 secondi e uno di estensione a 72°C per 45 secondi. L'allungamento finale è stato condotto a 72°C per 10 minuti.

(27)

23

Tabella 3: Primers e condizioni di reazione per i geni analizzati

Gene Primers (5’-3’) T° di Annealing (°C) Lunghezza amplificato Referenza APOC3 (-482 C>T) Forward GAAACCCAGAGATGGAGGTG Reverse TCTCAGCCTTTCACACTGGA 60 234 pb Valenti et al., 2011 CETP (Taq1B G>A) Forward CACTAGCCCAGAGAGAGGAGTGCC Reverse CTGAGCCCAGCCGCACACTAAC TD* 73/63 528 pb Erzeberger et al., 2010 NOS3 (-786 T>C) Forward ATGCTCCCACCAGGGCATCA Reverse GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG TD* 74/64 237 pb Colombo et al., 2003 SELE (G98T) Forward GGATGCTGCCTTAAACATCATGGTA Reverse CCCAAAGTGAGAGCTGAGAGAAACTG 65 174 pb Zhao et al., 2012 MMP3 (1171 5A>6A) Forward GGTTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA Reverse CTTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT 65 129 pb con 5A 130 pb con 6A Gnasso et al., 2000 MTHFR (C677T) Forward TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA Reverse AGGACGGTGCGGTGAGAGTG 68 198 pb Frosst et al., 1995 IL6 (-572 G>C) Forward TGGCAAAAAGGAGTCACACA Reverse CCCAAGCCTGGGATTATGAAG 62 164 pb Zhang et al., 2009 TNFα (-850 C>T) Forward TCGAGTATGGGGACCCCCCGTT Reverse CCAGTGTGTGGCCATATCTTCTT 60 126 pb Laws et al., 2005 * TD: touch down PCR

3.4.1.1 Elettroforesi su gel d'agarosio

La reazione di PCR è stata visualizzata e verificata su un gel di agarosio all'1.5%, contenente bromuro d'etidio 10 mg/ml ad una concentrazione finale di 0.3%. Sono stati caricati su gel 5 μl di prodotto di PCR aggiunti a 2 μl di "loading" buffer (L.B.: 0.25% blu di bromofenolo, 0.25% cilene-cianolo, 15% glicerolo) e un marker di DNA da 100 pb (PRIME). La corsa elettroforetica è

(28)

24 stata condotta a 100V in un tampone TBE 1x (Tris base 4 mM, 0.9 M acido borico, 50 mM EDTA, a pH 8).

3.4.1.2 Digestione con enzimi di restrizione

I prodotti di amplificazione ottenuti sono stati conservati a 4°C fino al momento della digestione. A 5 μl di prodotto di PCR sono stati aggiunti 3 μl di acqua sterile, 1.5 μl di Buffer CutSmart 1X (50 mM Acetato di Potassio, 20 mM Tris-acetato, 10 mM Acetato di Magnesio, 100 μg/ml BSA, a pH 7.9) e 0.5 μl di enzima di restrizione specifico per ogni polimorfismo. La miscela di reazione è stata incubata overnight a temperature specifiche. In Tabella 4 sono riportati gli enzimi di restrizione utilizzati, le relative temperature di incubazione e le dimensioni dei frammenti ottenuti in base al genotipo.

La visualizzazione dei frammenti originati è stata effettuata attraverso una corsa elettroforetica su gel d’agarosio al 2%, condotta a 100V per un tempo dipendente dalle dimensioni dei frammenti.

(29)

25

Tabella 4: Enzimi di restrizione, temperature di incubazione e frammenti originati

3.4.2 Analisi genetica per il polimorfismo del locus 9p21.3

L’analisi del polimorfismo C>G del locus 9p21.3 è stata effettuata mediante la Real-Time PCR utilizzando la metodica TaqMan (Applied Biosystems), una tecnica di rivelazione basata sull’ibridazione di oligonucleotidi fluorescenti (Fig.2). Gene e polimorfismo Enzima di restrizione Temperatura di digestione dell’enzima Frammenti originati (pb) APOC3 -482 C>T MspI 37°C T:171-63 C:155-63-16 CETP

Taq1B G>A TaqI 65°C

G: 354-174 A:528 NOS3 -786 T>C NaeI 37°C C: 202-35 T:237 SELE G98T HphI 37°C G: 127-47 T:174 MMP3 1171 5A>6A Tth111I 65°C 5A: 96-33 6A: 130 MTHFR C677T TaqI 65°C C:198 T: 173-25 IL6 -572 G>C MbiI 37°C G: 89-75 C:164 TNFα -850 C>T HincII 37°C C: 104-22 T:126

(30)

26

Figura 2: Rappresentazione dei possibili genotipi, evidenziati dall’analisi con Real-Time e utilizzo di sonde TaqMan.

Le sequenze dei primers (5’-3’) erano TCACTACCCTACTGTCATTCCTCAT e TTGCTTACCTCTGCGAGTGG mentre le sonde erano VIC-CAACAGTTCAAAAGCA e FAM-AACAGTTGAAAAGCA. La reazione è stata ottimizzata in un volume di 5 μl contenente 2.5 μl di TaqMan Universal PCR Master Mix, 0.125 μl di TaqMan MGB Assay Mix, e 20/25 ng di DNA genomico. È stato applicato il seguente ciclo termico: 10 minuti a 95°C (fase di attivazione), seguiti da 40 cicli da 15 secondi ciascuno a 92°C (fase di denaturazione del DNA) e 1 minuto a 60°C (fase di annealing/estensione), come precedentemente descritto (Wang et al., 2010; Phababpha et al, 2013).

3.4.3 Analisi genetica per il polimorfismo del gene FGB1

La genotipizzazione per il polimorfismo Ser189Ser del gene FGB1 è stata ottenuta con l’impiego della piattaforma ad alta processività “Genomelab GeXP Genetic Analysis System” (Beckman) mediante il kit commerciale SNPStart

(31)

27 Primer Extension Kit. Tale protocollo prevede passaggi in serie: amplificazione genica, purificazione dell’amplificato, misura spettrofotometrica del prodotto di PCR e analisi genotipica.

3.4.3.1 Amplificazione genica

L'amplificazione della porzione d'interesse per il gene FGB1 è stata ottenuta tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR) secondo il protocollo già descritto. Le sequenze specifiche dei primers, disegnate attraverso l’utilizzo del software Primer3 (http://primer3.ut.ee/), e le relative condizioni di reazione sono

riportate in Tabella 5.

Tabella 5: Primers e condizioni di PCR

Gene Primer Forward (5’-3’) Primer Reverse (5’-3’) T° di Annealing (°C) Lunghezza Amplificato FGB1 (Ser189Ser) CCTCAGAACTGGAA AAGCACC CTTTGCCAGACACCA CAGGA 65 201 pb

Per l’utilizzo dello SNPStart Primer Extension Kit è stato necessario disegnare dei primers specifici, chiamati Interrogation Primers che devono essere lunghi tra le 25 e le 35 pb, avere una temperatura di annealing tra i 65°C e i 75°C e la loro sequenza deve terminare una base prima del polimorfismo di interesse. Le sequenze di questi primers, le condizioni di reazione e la lunghezza dell’amplificato sono riportati in Tabella 6.

(32)

28

Tabella 6: Interrogation Primers e condizioni di PCR

Gene Interrogation Primer Forward (5’-3’) Interrogation Primer Reverse (5’-3’) T° di Annealing (°C) Lunghezza Amplificato FGB1 (Ser189Ser) GCACCAATTAT ATATAGATGAG ACTGTGAATAG TGAACGAAGCA CACGAAGGTTA GTTGGGATATT 67 67 pb

3.4.3.2 Purificazione del prodotto di PCR

Al fine di ottenere un buon esito di sequenziamento, è stato utilizzato il kit commerciale di purificazione della PCR "Euro GOLD Cycle Pure Kit", che rimuove dai prodotti di PCR enzimi, oligonucleotidi, primers, dimeri di primers e sali.

Il kit prevedeva 3 passaggi:

1. legame reversibile del DNA alla matrice di silice presente all'interno della colonnina mediante l'uso del Binding Buffer XP1

2. lavaggio del DNA da proteine, sali e nucleotidi liberi mediante SPW Wash Buffer diluito con etanolo 100%

3. eluizione del DNA purificato con Elution Buffer.

3.4.3.3 Misura spettrofotometrica del prodotto di PCR

La concentrazione di DNA è stata calcolata utilizzando il Fluorimetro QubitTM

(33)

29

3.4.3.4 Analisi di Sequenza

La genotipizzazione è stata effettuata utilizzando la piattaforma ad alta processività "GenomeLab GeXP Genetic Analysis System" (Beckman) (Fig.3).

Figura 3: Sequenziatore automatico CEQ8800 (Beckman); SNPStart Primer Extension Kit ed esempio di picchi ottenuti.

Lo strumento è un analizzatore genetico automatizzato, capace di determinare la sequenza delle basi, o misurare e quantizzare i frammenti di DNA. I

(34)

30 frammenti di DNA corrono lungo un capillare e vengono rilevati, in modo automatico, attraverso una luce laser di lunghezza d'onda tale da eccitare la fluorescenza dei ddNTPs marcati ed aggiunti alla PCR di sequenza. Durante questa fase i fluorocromi legati al DNA vengono eccitati da un laser ed emettono luce a lunghezze d’onda specifiche per ciascun fluorocromo. Tale luce viene registrata da una camera in modo che tutti i tipi di fluorescenza (relativi ai differenti fluorocromi utilizzati) possano essere evidenziati contemporaneamente. La posizione del picco è indice del peso molecolare del frammento, l’altezza dei picchi è un indice grossolano della quantità del prodotto amplificato, il colore consente di distinguere i diversi nucleotidi. Per ogni campione analizzato vengono fatte due reazioni di PCR, una contenente l’Interrogation Primer F e l’altra con l’Interrogation Primer R.

La reazione di primer extension è stata effettuata nelle seguenti condizioni:

H2O 0-4.5 μl DNA Purificato 0.5-5.0 μl Interrogation Primer (0.2μM) 1.0 μl SNPStart Master Mix 4.0 μl Volume finale 10 μl

La quantità di DNA (in μl) e di H2O sono state calcolate sulla base della lettura del fluorimetro QubitTM.

Il programma di PCR è stato di 25 cicli così organizzati:

(35)

31

 45°C per 20 secondi

La miscela di reazione è stata purificata con una mix composta da 0.25 μl di fosfatasi alcalina (SAP) (1U/μl), 1.30 μl di SAP Buffer e 1.45 μl di acqua sterile. I campioni sono stati incubati a 37°C per 30 minuti e poi a 65°C per 15 minuti per inattivare l’enzima SAP.

Dopo la purificazione, il campione è stato preparato per il caricamento di una piastra costituita da 96 pozzetti, in cui sono stati aggiunti 5 μl di miscela di reazione purificata, 0.5 μl di Size Standard 80 e 39.0 μl di Sample Loading Solution. Il CEQ Size Standard 80 conteneva due frammenti di 20 e 80 nucleotidi marcati con fluorocromo rosso, che sono stati utilizzati come riferimento per l’analisi dei picchi. L’ampiezza ottimale dei picchi ottenuti doveva infatti essere compresa tra gli standard, fattore essenziale per la convalida del dato. La piastra è stata poi inserita nel sequenziatore automatico; la durata della corsa dipendeva dalla quantità di campioni caricati. In media per 8 campioni la durata era di circa 1 ora e 30 minuti. L’analisi dei dati è stata effettuata attraverso l’utilizzo di un software specifico, SNP Software Update, inserendo parametri modificabili in base al tipo di polimorfismo studiato. Ad esempio, è stato possibile selezionare solo i picchi dei nucleotidi di interesse per una miglior lettura del dato.

Il protocollo completo di analisi degli SNP mediante la piattaforma ad alta processività CEQ8800 (Beckman) è schematizzato in Figura 4.

(36)

32

DNA genomico

Prodotto PCR

Purificazione prodotto PCR

PCR con ddNTP marcati con fluorofori Uso degli Interrogative primers

Prodotto PCR marcato

Purificazione prodotto PCR con SAP (fosfatasi alcalina)

37 C 30 minuti 65 C 15 minuti

Preparazione piastra Analisi dati

PCR

PCR con ddNTPs marcati con fluorofori Uso degli Interrogation Primers

(37)

33

3.5 Analisi Statistica

I valori sono presentati come media ± deviazione standard (SD). L’analisi del Chi-quadro (χ2

) è stata utilizzata per confrontare i dati categoriali e per individuare deviazioni dall’equilibrio di Hardy-Weinberg. I dati continui sono stati confrontati utilizzando 0test a due code, cioè il t-test di Student per dati non appaiati e l’analisi della varianza quando sono stati confrontati più gruppi. Abbiamo effettuato uno studio di associazione di tipo caso-controllo in due sottoinsiemi dei soli casi, definiti da soglie di età di insorgenza della malattia cardiaca ischemica (cut-off età ≤50 anni per gli uomini ed età ≤60 anni per le donne, come da letteratura). In queste condizioni, dato un campione di 114 casi con insorgenza precoce di cardiopatia ischemica e 384 pazienti con insorgenza tardiva di cardiopatia ischemica (un rapporto caso-controllo 1:3) e SNP che mostrano una MAF> 10%, il nostro studio aveva una potenza > 80% di individuare associazioni significative. Inoltre, avendo effettuato uno studio di soli casi è stata ottenuta una potenza maggiore rispetto ad uno studio caso-controllo. Nello studio di associazione dei vari SNP con l’esordio di malattia, non è stata applicata la correzione di Bonferroni per test multipli, al fine di evitare errori di tipo II che possono anche contribuire a importanti bias di pubblicazione. Perciò un’associazione è stata considerata significativa se presentava un p-value inferiore a 0.05.

Ogni genotipo è stato valutato in base al modello genetico dominante (omozigote wild-type vs eterozigote e omozigote mutato), recessivo (omozigote wild-type e eterozigote vs omozigote mutato), o additivo (omozigote wild-type vs eterozigote vs omozigote mutato). L’analisi di regressione logistica è stata utilizzata per identificare gli SNP ed i fattori di rischio associati in maniera

(38)

34 indipendente con la comparsa precoce di cardiopatia ischemica. Il valore predittivo di una variabile è stato espresso come odds-ratio (OR) con un intervallo di confidenza al 95% (CI). Solo le variabili che mostravano una p<0.05 all’analisi univariata sono state incluse nei modelli di analisi multivariata. Per gli SNP che hanno mostrato un’associazione statisticamente significativa con la comparsa precoce di cardiopatia ischemica, è stato eseguito il test del rapporto di verosimiglianza (likelihood ratio test). Questo test è stato usato per determinare se i modelli di regressione logistica, basati sull’interazione tra lo SNP ed i fattori di rischio cardiovascolare, si adattavano in maniera significativamente migliore rispetto ai modelli di regressione logistica limitati o ai singoli SNP o ai soli fattori di rischio. In questo caso, la soglia di significatività è stata corretta attraverso la correzione di Bonferroni per 42 test multipli (7 fattori di rischio x 6 SNP = 42). La significatività statistica risultava per p = 0.05/42 = 0.0012.

Uno score di rischio genetico (GRS) è stato calcolato con i 6 SNP che mostravano un'associazione significativa (p<0.05) con la comparsa precoce di cardiopatia ischemica. Abbiamo ipotizzato che ogni SNP contribuisse in maniera uguale al rischio di insorgenza della patologia e abbiamo calcolato il GRS sommando il numero di alleli di rischio in ogni locus secondo un modello genetico additivo: abbiamo considerato 2 unità se il paziente era omozigote per l'allele ad alto rischio, 1 unità se il paziente era eterozigote e 0 se il paziente era omozigote per l'allele a basso rischio. Lo score genetico è stato analizzato come variabile continua ed è stato anche suddiviso in terzili. Infine, è stata effettuata un’analisi di regressione multivariata, considerando come end-point l’età, al fine di valutare il contributo indipendente di fattori clinici e genetici

(39)

35 sull'età di insorgenza della cardiopatia ischemica tra i pazienti arruolati per lo studio.

(40)

36

4.

Risultati

4.1 Caratteristiche della popolazione di studio

Le caratteristiche cliniche e demografiche della popolazione di studio sono riportate in Tabella 7.

Tabella 7: Caratteristiche cliniche della popolazione di studio CI esordio precoce (n=114) CI esordio tardivo (n=384) p-value Età (anni±DS) 46.2±5.1 60.7±5.9 0.0001 Sesso maschile, n(%) 93 (82) 339 (88) 0.06 Fumo, n(%) 83 (73) 234 (61) 0.02 Diabete, n(%) 8 (7) 57 (15) 0.03 Ipercolesterolemia, n(%) 80 (70) 268 (70) 0.9 Ipertrigliceridemia, n(%) 44 (39) 99 (26) 0.008 Obesità, n(%) 36 (31) 111 (29) 0.6 Ipertensione (%) 41 (36) 183 (48) 0.03

Familiarità per CI, n(%) 70 (61) 200 (52) 0.06

Frazione di eiezione(%) 52.9±7.8 51.2±10.2 0.1 N° di vasi affetti 0.0001 0, n(%) 23 (20) 32 (8) 1, n(%) 47 (41) 139 (36) 2, n(%) 36 (32) 133 (35) 3, n(%) 8 (7) 80 (21)

Non sono state trovate differenze in termini di genere, ipercolesterolemia, obesità, frazione di eiezione e familiarità per cardiopatia ischemica, anche se

(41)

37 una maggiore prevalenza di familiarità per la cardiopatia è presente nei pazienti con cardiopatia ischemica precoce (p<0.06). I fumatori e i pazienti con ipertrigliceridemia erano più frequenti nel gruppo di pazienti con esordio precoce della malattia (p<0.02 e p<0.008, rispettivamente) rispetto al gruppo di pazienti con esordio tardivo. I pazienti con esordio tardivo di cardiopatia ischemica mostravano più frequentemente una storia di diabete e ipertensione (entrambi p<0.03). Anche il numero di arterie coronarie affette era diverso tra i due gruppi, in particolare i pazienti con insorgenza tardiva della malattia mostravano un maggior numero di arterie coronarie occluse (p <0.0001).

4.2 SNP e cardiopatia ischemica ad esordio precoce

La Tabella 8 mostra l’associazione tra i vari SNP e l’esordio di cardiopatia ischemica.

Uno scostamento significativo (p <0.05) dall’atteso equilibrio di Hardy-Weinberg è stato trovato per il polimorfismo -850 C>T del gene TNFα che per questo è stato escluso da ulteriori analisi.

(42)

38

Tabella 8: Associazione tra gli SNP e l’esordio precoce di cardiopatia ischemica SNP CI a esordio precoce (n=114) CI a esordio tardiva (n=384) p-value 1/1 n (%) 1/2 n (%) 2/2 n (%) 1/1 n (%) 1/2 n (%) 2/2 n (%) APOC3 (-482 C>T) 39 (34.2) 57 (50.0) 18 (15.8) 181 (47.1) 170 (44.3) 33 (8.6) 0.02 CETP (Taq1B G>A) 37 (32.5) 65 (57.0) 12 (10.5) 131 (34.1) 184 (48.0) 69 (17.9) 0.1 NOS3 (-786 T>C) 32 (28.1) 60 (52.6) 22 (19.3) 101 (26.3) 202 (52.6) 81 (21.1) 0.9 SELE (G98T) 93 (81.6) 8 (7.0) 13 (11.4) 312 (81.3) 49 (12.7) 23 (6.0) 0.04 MMP3 (1171 5A>6A) 31 (27.2) 48 (42.1) 35 (30.7) 115 (29.9) 197 (51.3) 72 (18.8) 0.02 FGB1 (Ser189Ser) 85 (74.6) 24 (21.1) 5 (4.3) 257 (67.0) 121 (31.5) 6 (1.5) 0.03 MTHFR (C677T) 40 (35.1) 44 (38.6) 30 (26.3) 106 (27.6) 188 (48.9) 90 (23.5) 0.1 IL6 (-572 G>C) 98 (86.0) 14 (12.3) 2 (1.7) 352 (91.7) 32 (8.3) / 0.01 TNFα (-850 C>T)* 82 (71.9) 22 (19.3) 10 (8.8) 255 (66.4) 103 (26.8) 26 (6.8) 0.2 Locus 9p21.3 (C>G) 36 (31.6) 65 (57.0) 13 (11.4) 120 (31.2) 180 (46.9) 84 (21.9) 0.03

Il numero 1 si riferisce all’allele ancestrale (solitamente l’allele più comune) e il numero 2 si riferisce alla variante allelica, 1/1 si riferisce all’omozigote wild type, 1/2 si riferisce all’eterozigote e 2/2 si riferisce all’omozigote variante.

(43)

39 Sei polimorfismi - Apolipoproteina C3 (APOC3, -482 C>T), Fibrinogeno beta (FGB1, Ser189Ser), Interleuchina 6 (IL6, -572 G>C), E-Selectina (SELE, G98T), Metallopeptidasi di matrice 3 (MMP3, 1171 5A>6A) e locus 9p21.3 (C>G) - differivano in maniera significativa tra i pazienti con esordio precoce di malattia e i pazienti con esordio tardivo.

4.3

SNP determinanti per l’esordio precoce di cardiopatia

ischemica

L’analisi univariata ha mostrato che 4 varianti genetiche APOC3 -482 C>T, MMP3 1171 5A>6A, SELE G98T e locus 9p21.3 C>G sono predittori indipendenti di insorgenza precoce della malattia. In particolare, SELE G98T, MMP3 1171 5A>6A e APOC3 -482 C>T sono associati con un aumentato rischio per la cardiopatia ischemica a comparsa precoce con una modalità recessiva di ereditabilità, mentre il polimorfismo C>G del locus 9p21.3 è coerente con una modalità di ereditabilità di tipo dominante.

Tra gli altri fattori di rischio cardiovascolare tradizionali, l’abitudine al fumo e l’ipertrigliceridemia sono risultati predittori indipendenti di comparsa precoce di cardiopatia ischemica, mentre il sesso maschile, il diabete e l'ipertensione sono risultati fortemente associati con la comparsa tardiva della malattia. All'analisi logistica multivariata, le 4 varianti genetiche, così come l’abitudine al fumo e l’ipertrigliceridemia, sono rimaste indipendentemente correlate all’insorgenza precoce di cardiopatia ischemica (Tabella 9).

(44)

40

Tabella 9: Analisi di regressione univariata e multivariata

Analisi Univariata OR (CI%95) p-value Analisi Multivariata OR (CI%95) p-value Sesso Maschile 0.5(0.3-0.8) 0.06 / / Fumo 1.7(1.1-2.7) 0.02 1.7(1.0-2.8) 0.03 Diabete 0.4(0.2-0.9) 0.03 0.4(0.2-1.0) 0.05 Ipercolesterolemia 1.0(0.6-1.6) 0.9 / / Ipertrigliceridemia 1.8(1.2-1.3) 0.05 1.9(1.2-3.1) 0.005 Obesità 1.0(0.7-1.8) 0.6 / / Ipertensione 0.6(0.4-0.9) 0.02 0.6(0.4-1.0) 0.05 APOC3 (GG vs A) 1.8(1.1-2.8) 0.01 1.7(1.1-2.7) 0.02 MMP3 (-/- vs T) 1.9(1.2-3.0) 0.007 1.8(1.1-3) 0.01 FGB1 (C vs TT) 2.9(0.8-9.7) 0.08 / / IL6 (GG vs C) 1.8(0.9-3.4) 0.07 / / SELE (TT vs G) 2.0(1.0-4.1) 0.05 2.0(1.0-4.3) 0.05 Locus 9p21.3 (CvsGG) 2.2(1.15-4.1) 0.01 2.2(1.2-4.2) 0.01

4.4 Interazioni tra SNP e fattori di rischio

Abbiamo anche considerato una possibile interazione tra i 6 SNP che avevano mostrato un'associazione statisticamente significativa con l’esordio precoce di cardiopatia ischemica e i fattori di rischio tradizionali.

La Tabella 10 mostra i p-value dei test del rapporto di verosimiglianza (likelihood ratio test).

(45)

41

Tabella 10: Interazione tra SNP e fattori di rischio noti

* I p-value sono stati calcolati utilizzando il test del rapporto di verosimiglianza a due code (two-sided likelihood ratio test)

Dopo la correzione per test multipli (7 fattori di rischio x 6 SNP = 42), abbiamo valutato la significatività statistica (p = 0.0012). Abbiamo trovato un’interazione significativa tra APOC3 e l’ipertrigliceridemia (pinterazione = 0.0008) e tra il locus 9p21.3 e l’ipertrigliceridemia (pinterazione = 0.0011) e il fumo (pinterazione = 0.0010). In particolare, la presenza simultanea di APOC3 e ipertrigliceridemia porta quasi al raddoppio del rischio rispetto agli individui che presentavano solamente lo SNP o soltanto l’ipertrigliceridemia (ORallele = 1.8, 95% CI 1.1-2.8; ORfattore di rischio = 1.8, 95% CI 1.2-2.3; ORinterazione = 3.5, 95% CI 1.8-6.7). Anche per quanto riguarda il locus 9p21.3, la contemporanea presenza dell’allele di rischio e dell’ipertrigliceridemia raddoppia il rischio di insorgenza precoce di cardiopatia

Gene Fattori di rischio

noti, p* APOC3 MMP3 FGB1 IL6 SELE

Locus 9p21.3 Sesso Maschile 0.01 0.0061 0.07 0.04 0.02 0.006 Fumo 0.0035 0.0022 0.017 0.01 0.01 0.0010 Diabete 0.0038 0.0021 0.018 0.023 0.012 0.003 Ipercolesterolemia 0.0041 0.03 0.02 0.2 0.1 0.025 Ipertrigliceridemia 0.0008 0.0090 0.01 0.0061 0.066 0.0011 Obesità 0.037 0.0025 0.2 0.6 0.15 0.0020 Ipertensione 0.0042 0.0028 0.02 0.02 0.02 0.0022

(46)

42 ischemica (ORallele = 2.2, 95% CI 1.15-4.1; ORfattore di rischio = 1.8, 95% CI 1.2-2.3;

ORinterazione = 4.0, 95% CI 1.7-9.0), mentre la presenza contemporanea dello

SNP e del fumo porta ad un incremento di 1.5 volte il rischio di esordio precoce di patologia ischemica (ORallele = 2.2, 95% CI = 1.2-4.1; ORfattore di rischio = 1.7,

95% CI = 1.1-2.7; ORinterazione = 3.0, 95% CI = 1.0-8.7) (Tab.11).

Tabella 11: Interazione tra SNP e fattori di rischio

Variabili Odds Ratio

(OR) CI 95% p-value APOC3 1.8 1.1-2.8 0.01 Ipertrigliceridemia 1.8 1.1-2.3 0.05 APOC3*Ipertrigliceridemia 3.5 1.8-6.7 0.0008 Locus 9p21.3 2.2 1.15-4.1 0.01 Ipertrigliceridemia 1.8 1.1-2.3 0.05 Locus 9p21.3*Ipertrigliceridemia 4.0 1.7-9.0 0.0011 Fumo 1.7 1.1-2.7 0.02 Locus 9p21.3*Fumo 3.0 1.0-8.7 0.0010

4.5 Effetto combinato degli SNP: score di rischio genetico

È stato valutato l’effetto combinato dei 6 SNP che mostravano una distribuzione genotipica diversa nella popolazione con esordio precoce di malattia ischemica e con esordio tardivo, calcolando uno score di rischio genetico (GRS) che rappresenta la somma degli alleli ad alto rischio. Il GRS risultante era significativamente associato con l'insorgenza precoce della cardiopatia

(47)

43 ischemica, con ogni allele associato ad un aumentato rischio di 1.3 volte (95% CI 1.1-1.6, p = 0.001).

Dividendo gli alleli di rischio in terzili (I terzile → alleli di rischio ≤ 2; II terzile → alleli di rischio=3 e 4; III terzile → alleli di rischio ≥ 5 ), i pazienti appartenenti al terzile più alto (III terzile) dello score di rischio genetico avevano un rischio di 3.2 volte (95% CI 1.5-6.8, p = 0.001) maggiore di presentare cardiopatia ischemica precoce rispetto a quelli presenti nel I terzile. I pazienti nel II terzile mostravano un rischio di 2.4 volte (95% CI 1.2-4.9, p = 0.01) maggiore di presentare cardiopatia ischemica ad esordio precoce rispetto a quelli nel I terzile (Fig.5) .

O

dds

R

at

io

C

or

re

tt

o,

9

5%

C

I

0

1

2

3

4

5

6

7

8

I

II

III

Terzili dello Score Genetico

(≤2 alleli di rischio) (3-4 alleli di rischio) (≥5 alleli di rischio)

(48)

44 Coerentemente, l'analisi di regressione multivariata dimostrava una graduale diminuzione dell'età di insorgenza della patologia nel paziente con l'aumentare del numero di alleli ad alto rischio (Fig.6). Infatti, l'età media al momento della comparsa della prima manifestazione della cardiopatia ischemica era 59.2 ± 0.9 anni nei pazienti portatori di un numero di varianti alleliche uguale o inferiore a 3 e 53.5 ± 1.7 anni nei pazienti con un numero di varianti alleliche maggiore di 9 (p < 0.0001).

p<0.0001

Numeri di alleli ad alto rischio

Et

à

(anni

)

50

52

54

56

58

60

≤3

4

5

6

7

8

≥9

(49)

45

5.

Discussione

Questo studio effettuato su una coorte di pazienti italiani con diagnosi documentata di cardiopatia ischemica ha mostrato che quattro varianti genetiche comuni nei geni APOC3 (-482 C>T), MMP3 (1171 5A>6A), SELE (G98T) e nel locus 9p21.3 (C>G) erano determinanti indipendenti del rischio di esordio precoce di eventi cardiaci ischemici. Tramite un “score genetico multilocus” è stato inoltre osservato un effetto combinato di 6 varianti polimorfiche (APOC3 -482 C>T, FGB1 Ser189Ser, IL6 -572 G>C, SELE G98T, MMP3 1171 5A>6A e locus 9p21.3 C>G) nell’aumentare il rischio di insorgenza di malattia.

Vari studi hanno dimostrato un ruolo chiave della genetica nella cardiopatia ischemica e, in particolare, nella sua manifestazione precoce (Hauser et al., 2003). Studi effettuati su modelli animali transgenici hanno rivelato la presenza di oltre 100 geni che possono influenzare lo sviluppo di lesioni aterosclerotiche coronariche (Lusis et al., 2004a). Questi studi hanno rivelato informazioni su pathway che contribuiscono alla suscettibilità genetica all’aterosclerosi, in particolare in relazione all’ossidazione lipidica (Liao et al., 1994) e all’infiammazione (Shi et al., 2000; Mehrabian et al., 2002). Vari studi clinici hanno mostrato la presenza di varianti genetiche comuni che contribuiscono ad aumentare la suscettibilità alla malattia delle arterie coronariche (Lusis et al., 2004b).

Negli ultimi anni gli studi di associazione genome-wide (GWA) hanno evidenziato un’associazione tra SNP e malattia coronarica (Burton et al, 2007; Chanock et al, 2007; Samani et al., 2007; Kathiresan et al., 2009; Erdmann et

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