Analisi spettrofotometrica per la determinazione del contenuto di classi di composti

Sono molto diffusi metodi spettrofotometrici mirati alla determinazione del contenuto totale di specifiche classi di composti. Il metodo Folin-Ciocalteau è mirato alla determinazione del contenuto di specie fenoliche totali in soluzione, ed è basato sulla reazione redox in soluzione basica tra i fenoli presenti nella matrice (riducenti) e ioni polimerici ossigenati di tungsteno e molibdeno (ossidanti, reattivo di Folin-Ciocalteau) [88]. I prodotti di riduzione sono intensamente colorati in blu, e l’assorbanza a 760 nm è correlata alla quantità di tali specie formata nella reazione redox. Per poter determinare quantitativamente i fenoli totali in campioni reali, è necessario tarare il metodo con una specie fenolica standard opportuna. La quantità di specie ridotte, e quindi l’assorbanza misurata a 760 nm, può essere allora associata alla quantità nota di quella specie standard, e i fenoli totali sono determinati “come equivalenti di specie standard”. Il metodo può essere usato nell’intervallo in cui la taratura risulta lineare. Per l’applicazione del metodo alla propoli, sono stati proposti come standard l’acido gallico [5, 39] e una miscela bilanciata di galangina-pinocembrina 1:2 [38]. La quantità di fenoli determinata con il descritto metodo spettrofotometrico tende ad essere più bassa di quella determinabile per HPLC, tra l’85 ed 95 % circa, e non sembrano esserci significative differenze nella scelta degli standard di riferimento proposti [5, 38, 39].

Il metodo per la determinazione di flavoni e flavonoli totali (Figura S1) è basato sulla complessazione della funzione carbonilica e della funzione ossidrilica sul carbonio 5 con AlCl3. I

complessi che si formano hanno una colorazione caratteristica che ha il suo massimo di assorbimento UV-VIS a 425 nm [38]. Per poter determinare quantitativamente i flavoni ed i flavonoli totali in campioni reali, è necessario tarare il metodo con una specie standard opportuna. L’assorbanza misurata a 425 nm è associata alla quantità di complesso formatosi da quantità note di quella specie standard, e i flavoni e flavonoli totali sono quindi determinati “come equivalenti di

specie standard”. Il metodo può essere usato nell’intervallo in cui la taratura risulta lineare. In alcuni lavori, la quantità determinata spettrofotometricamente è davvero inferiore a quella attesa, fino a 80-90 % in meno [5, 68], e non sembra che dipenda dalla specie scelta per la taratura, dato che sono stati usati quercetina [68], galangina e rutina [5], senza che il risultato cambiasse. Questa forte discrepanza di valori dovrebbe dipendere dal fatto che in quei lavori si sia riferito il test a tutti i flavonoidi. E’ invece più corretto notare che il test deve essere riferito ai soli flavoni e flavonoli, perché i complessi di AlCl3 con i flavonoli e diidroflavonoli assorbono nel range 310-320 nm,

quindi molto lontano dalla lunghezza d’onda usata nella misura [38]. Con questa ipotesi, la quantità determinata di flavoni e flavonoli è 102-109 % di quella attesa [38].

Un metodo mirato alla determinazione di flavanoni e diidroflavonoli totali (figura S1) è basato sulla formazione in soluzione acida dei prodotti di addizione con 2,4 dinitrofenil idrazina (2,4 dinitrofenil idrazoni). Gli idrazoni che si formano sono misurabili spettrofotometricamente in soluzione basica a 486 nm [37]. Per poter determinare quantitativamente i flavanoni e diidroflavonoli totali in campioni reali, è necessario tarare il metodo con una specie standard opportuna. L’assorbanza misurata a 486 nm è associata alla quantità di addotto che si forma per reazione con una quantità nota di quella specie standard, e i flavanoni e diidroflavonoli totali sono quindi determinati “come equivalenti di specie standard”. Il metodo può essere usato nell’intervallo in cui la taratura risulta lineare. Per la taratura del metodo è stato proposto l’uso di pinocembrina, il diidroflavonolo più diffuso nella propoli di pioppo [37, 38]. Il metodo è stato testato con una miscela di standard che simula la propoli, ed il recupero è molto buono, dell’ordine di 90-113 % della quantità attesa, ed ottimi sono anche i risultati sui campioni reali, che sono stati analizzati per confronto anche per HPLC [38].

Una valutazione importante che emerge dall’analisi per gruppi funzionali è la correlazione tra il contenuto di fenoli totali e di flavonoidi totali. Il paragone tra i valori determinati mediante HPLC su campioni di propoli uruguayane e cinesi mostra che la quantità di flavonoidi è leggermente inferiore, ma molto prossima, a quella dei fenoli totali [5]; lo stesso si riscontra su alcuni campioni di propoli europea, dove i dati ottenuti da misure HPLC da una parte e spettrofotometriche dall’altro sono molto simili [38]. Questi risultati sembrerebbero indicare che, almeno nelle propoli di origine temperata, i flavonoidi siano la frazione preponderante dei fenoli. E’ interessante notare che, dove il valore misurato spettrofotometricamente con il test di complessazione con AlCl3 è associato al

contenuto di flavonoidi totali, esso risulta invece significativamente e sistematicamente più basso del valore dei fenoli totali [43-46, 49].

Metodi spettrofotometrici veloci sono stati messi a punto anche per misurare la capacità antiossidante e di ripulire i radicali liberi di campioni di propoli. Per quanto riguarda la capacità antiossidante, un metodo è basato sulla riduzione del Fe (III) in tampone acetico a seguito della aggiunta del campione di propoli (saggio FRAP). Il Fe (II) che si forma viene quindi complessato con un chelante, il TPTZ (Figura S14) che è intensamente colorato in blu e può essere determinato spettrofotometricamente sul massimo di assorbimento, che cade a 593 nm [88]. Il metodo è stato originariamente messo a punto per misurare la capacità antiossidante del plasma [89], ma è stato utilizzato anche per la propoli [86]. Altri autori usano invece un metodo basato sulla misura della velocità di ossidazione in emulsione acquosa del β-carotene da parte dell’acido linoleico [43, 44, 88]. A seguito dell’ossidazione, l’assorbanza dell’emulsione a 470 nm, dovuta alla presenza del β- carotene (ε450 =137000 M-1 cm-1) diminuisce. La velocità di scomparsa del β-carotene viene

determinata misurando l’assorbanza della soluzione all’inizio (a) e dopo sessanta minuti (b), ed è espressa come DR =[(log(a/b)]/60: DRC è la velocità di ossidazione nel bianco e DRS la velocità di

ossidazione nel campione sotto osservazione. Il potere antiossidante è espresso come 100*(DRC -

DRS)/ DRC. Il potere antiossidante di propoli di pioppo misurato con questo metodo è variabile tra il

10 ed il 60 %. Il valore del potere antiossidante è correlabile con quello del contenuto di fenoli totali (R2 =0,472) [43]. Un metodo per misurare la capacità di ripulire dai radicali liberi usa il radicale DPPH. (vedi Figura S14), che è molto stabile, ma può reagire con una specie riducente per formare l’idrazina corrispondente. Il radicale è colorato in violetto ed ha un massimo di assorbimento UV- VIS a 517 nm, mentre l’idrazina è gialla, e ha un assorbanza vicino a zero alla stessa lunghezza d’onda. Nel test, si miscelano la soluzione etanolica del radicale con il campione. Dopo mezz’ora, si registra l’assorbanza a 517 nm, e la capacità della soluzione di raccogliere i radicali è espressa come percentuale di assorbanza rispetto alla soluzione di controllo. Anche questa grandezza è correlata con la quantità di fenoli totali in soluzione (R2 =0,806) [43]. In un altro metodo, il radicale catione ABTS+. (Figura S14), fortemente colorato in blu, è generato in soluzione per l’azione di un forte ossidante dalla molecola neutra [88]. L’interazione con una specie riducente causa la scomparsa del radicale catione, e la formazione di ABTS 2-, che è non colorato nel VIS. Il potere di raccogliere radicali è espresso come equivalenti di Trolox, che è la specie usata per tracciare la retta di taratura: per questo il metodo è chiamato “Trolox equivalent antioxidant capacity” (TEAC). Questo metodo fornisce risultati che non sempre sono correlabili con quelli ottenuti con il metodo basato sul DPPH [44].

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Figura S14. Strutture di interesse per i saggi di potere antiossidante e raccolta di radicali (1)

riduzione del complesso Fe(III)-TPTZ a Fe(II)-TPTZ (2) struttura del radicale DPPH. (3) riduzione