Determinazione di acidi organici, CAPE e flavonoidi

Un volume noto di EEP era diluito in H2O/ACN 4:1 (fase acquosa acidificata con acido

formico 0,1 %), in modo da raggiungere una concentrazione finale di circa 60 ppm (loop da 2 µL, per un totale di circa 120 ng iniettati). Le analisi HPLC erano eseguite con la metodica G2 (vedi Tabella M12), rivelando ciascun campione a quattro le lunghezze d’onda: 320, 293, 275 e 250 nm.

L’assegnazione dei picchi è stata preliminarmente condotta mediante coiniezione con soluzioni standard. Le assegnazioni sono state quindi verificate mediante determinazione dei valori di rapporti di intensità di segnale a diverse lunghezze d’onda. Tali valori sono stati confrontati con rapporti di riferimento, misurati con lo stesso gradiente con le soluzioni di

standard di interesse. Tutti i valori dei rapporti di intensità misurati sui campioni reali sono

stati divisi per il valore determinato sugli standard prima dell’elaborazione statistica, in modo che il valore atteso fosse per tutti pari ad uno. I dettagli di queste elaborazioni sono riportati in Appendice 4.

L’analisi quantitativa è stata eseguita con rette di taratura tracciate su quattro punti con soluzioni di standard puri nell’intervallo di concentrazione di interesse. Le determinazioni quantitative degli acidi cinnamici sono state eseguite usando il segnale cromatografico registrato a 320 nm, quelle dei flavonoidi con il segnale registrato a 250 nm. I parametri significativi per l’analisi quantitativa sono riportati in tabella M13.

(a) LOD (pg) LOQ (pg)

Acido caffeico 10 30 Acido p-cumarico 2 7 Acido ferulico 3 10 Quercetina 7 24 Apigenina 8 28 Kaempferolo 5 17 Crisina 3 10 (b) Intervallo calibrazione (ng) Sensibilità (µV*s)/ pg Sensibilitàrelativa R Acido caffeico 0,1-3,7 43 1 0,99838 Acido p-cumarico 0,1-4,0 195 4,53 0,99998 Acido ferulico 0,1-4,3 130 3,02 0,99473 Quercetina 0,11-0,44 37,5 0,872 0,99992 Apigenina 0,12-0,48 32 0,744 0,99999 Kaempferolo 0,14-0,54 35 0,814 0,99979 Crisina 0,2-10 65 1,51 0,99974

Tabella M13. Parametri caratteristici del metodo HPLC per la quantificazione di acidi cinnamici e flavonoidi

con il metodo cromatografico G2 (Tabella M12): (a) limiti di rivelabilità (LOD) e di quantificazione (LOQ) espressi come pg iniettati (loop da 2 µL); (b) parametri delle rette di taratura, l’intervallo di calibrazione è

espresso in ng iniettati, la sensibilità è espressa come segnale cromatografico (area) in µV*s per massa iniettata

in pg, la sensibilità relativa è espressa rispetto a quella dell’acido caffeico posta pari a 1. Acidi cinnamici quantificati con il segnale registrato a 320 nm, flavonoidi con il segnale registrato a 250 nm

6.6.2.2 Determinazione di esteri cinnamici e salicilici

6.6.2.2.1 Estrazione con esano

In un imbuto separatore da 250 mL, si misuravano 90 mL di una soluzione 17 mM di acido cloridrico, quindi 15 mL di EEP a 5000 ppm, o di etanolo per la determinazione del bianco.

Alla miscela si aggiungeva quindi un volume noto di una soluzione etanolica a titolo noto di HSAL ed HCINN (10,0 e 19,8 µg rispettivamente, figure M1 ed M16). Si estraeva la risultante sospensione con tre porzioni distinte di 30 mL di esano, e si riunivano gli estratti che si filtravano su solfato di sodio anidro. La soluzione esanica era concentrata, trasferita in matraccio da 25 mL, portata a volume sempre con esano e conservata a temperatura ambiente e al buio.

La resa ponderale di questa estrazione è stata determinata seccando un volume noto degli estratti esanici in un pallone tarato, e pesando il residuo secco. Gli spettri UV-VIS sono stati determinati in EtOH per diluizione di una quantità nota della soluzione esanica nell’intervallo spettrale 230-400 nm, in modo da avere un’assorbanza sul massimo pari a circa 0,5 (300-700 µL di estratti esanici). Gli spettri sono stati riportati in assorbanza per unità di concentrazione (ppm-1 _cm-1_{), valutando la concentrazione rispetto alla massa effettivamente estratta in esano.}

O O

OH

Figura M16 Struttura dell’esil salicilato

6.6.2.2.2 Analisi GC-MS

5 mL della soluzione esanica ottenuta per estrazione della sospensione di propoli in HCl (Parte sper., 6.6.2.2.1) erano concentrati al rotavapor in presenza di 500 µL di n-ottano. Quando tutto l’esano era stato allontanato, la soluzione veniva trasferita in una vial tarata con tappo di silicone da 1,5 mL, aiutandosi con n-ottano. Il volume finale della soluzione in n- ottano era determinato per pesata.

Gli standard per la determinazione delle rette di taratura erano preparate nell’intervallo opportuno per diluizione in n-ottano delle soluzioni esaniche standard di BSAL, BCINN, HSAL ed HCINN.

L’autocampionatore era preparato caricando sia le soluzioni incognite sia quattro soluzioni n- ottaniche degli standard di interesse nell’intervallo di concentrazioni previsto. La sequenza di iniezione prevedeva di iniettare per primi i quattro standard, quindi i campioni alternati con una delle soluzioni standard a concentrazione intermedia. L’iniezione degli standard tra i campioni ha permesso di verificare la stabilità del segnale per tutto il corso del ciclo analitico. Alla fine dell’analisi, venivano nuovamente iniettate tutte e quattro le soluzioni standard. L’analisi era condotta su di 1 µL di soluzione, che era iniettato in modalità splitless, con temperatura dell’iniettore 280 °C. Il programma di eluizione era il seguente:

- 120 °C, 2 min; - 200 °C, 5 °C/min; - 200 °C, 5 min; - 280 °C, 10 °C/min; - 280 °C, 1 min; - 300 °C, 20 °C/min; - 300 °C, 20 min.

La ionizzazione è stata condotta per impatto elettronico a 70 eV. Sono state eseguite analisi sia in modalità TIC sia in modalità SIM. Le analisi in TIC sono state condotte per l’identificazione spettrale delle specie.

m/z+ _{1 m/z}+ _{2 m/z}+ _{3 t} rit (min) HSAL 120 138 222 18,42 BSAL 65 91 228 23,97 HCINN 131 148 232 24,31 BCINN 91 131 192 28,68

Tabella M14. Ioni usati per la determinazione quantitativa degli esteri BSAL, BCINN, HSAL, HCINN e loro

tempo di ritenzione con il metodo descritto

L’analisi qualitativa in modalità TIC è stata condotta mediante confronto dello spettro di massa con quelli disponibili nella libreria elettronica dello strumento [92]. Dall’analisi degli standard, sono stati scelti tre frammenti per ciascun estere per la successiva analisi SIM (vedi

Tabella M14). Tali frammenti sono stati scelti tra quelli più intensi, scartando gli ioni più diffusi e quindi poco caratteristici (Appendice 2).

I picchi degli esteri di interesse nei campioni reali di propoli in modalità SIM sono quindi stati assegnati mediante confronto dei tempi di ritenzione con quelli registrati per gli standard puri, nonché dalla valutazione dei rapporti di intensità dei tre frammenti scelti per l’analisi, confrontati con quelli registrati per gli standard puri. Quest’ultima valutazione aveva un margine di tolleranza di ± 20 %.

(a) LOD (pg) LOQ (pg)

BSAL 17 57 BCINN 17 57 HSAL 16 54 HCINN 20 70 (b) Intervallo calibrazione (ng) Sensibilità S/ pg Sensibilitàrelativa R RSD BSAL 1- 8 1,711 1 0,9980 0,8 BCINN 2- 19 1,781 1,04 0,9932 0,4 HSAL 1- 6 1,835 1,07 0,9930 0,6 HCINN 1- 6 1,434 0,838 0,9927 0,7

Tabella M15. Parametri caratteristici del metodo GC/MS per la quantificazione di esteri cinnamici e salicilici: (a) limiti di rivelabilità (LOD) e di quantificazione (LOQ) espressi come pg iniettati (1 µL iniettato in modalità

splitless); (b) parametri delle rette di taratura, l’intervallo di calibrazione è espresso in ng iniettati, la sensibilità è espressa come segnale cromatografico (area) per massa iniettata in pg, la sensibilità relativa è

espressa rispetto a quella del BSAL posta pari a 1.

L’analisi quantitativa è stata condotta mediante tracciatura con standard puri su quattro punti, sempre in condizioni SIM uguali a quelle usate per l’analisi dei campioni reali. La RSD nella determinazione del segnale dei quattro esteri nelle condizioni di analisi è stata determinata iniettando per sette volte una soluzione circa 5 ppm in ciascun estere. I valori di interesse per l’analisi quantitativa sono riportati in Tabella M15.

6.6.2.2.3 Analisi HPLC

5 mL degli estratti esanici (Parte sper., 6.6.2.2.1) erano concentrati sino ad arrivare ad un volume di 500 µL circa. Si preconcentrava in testa ad una colonnina SPE in gel di silice, e si trattava con 7 mL di eluente, raccogliendo in un pallone da 10 mL. Si aggiungevano 250 µL di H2O/ACN 2:3 (fase acquosa acidificata con acido acetico 1 %), quindi si allontanava

l’esano con il rotavapor. Le analisi HPLC erano eseguite con la metodica I3 (Tabella M12). Per i parametri caratteristici del metodo, vedi tabella M16.

(a) LOD (pg) LOQ (pg)

BSAL 350 1200 BCINN 80 270 FESAL 2200 7000 FECINN 480 1600 (b) Intervallo calibrazione (ng) Sensibilità (µV*s)/ pg Sensibilitàrelativa R BSAL 20-500 0,765 1 0,99980 BCINN 10-200 3,37 4,41 0,99995 FESAL 20-500 0,77 1,01 0,99997 FECINN 10-200 3,01 3,93 0,99999

Tabella M16. Parametri caratteristici del metodo HPLC per la quantificazione di esteri cinnamici e salicilici: (a) limiti di rivelabilità (LOD) e di quantificazione (LOQ) espressi come pg iniettati (loop da 20 µL); (b)

parametri delle rette di taratura, l’intervallo di calibrazione è espresso in ng iniettati, la sensibilità è espressa come segnale cromatografico (area) in µV*s per massa iniettata in pg, la sensibilità relativa è espressa rispetto

a quella del BSAL posta pari a 1